大鼠松果腺内VIP阳性纤维的来源研究_荧光金顺行追踪结合免疫荧光双标法

大鼠松果腺内VIP阳性纤维的来源研究_荧光金顺行追踪结合免疫荧光双标法 ( ) ()以荧光金 F G为顺行示踪剂 ,经大鼠双侧颈上交感神经节注射后 72 h ,断头取松果腺 浅部 提 要 (μ( ) ) 冰冻切片 片厚 40m。应用抗血管活性肠多肽 V IP血清及荧光抗血清作免疫荧光组化双重标记 , Ni ko n () 荧光显微镜观察 。结果显示 : 1F G 标记纤维广泛分布于松果腺浅部各区域 ,以被膜及血管周间隙更为明 () () 显 。2V IP 单标纤维也较丰富 ,占 F G 单标纤维的 66 % ,也以被膜为多 。3F G/ V IP 双标纤维却很少 ,仅占 V IP 单标纤维的 7 % 。以上结果提示 :松果腺内的神经纤维主要来自双侧颈上交感神经节 ,但 V IP 纤维则主 要来自于颈上交感神经节以外的区域 。 松果腺 颈上交感神经节 大鼠 血管活性肠多肽关键词 () 随着内分泌学特别是神经内分泌学和免疫调节30,40mg/ kg 体重麻醉 ,颈前正中切口暴露颈纳 的研究进展以及神经生物学研究技术的不断更新 , 上交感神经节 ,用微量注射器分别向双侧颈上交感 越来越多的实验证据和临床观察明 ,哺乳类动物 神经节内缓慢注射 2 % F G 水溶液 ,注射 1min ,持针 ( ) 松果腺 Pineal gland是 一 个 重 要 的 神 经 内 分 泌 器 ( ) 2min 。动物存 活 72 h , 断 头 取 松 果 腺 浅 部 , 入 含官 ,具有多种生理功能 ,不仅起着“副垂体”的作用调 ( 4 %多聚甲醛 、15 %饱和苦味酸的固定液 0 . 1mol/ L 节生殖系统的功能 ,还影响几种重要内分泌腺的功 能 ,特别在抗癌抗衰老 ,免疫及生物节律等多方面发 ) PB 配制 , P H714内固定 24,48 h ,转入 20 %蔗糖缓 挥重要作用 。松果腺的上述功能与其神经调控密切 ( ) 冲液 0 . 1mol/ L PB 配制 P H714, 4 ?过 夜 , 异 戊 烷 相关 ,故学者们用 HR P 、荧光素等逆行追踪 ,或用毁 (μ) 速冻后 AO 恒冷箱冰冻切片机切片 片厚 40m。 损 、摘除颈上交感神经节等间接方法围绕松果腺的 ( ) 112 免疫荧光组化染色 : 1切片入含 013 % Trito n神经支配问进行了大量研究 ,结果一般认为哺乳 ( ) - x - 100 的 0101M PBS 中室温孵育 30min 。2类松果腺主要接受双侧颈上交感神经节节后纤维支 ( ) 入免抗 V IP 血清 1 : 2000 ,List co mp 37 ?孵育 2 h , ( ) 室温 过 夜 。3 入 德 克 萨 斯2红 标 记 的 驴 抗 兔 Ig G 1 - 5 配,另有学者认为松果腺还接受脑源性的或其( ) Texas —Red —Ig G , 1 : 200 , J ackso n L ab溶 液 孵 育 2 ,6 它来源的神经纤维支配。但对松果腺内含不同() 1 h ,避光 。4裱片 ,避光自然干燥后防碎灭封片剂递质的神经纤维的形态和分布描述较少 ,特别是在 封片 。切片在上述各步骤之间均用 0 . 01M PBS 漂洗() 5min ×4 次 。5Ni ko n 荧光显微镜下分别以 B 型滤 形态学上还未见直接经颈上节传导示踪剂到松果腺 光片观 察 F G 标 记 纤 维 , G 型 滤 光 片 观 察 Texas — ( ) 的详细报道 。因此本实验以荧光金 F G作示踪剂 , Red 标记纤维 。 从颈上交感神经节直接注射 F G 经顺行运输到松果 该实验所用兔抗 V IP 血清经 V IP 抗原吸收后 腺 ,结合免疫荧光双标法了解经颈上交感神经节直 结果为阴性 ,用正常免疫血清取代抗血清结果也为 阴性 。 接投射到松果腺的神经纤维的形态 、分布及性质 ,为 进一步探讨松果腺的神经支配 ,阐明松果腺的功能 对照组大鼠为空白对照 ,除未经颈上节注射任 提供更加直接的形态学依据 。 何物质外 ,取松果腺 ,其余步骤与实验组完全相同 。 1 材料和方法113 半定量分析 : 镜下以串珠状纤维为标记纤维 , ( 111 成年健康雄性 SD 大鼠 华西医大实验动物中 分别计数 F G、V IP 单标纤维和 F G/ V IP 双标纤维 , ) ( 心提供12 只 ,体重 250,350g 随机分为实验组 10 并计算他们的相对比 。 ) () 只和对照组 2 只,实验组大鼠腹腔注射戊巴比妥 研究 。 2 结果 211 荧光金标记纤维 : F G 标记纤维发黄褐色荧光 , 参 考 文 献 Guerillot C ,L eff rag P , Pfister A ,et al . Co nt ributio n to t he 1 广泛分布于松果腺被膜内 ,血管间隙和腺细胞之间 。 st udy of t he pineal stalk nerve fibers in t he rat . Prog Brain 212 V IP 单标纤维 : V IP 标记纤维发红色荧光 , 串 Res 1979 ;52 :97 珠状成束分支分布于被膜内 ,少量分布于血管周间 保天然 ,陆振山 , 吴秀芬等. 豚鼠松果腺神经的研究 — 2 隙和腺细胞之间 ,纤维数量约为 F G 纤维的 66 % 。 ( ) 荧光及酶组织化学 华西医大学报 1988 ; 19 4: 354,213 F G/ V IP 双标 纤 维 : 数 量 很 少 , 偶 见 于 松 果 腺 358 实质细胞之间 ,仅占 F G 纤维的 6167 % 、V IP 单标纤 3 吴秀芬 ,保天然 ,陆振山等 1 豚鼠松果腺神经供给的研 维的 7161 % 。( ) 究 ———电镜观察 华 西 医 大 学 报 1988 ; 19 4 : 359 , 3 讨论362 7 1 8 Kappers, Guerillot 及 Pat rickso n等认为松 4 Reiter RJ . The mammalian pineal gland st ruct ure and f unc2 果腺仅接受交感神经颈上节的神经纤维支配 ,欧可 tio n . Am J Ant 1981 ;162 :287 - 313 9 5 Reiter RJ . Hedlund L . Perip heral sympat hetic innervatio n 群等用免疫组化法研究推测 V IP 样阳性纤维可 of t he deep pineal gland of t he gudgeo n hamster . Experi2 能不是来自颈上交感神经节 。本实验以 F G 为示踪 menter 1976 ;32 :1071 . 剂 ,注射到双侧颈上交感神经节被交感神经节后神 Puzdrowski RL . et al . Cent ral p rojectio ns of t he pineal 6 经元摄取 ,沿其轴突顺行运输 。由于 F G 不能跨突 co mplex in t he silver lamp rey let hyo myzo n unicuspis. Cell 触传递 ,所以笔者在松果腺内观察到的 F G 标记纤 ( ) Tissue Res. 1989 ;19 4:35 维就只能是从颈上 交 感 神 经 节 投 射 到 松 果 腺 的 纤 Kappers J A. The mammalian pineal gland survery. Acta . 7 维 ,这就用最直接的方法证实了多数学者用间接法 Neurochir 1960 ;34 :109 得到的结论 ———松果腺的神经支配主要来自双侧颈 Pat rickso n J W. Smit h T E. Innervatio n of t he pineal gland 8 上交感神经节 。in t he rat an HRP st udy Exp Neurol 1987 ;95 :207 ( ) 对于松果腺内血管活性肠肽 V IP纤维的来源 9 欧可群 ,陈文玉 ,马玉琼等 1 免疫组化法研究松果腺的 问题存在着较大的分岐 ,有人认为 V IP 纤维仍来源 ( ) 神经供给 ,四川解剖学杂志 1993 ;1 1:1010 L uebke J L . Wright OL I. Characterizatio n of target specific 于双侧颈上交感神经节,另一些学者则认为 V IP 10 neuro ns in t he rat superio r cervical ganglio n . Soc Neuro sci 纤维来自于蝶腭神经节的副交感神经元或来自中枢 11 12 Abst ri 1990 ;16 :520 的神经元,陈文玉等用去除双侧颈上交 感 神 Stacey P. Richo rd F. zigmand. Is t he vasoactive intestinal 11 经节方法间接说明 V IP 纤维不是来源于颈上交感 peptide - like immuno reactivit y in t he rat pineal gland 神经节 。本实验用免疫荧光组织化学双标法观察到 p resent in fibers o riginating in t he superio r cervical gan2 松果腺内的确存在 F G/ V IP 双标纤维 ,尽管其含量glio n ? Brain Res 1992 ;598 :327 ( ) 甚微 仅占 V IP 纤维的 7 %,但却是松果腺内极少 12 陈文玉 ,操高原 ,欧可群等 1 大鼠松果体内含 5 - 羟色 数 V IP 纤 维 直 接 来 源 于 双 侧 颈 上 节 的 有 力 佐 证 。 胺 血管活性肠多肽及 P 物质纤维的免疫组化观察 至于松果腺内大量 V IP 纤维是来源于蝶腭神经节 ( ) 解剖学杂志 1996 ;19 3:212 或中枢神经元 ,或来源于其它神经元还有待进一步 ( ) 收稿日期 :1998202203 The Study of VIP Fibersθ Origination in the Rat Pineal Gland Zh u J i ay u an Depa rt ment of Histology an d Em bryology , N ort h S ich u an M edical Col lege , 637007 The p urpose of t his st udy is to investigate t he direct innervatio n f ro m superior servical ganglia to pineal gland () () o n rat . Twelve rat s were rando mly divided into experimental group 10 ret sand co nt rol group 2 rat s. Fluor 研究地奥心血康对大鼠实验性心肌缺血的影响 。