紫外辐射对栉孔扇贝精子遗传失活及形态结构的影响-海洋水

紫外辐射对栉孔扇贝精子遗传失活及形态结构的影响-海洋水 紫外辐射对栉孔扇贝精子遗传失活及形态结构的影响- 海洋水 维普资讯 ////0>. . . . 海 洋 水 产 研 究 第 卷 第 期 .,年月 文章编号:? ? ?紫外辐射对栉孔扇贝精子遗传失活及形态结构的影响 赵 峰, 杨爱国 刘志鸿 周丽青 杜方勇 , 王清印中国水产科学研究院黄海水产研究所,青岛 上海水产大学生命科学与技术学院,摘要 报道了紫外辐射对栉孔扇贝精子遗传失活及形态结构的影响。采用光照强度为/的紫外线辐射 ~ 的栉孔扇贝精子,与正常的卵子受精可以得到雌核发育的单倍体胚 胎。随着辐射时间的增加,受精率明显下降,且受精卵极少发育到 形幼虫。扫描电镜观察发现,辐 射后部分精子的顶体膜破裂,顶体丝伸出,辐射时间越长顶体受到的破坏越严重,证明紫外辐射可以 诱导精子的顶体反应;精子的鞭毛在紫外辐射过程中也会受到破坏,随着辐射时间的增加鞭毛脱落的 比例也逐渐增加。推测紫外辐射导致精子结构的破坏是受精率下降的原因之一。 关键词 栉孔扇贝 紫外辐射 雌核发育 精子形态 中图分类号: .. ; 文献识别码: 一? ? ? ? 一 ? ,, . 如 , .? /,. ,? . ?, 锄 ,. ? ?,. ? . . , ,?. ? . 国家“”项目 、国家重大基础研究规划课 、 “十五”攻关 共同资助 通讯作者。 ? : . . .收稿日期: ? . ;接受日期: ? ? 维普资讯 ////. 第 期 赵 峰等:紫外辐射对栉孔扇贝精子遗传失活及形态结构的影响人工诱导雌核发育是指通过运用物理或化学方法使精子遗传失活,用遗 传失活的精子激活卵子的发育,然后通过阻止极体排放或卵裂使染色体加倍,培育具有存活能力的雌核发育二 倍体的技术。由于雌核发育是单性遗传,,从而可以迅速地建立纯系。开展栉孔扇贝人工诱 导雌核发育的研究,对于快速建立纯系并通过纯系间杂交选育个体大、生长快和抗逆性强的优良品种,以及开 展栉孔扇贝遗传学的研究都具有重要意义。 人工诱导雌核发育技术已经在多种鱼类中取得成功 楼允东,并且被用于性别控制 口 .、基因一着丝粒作口 . 、自交系的建立吴清江等 、单性繁殖以及克隆 口 . 等许多方面的研究。然而,贝类雌核发育的研究还处于起步阶段。据报道,人工雌核发育二倍体仅在 皱纹盘鲍 . 、长牡蛎 . 、地中海贻贝 口 . 、紫贻贝 . 等少数几种 贝类 中取得成功。然而,象鱼类那样完善的诱导体系还没有建立起来,至今还没有关于贝类人工雌核发育二倍体成 体培育成活的报道。 本文选择具较高经济价值的栉孔扇贝作为研究对象,初步研究了紫外辐射诱导栉孔扇贝精子遗传失活的 适宜条件,同时对紫外辐射后精子形态结构的变化作了扫描电镜观察。研究结果可为人工诱导栉孔扇贝雌核 发育研究提供理论依据和技术参考。 材料与方法 . 材料 实验所用栉孔扇贝 亲贝于年 月 日取自长岛海区,壳高 ~ 。流式细胞仪 为 公司产品。 . 紫外辐射体系 采用上海星星电器有限公司生产的高硼紫外灭菌灯 ,,北京师范大学生产的 ? 紫外 辐射强度仪测定辐射强度。 辐射时将稀释的精液置于直径为的塑料培养皿中,放在距紫外灭菌灯 的摇床上,在照射过程 中摇床的转动速率为 . / 左右,测得此处的紫外辐射强度为 / . 