伊犁部分牛边缘无浆体与牛巴贝斯虫混合感染

AsianCasRportsinVtrinaryMdicin亚洲兽医病例研究,2016,5(1),14PublishdOnlinJanuary2016inHanshttp:wwwhanspuborgjournalacrpmhttp:dxdoiorg1012677acrpm201651001文章引用:孟元,伊春阳,吴敏,明·乌尔娜,张杨,巴音查汗伊犁部分牛边缘无浆体与牛巴贝斯虫混合感染情况[J]亚洲兽医病例研究,2016,5(1):14http:dxdoiorg1012677acrpm201651001ThRportofAnaplasmamarginalandBabsiaboisMixdInfctioninCattlinPartofAraYiliYuanMng1,ChunyangYi2,MinWu1,WurnaMing2,YangZhang2,BaYinchahan21CollgofLifScincs,ZhjiangUnirsity,HangzhouZhjiang2CollgofVtrinaryMdicin,XinjiangAgriculturalUnirsity,UrumqiXinjiangRcid:No2nd,2015;accptd:No28th,2015;publishd:Dc2nd,2015Copyright©2016byauthorsandHansPublishrsIncThisworkislicnsdundrthCratiCommonsAttributionIntrnationalLicns(CCBY)http:craticommonsorglicnssby40AbstractToxplorthsituationofAnaplasmamarginalandBabsiaboismixdinfctioninpartofaraYili,Xinjiang,thisxprimntcollctdsuspctdboinbloodinXinyuanandTkscountyofYilianddsigndandsynthsizdprimrbasdon16SrRNAgnconsrdsqunc,DNAxtractionforPCRdtctionRsultsshowdthat:Anaplasmamarginalinfctionratwas20%(40200)andBabsiaboisinfctionratwas40%(80200);mixdinfctionratwas30%(60200)incattlinXinyuancounty;Anaplasmamarginalinfctionratwas30%(120400)andBabsiaboisinfctionratwas40%(160400),andmixdinfctionratwasashighas45%(180400)inTkscountyThsrsultsproidthdatabasforAnaplasmosisandBabsiosisprntionincattlXnjiangKywordsYili,Anaplasmamarginal,Babsiabois,InfctionRat伊犁部分牛边缘无浆体与牛巴贝斯虫混合感染情况报告孟元1，伊春阳2，吴敏1，明·乌尔娜2，张杨2，巴音查汗2通讯作者孟元等21浙江大学生科院，浙江杭州2新疆农业大学动物医学学院，新疆乌鲁木齐收稿日期：2015年11月2日；录用日期：2015年11月28日；发布日期：2015年12月2日摘要为探究新疆伊犁部分地区牛边缘无浆体与牛巴贝斯虫病的感染情况本试验通过采集伊犁新源和特克斯县疑似牛全血，并根据16SrRNA基因保守序列，设计并合成引物，提取病原DNA，进行PCR检测结果显示，新源县牛边缘无浆体的感染率为20%(40200)而牛巴贝斯虫的感染率为40%(80200)，其混合感染率为30%(60200)；特克斯县牛边缘无浆体的感染率为30%(120400)而牛巴贝斯虫的感染率为40%(160400)，混合感染率高达45%(180400)为我区牛边缘无浆体与牛巴贝斯虫病的防治提供数据基础关键词伊犁，边缘无浆体，巴贝斯虫，感染率1引言边缘无浆体病是由边缘无浆体(Anaplasmamarginal)寄生于牛红细胞边缘，经蜱传播而引起以发热、贫血、黄疽、食欲不振、消瘦等为主要症状的一种传染性无浆体病[1][4]巴贝斯虫病是由牛巴贝斯虫(Babsiabois)寄生于牛红细胞胞浆内，经蜱传播的血液原虫病，该病与牛边缘无浆体病相似，亦可引起黄疽、发热等症状这两种病原均寄生于牛类动的红细胞往往导致混合感染，其病原血液涂片检查诊断时不易区分，会造成漏检或者误检因此，经鉴别诊断来调查了解这两种病的感染情况是对新疆牛类动物蜱传病的综合防治具有重大意义2试验与方法21血液样品来源分别从伊犁新源县及特克斯县采集疑似牛耳尖或尾根部血液200份及400样品，先制血膜片后，分别加入到含有抗凝剂EDTA溶液的抗凝管(用于核酸提取)中，−20℃保存待检22血液涂片染色及镜检用了改良血液涂片法，即姬姆萨和瑞氏复合染料染法进行染色复合染料I的制