方法 : 结扎 wistar 大鼠左冠状动脉造成急 提 要 () ( ( ) 性心肌缺血 ,设缺血对照组 生理盐水、地奥心血康组 地奥心血康 0 . 10g/ kg,阳性药普萘洛尔组 普萘洛 ( ) 尔 0 . 01g/ kg,各组均在结扎冠脉 15min 后经十二指肠给药 ,记录给药前后不同时间胸前多导联心电图 9 个 ) Σ点,以S T 和 N S T 来反映心肌缺血程度和范围 ,结扎冠脉 3 h ,摘取心脏 ,用 N —B T 染色确定心肌梗塞面 Σ( 积 。结果 :地奥心血康 0110g/ kg 在 30 、60 、120 、180min 使S T 分别下降 24 % 、29 % 、30 % 、27 % 与对照组比 ) ( ) P < 0 . 01 、P < 0 . 05;使 N S T 降低 16 % 、17 % 、16 % 、17 % 与对照组比 P < 0 . 01持续 180min ,使梗塞面积由 ( ) 对照组的 15114 %降到 9 . 60 % P < 0 . 05。结论 :地奥心血康可降低大鼠实验性心肌缺血程度和缺血范围 , 减少梗塞面积 。 关键词 地奥心血康 心肌缺血 普萘洛尔1 112 动物 雄性 wistar 大鼠 ,体重 248 ?32g ,由华 地奥心血康 已 广 泛 应 用 于 临 床 治 疗 冠 心 病2 甚至急性心肌梗死,实验研究也证实它具有降低 西医科大学实验动物中心提供 ,动物质量合格证号 :3 实验性高脂血症血脂,改善心肌缺血后再灌注损 川实动管质第 71 号 。4 伤的心脏功能等作用 。为了进一步揭示其对心血 113 仪器 L MS —2B 二道生理记录仪 , 成都仪器 管系统的作用 ,本文研究了地奥心血康对大鼠实验 厂生产 。 5 、6 114 大鼠心肌缺血模型性心肌缺血的影响 。 wistar 雄性大鼠 , 以 乌拉坦 110g/ kg ,ip 麻 醉 , 气 管 插 管 接 动 物 呼 吸 机 , 1 材料与方法 经胸骨左缘开胸 ,暴露心脏 ,剪开心包膜 ,在肺动脉 111 药物 地奥心血康 :中科院成都地奥制药公司 圆锥与左心耳间的冠状静脉为标志用 5/ 0 号丝线结 生产 ,批 号 960321 : 普 萘 洛 尔 : 北 京 第 二 制 药 厂 生 ( 扎左冠状动脉 ,造成心肌梗塞 ,关闭胸腔 排尽胸腔( ) 产 ,批号 950618 ;硝基四氮唑兰 N —B T: 军事医学 ) 内空气,去除呼吸机恢复自主呼吸 。记录结扎前及科学院药材供应站 ,批号 920402 。 ( ) Gold F Gwere injected into t wo sides of superior servical ganglia for each rat of t he experimental group . 3 days af2 μter injectio n t he pineal gland were removed and 40m sectio ns were cut wit h f reezing microto me. U sing F G t racing co mbined wit h immuno - fluorescent histochemical staining , We examined t he pineal gland under t he Ni ko n fluores2 ( ) cence microscope. The vasoactive intestinal pep tide V IPnerve fibers , F G fibers and V IP/ F G bi - tagged fibers ( ) were measured for semiquantitative analysis. The result shows : 1Green fluorescence F G - tagged fibers were nu2 () merously displayed in each part of t he pineal gland ,especially in t he cap sule and bet ween t he blood vessels. 2Red Fluorescence V IP fibers were less t han F G fibers by 2/ 3 ,and t hey mainly located in cap sule ,o nly few dist ributed a2 () mo ng t he pinealocyte. 3F G/ V IP Bi - tagged fibers were very few ,merely about 7 % of t he V IP fibers. These re2 sult s indicate t hat : t he innervatio n of pineal gland is mainly originated f ro m superior servical ganglio n directly ,in2 cluding few V IP fibers. On t he ot her hand ,many V IP fibers in pineal gland were dist ributed f ro m ot her nerves or brain. Key Words Pineal gland Superior servical sympat hetic ganglia Innervatio n rat