方法 . . 亲贝暂养、产卵 栉孔扇贝亲贝取回后雌、雄分开暂养于水族箱中,每天升温?。至 恒温 , 恒温 , 恒温 待产。 月 日暂养 左右有产卵迹象。试验时挑选性腺充分成熟的雌、雄亲贝,分别移入水温 。加 满过滤海水容积为的塑料桶内,使之产卵排精。 . . 紫外线辐射精子对受精率及孵化率的影响 分别取稀释的精液 × 个/ 在紫外线下照射 对照组 、 、 、 、 、 、 、,照射完 后立即与 稀释的卵子 × 个/ 混合,转入烧杯中孵化培养。分别观察、计算受精率、孵化 率及成活率。受精率为分裂卵数占总处理卵数的百分比,孵化率为担轮幼虫数占受精卵的百分比 ,成活率为 形幼虫数占受精卵的百分 杨爱国等 。 . . 紫外辐射对精子形态结构的影响 取精子分别辐射 、 、 、 ,辐射后立即用 %多聚甲醛和 %戊二醛固定 张 岩等。 梅 固定的样品经梯度乙醇脱水,乙酸异戊酯置换,一零界点干燥仪干燥, 型离子溅射仪喷金后 ,于 维普资讯 ////. 海 洋 水 产 研 究 第 卷 型扫描电镜下观察拍照。 . 倍性检测 取担轮幼虫,加入适量 ,在一 ?温度下速冻保存,倍性检测时在室温下解冻,用旋涡混合仪震碎组 织,再用 ~ / 筛绢过滤,将细胞悬液加入测试管中,保证管中溶液达到 . ~ . ,流式细胞仪检测倍 性。 二倍体率为所测二倍体峰的细胞数面积 占检测出的所有峰的细胞数面积之和的百分比。单倍体率为 所测单倍体峰的细胞数 面积 占检测出的所有峰的细胞数 面积之和的百分比。 结果 . 紫外线辐射精子对受精及孵化的影响 从表 可以看出,经过紫外辐射的精子用于人工授精,卵子的受精率、孵化率都随辐射时间的增加而明显 降低。紫外辐射 左右,卵子的受精率和孵化率分别下降到 . %和 . %。辐射处理 ,分别下降到 . %和 . %。随着辐射时间的增加,成活率也呈迅速下降的趋势。辐射处理左右, . %的受精卵发 育到了担轮幼虫,但大多表现畸形,只有 . %发育到了 形幼虫。 表 不同紫外辐射时间对受精率、孵化率及成活率的影响 ,. 担轮幼虫的染色体倍性检测结果 应用流式细胞仪对担轮幼虫的染色体倍性检测结果如图 所示。对照组的二倍体含量 如图的 平均值为 . ,二倍体率占被测样品总数的 . %,随着辐射时间的增加,处理组的二倍体率逐渐下降,紫 外辐射 时 如图下降到 . %,而此时单倍体率达到 . %,其含量平均值为 . 。处理 时如图,单倍体率达到最大值. %,以后单倍体率迅速下降。 . 紫外线辐射对精子形态结构的影响 栉孔扇贝精子为鞭毛型精子,长约 / ,由头部、中段和末段 部分组成 如图。头部长约 . ~ . / ,呈锥形,主要包括顶体和细胞核。中段较短,长约 . ~ . / 。由线粒体围绕中心粒复合体形成 主要结构,末段细长 如图。 观察表明:经紫外辐射的精子首先表现为顶体外膜破裂;随着辐射时间的增加,顶体内膜相继破裂,亚顶体 腔内的物质向前突起,形成顶体丝如图 ,严重的整个头部全部脱落。在紫外辐射时间增加的过程中,精子 鞭毛脱落的比例也随之增加,在 组,有近 %的精子鞭毛已经脱落。同时,精子的中段呈浓缩趋势 ,线粒 体变得格外明显 如图 、 中箭头所示 。 