备：取瑞氏粉2g，姬姆萨尔色素17g，置研钵中，加50ml甘油研磨调成均匀糊状后缓慢加入少量甲醇，研磨片刻将上层液体移入棕色试剂瓶内，再加少量甲醇，继续研磨，再吸出上层染液，如此连续几次，共用甲醇1000ml复合染料Ⅱ的制备：取磷酸二氢钾(无水)03g，磷酸氢二钠(无水)023g置于烧杯中，加入少量蒸馏水溶解，用磷酸盐缓冲液调PH至(6568)后加水至1000ml复合染料染法的步骤：将制作好的血液涂片放入甲醇中固定510min，自然晾干；将其放入复合染料I中15min，取出；迅速侵入复合染料II中12min，取出；将其冲洗(血涂片区域以外没有染料残留)，自然晾干；在显微镜下(10×100的油镜)进行观察孟元等3Tabl1AnaplasmamarginalandBabsiaboisincattlmixdinfctioninXinyuanandTkscounty,Yili1伊犁新源县特克斯县牛边缘无浆体与牛巴贝斯虫混合感染情况采样地区Bbois阳性率Amarginal阳性率混合感染率新源县40%(80200)20%(40200)30%(60200)特克斯县30%(120400)40%(160400)45%(180400)23血样核酸提取及PCR检测采用全血、组织DNA提取试剂盒说明书的方法提取DNA首先根据GnBank中牛边缘无浆体和牛梨形虫的16SrRNA基因保守序列，设计引物以提取的蜱虫基因组DNA为，进行目的片段的扩增血样核酸的提取：1)离心管内加入吸200µL全血、20µL蛋白酶K和200µLBuffrAL，振荡混匀15s，56℃孵育10min加入200µL无水乙醇，振荡混匀2)将QIAampspincolumn和collctiontub组合，上一步骤中制备的液体移入QIAampspincolumn中，6000g离心1min，小心弃去滤液3)将QIAampspincolumn与新的collctiontub组合，加500μLBuffrAW1，6000g离心1min，小心弃去滤液4)将QIAampspincolumn与新的collctiontub组合，加500μLBuffrAW2，18,000g离心3min，小心弃去滤液12,000g离心1min去除残留溶液5)将QIAampspincolumn与新的15mL离心管组合，小心加200μLBuffrAE于膜中央，室温放置1min，6000g离心1min洗脱DNA反应体系为25µL，2×EsTaqMastrMix体积为125µL；上、下游引物各1µL；DNA模板15µL；灭菌去离子水加85µL然后运用建立好的PCR方法来检测样品，PCR反应参数：95℃预变性5min；94℃变性30s，退火时间为1min，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min，4℃保存；设计阳性对照(牛巴贝斯虫DNA和牛边虫DNA)、阴性对照(健康牛全血DNA)和空白对照(无菌双蒸水)3实验结果对来自伊犁新源县的200样品及特克斯县的400样品进行了检测和鉴别诊断结果显示：新源县牛边缘无浆体的感染率是20%(40200)而牛巴贝斯虫的感染率是40%(80200)，其混合感染率是达30%(60200)；特克斯县牛边缘无浆体的感染率是30%(120400)而牛巴贝斯虫的感染率是40%(160400)，混合感染率是达45%(180400)，详见表14讨论本次试验结果表明牛边缘无浆体病和牛巴贝斯虫病在新疆存在混合感染的情况，牛边缘无浆体在特克斯县感染强度较高，而牛巴贝斯虫病在新源县较高，其它疫区需要进一步调查研究目前，周作勇等[5]从分子水平上证实了重庆市牛无浆体的存在；我区对于牛无浆体的流行病学资料稀少，相关报道甚少但新疆媒介蜱虫数量多，每年有80%的草食家畜被蜱虫叮咬，故牛边缘无浆体和巴贝斯虫的感染呈上升趋势，应该加强这方面的检测监控及尽防治对策基金项目自治区科技支疆项目计划(项目编号：2013911061)资助孟元等4参考文献(Rfrncs)[1]杜凯边缘无浆体病分子诊断ELISA和温氏附红细胞体PCR检测方法的建立[D]:[硕士学位论文]武汉:华中农业大学,2007[2]党志胜,蒋锡仕,黄孝纷我国牛羊边虫及边虫病的研究现状[J]青海畜牧兽医杂志,2003,4(33):3941[3]吴鉴三牛边缘无浆体病的研究进展[J]动物检疫,1992,2(9):2325[4]倪宏波,姜海芳牛无浆体病的研究进展[J]黑龙江畜牧兽医期(科技版),2010(9):4243[5]周作勇,聂奎,唐成,等牛无浆体16SrRNA基因的克隆测序及分析[J]畜牧兽医学报,2010,41(10):13591363 ThRportofAnaplasmamarginalandBabsiaboisMixdInfctioninCattlinPartofAraYili Abstract Kywords 伊犁部分牛边缘无浆体与牛巴贝斯虫混合感染情况报告 摘要 关键词 1引言 2试验材料与方法 21血液样品来源 22血液涂片染色及镜检 23血样核酸提取及PCR检测 3实验结果 4讨论 基金项目 参考文献(Rfrncs)