分别对辐射 、 、 、 各组精子进行观察,根据其形态变化可以分为 类: 类,精子无明显形态变 化 如图; 类,顶体异常,有顶体丝出现 如图; 类,顶体异常,且鞭毛丢失 如图。每一辐射组随 机取 个以上的精子进行统计,按照破坏程度不同将其分为 组,各辐射组不同破坏程度的精子比例统计见维普资讯 ////. 第 期 赵峰等:紫外辐射对栉孔扇贝精 望堡 奎竺 竺 组中 辐射时 眦髓 蔫 拿 % . %蜘. % 机械损伤所造成的, 类精子在对照组未发现艄 ,随着辐射时间的增加冥比例迅逑增刀 ,到 洲 .取八 的 。 表 不同辐射时间下各类破坏程度的精子比例 注: 组为精子无明显形态变化; 组为顶体异常,有顶体丝出现; 组为顶体异常,且鞭毛丢失 图 担轮幼虫的流式细胞仪分析 :对照组, : 组, : 组, : 组 :二倍体, :单倍体.. , :, : , : ,讨论 随着紫外辐射时间的增加,受精率及 形幼虫成活率迅速下降,但是在辐射强度为 . /? 下辐射 ~ 仍可以得到 %以上的单倍体胚胎,证明紫外辐射对于栉孔扇贝精子遗传失活有明显作用。从 等 长牡蛎 . / , 等对地中海贻贝 . , 对紫 贻贝 . , 等对虾夷扇贝 的研究中发现,在双壳贝类中,紫外辐射对 于精子遗传失活的最佳辐射时间根据种类的不同往往也不一样,且与精子辐射的剂量及精子浓度 维普资讯 ////. 海 洋 水 产 研 究 第 卷存在一定的关系。 指出紫外线对精子遗传失活的影响是一个连续的过程。本实验在对 辐射处理组的检测过 程中,除发现在含量为左右出现二倍体峰外,还发现在含量低于左右出现杂峰 如图 , 二倍体峰与单倍体峰中间区域 ,结合空气干燥法染色体制片观察发现,这可能是由于非整倍体的存在而造成 的,等,等,, ,等在实验中也发现有非整倍 体的存在,这极有可能是由于紫外辐射处理使得精子的部分遗传物质失活所造成的。 图 紫外辐射栉孔扇贝精子的电镜扫描./ :顶体 :精核 :线粒体 :鞭毛 :顶体丝: ; :; : ; :; :受精率随着紫外辐射的时间增加而明显下降,表明精子的受精能力随着紫外辐射时间的增加而下降。原 因是由于在紫外辐射的过程中,精子受到破坏而部分丧失了受精能力所造成的。 紫外辐射后精子的形态发生了明显变化,主要表现在顶体异常和鞭毛脱落上。随着紫外辐射时间的增加, 顶体受到破坏的程度逐渐加剧,直到后来鞭毛脱落。精子顶体破裂,有顶体丝伸出,暗示紫外辐射有可能诱发 精子的顶体反应。精子人卵是通过与卵接触发生顶体反应释放顶体腔内的酶来消化卵膜而进入的,所以当紫 外辐射后精子顶体腔内的酶提前释放,有可能影响了卵子的受精。和 在用紫外线处理尼 罗罗非鱼精子中也发现有鞭毛脱落的现象,他们认为这是由于紫外辐射使鞭毛微管纤维解聚所造成的。鞭毛 币?顶体对于精子的游动、入卵以及受精十分重要 . ,所以,精子形态结构的异常可能是导 致受精率下降的主要原因之一。 在本实验中,虽然使用辐射处理的精子与正常卵子受精并成功获得了栉孔扇贝的单倍体,但是经辐射后的 . 精子与卵的相互作用及精子的归宿还不是很明确。等在长牡蛎 . 的研究中,认为辐射后的 精子可以人卵,并运用荧光显微镜观察了人卵后精核的行为变化,发现精子遗传物质不遗传给子代。有关栉孔