不同浓度的秋水仙碱对枯草杆菌产_淀粉酶的影响

第 21 卷第 3 期 2006 年 9 月 安 　徽 　工 　程 　科 　技 　学 　院 　学 　报 Journal of Anhui University of Technology and Science Vol. 21. No. 3 Sep . ,2006 收稿日期 :2005 - 10 - 08 　 基金项目 :安徽省高等学校青年教师科研资助基金项目 (2005jql071) 作者简介 :聂光军 (1976 —) ,男 ,安徽含山人 ,硕士 ,讲师. 文章编号 :1672 - 2477 (2006) 03 - 0015 - 03 不同浓度的秋水仙碱对 枯草杆菌产α - 淀粉酶的影响 聂光军 ,薛正莲 ,岳文瑾 ,肖必青 ,陈　军 (安徽工程科技学院 生化工程系 ,安徽 芜湖 　241000) 摘要 :依次使用质量体积分数为 0. 01 %、0. 03 %和 0. 05 %的秋水仙碱诱变处理枯草芽孢杆菌 ,结果表明秋水 仙碱抑制枯草芽孢杆菌的生长 ;枯草芽孢杆菌分泌α - 淀粉酶的能力与秋水仙碱的浓度呈正相关. 最后 和探讨不同浓度的秋水仙碱对枯草芽孢杆菌分泌α- 淀粉酶能力的影响及其作用机理 ,为选育优良菌株奠定 基础. 关 　键 　词 :秋水仙碱 ;枯草芽孢杆菌 ;生长α - 淀粉酶 中图分类号 :Q512 　　　　文献标识码 :A 枯草杆菌是一种芽孢杆菌属 ,革兰氏阳性菌 ,无荚膜 ,需氧菌. 可利用蛋白质、多种糖及淀粉 ,分解色氨 酸形成吲哚 ,是α- 淀粉酶和中性蛋白酶的重要生产菌 ,能发酵产多种酶 ,有淀粉酶 (包括α- 淀粉酶和β- 淀粉酶) 、中性β- 甘露聚糖酶、蛋白酶、植酸酶等[1 ] . 随着酶制剂工业的发展与应用领域的不断拓宽 ,酶制剂的产量快速增长 ,尤以淀粉酶增长为最快 ,其 中α- 淀粉酶是我国目前产量大、用途广的酶制剂之一.α- 淀粉酶以无的方式切开淀粉分子内部的α - 1 ,4 糖苷键 ,而使淀粉分子迅速降解 ,生成糊精、低聚糖[2 ] 、麦芽糖及少量葡萄糖等 ,广泛应用于食品、酿 造、制药、纺织等诸多领域中[3 ] ,是一种重要的水解淀粉类酶制剂. 秋水仙碱最初是从百合科植物秋水仙中发现的重要生物碱[ 4 ] . 它是一种卓酚酮类生物碱 ,其结构经合 成所证实[5 ] . 秋水仙碱是抑制细胞有丝分裂的一个典型代表 ,能抑制癌细胞的增长 ,其结构中的 C 环与微 管蛋白结合 ,阻止其聚合成纺锤丝 ,使细胞分裂停止于中期. 本实验通过利用微生物培养技术和秋水仙碱处理枯草芽孢杆菌 ,来测定枯草芽孢杆菌分泌α - 淀粉 酶的能力 ,分析处理因素内不同水平对枯草芽孢杆菌这一表型性状的影响 ,利用实验结果辅助选育优良的 菌株 ,并为后续的基因水平分析奠定基础. 1 　材料与方法 1. 1 　材料 枯草芽孢杆菌 (来源于安徽工程科技学院生化工程系实验中心) 、秋水仙碱 (购自国药集团) . 1. 2 　方法 (1) 培养基的配制. 牛肉膏蛋白胨培养基 : 牛肉膏 3 g ,蛋白胨 10 g ,CaCl2 5 g ,琼脂 20 g ,水 1 000 mL ,p H = 7. 0～7. 2 , 121 ℃灭菌 20 min , 将灭菌培养基放入 37 ℃的温室中培养 24～48 h , 以检查灭菌是否彻底. 秋水仙碱诱变培养基 :分别称取 0. 005 g、0. 015 g、0. 025 g 的秋水仙碱加入到 50 mL 的牛肉膏蛋白胨 培养基 ,得到质量体积分数为 0. 01 %、0. 03 %、0. 05 %的诱变培养基. 产淀粉酶种子培养基 :牛肉膏 3 g ,蛋白胨 10 g ,葡萄糖 10 g ,可溶性淀粉 10 g ,CaCl2 ·2 H2 O 0. 1 g , N H4 H2 PO4 5 g ,FeSO4 ·7 H2 O 0. 1 g ,柠檬酸钠 0. 5 g ,水 1 000 mL ,p H = 7. 2 ,121 ℃湿热灭菌 20 min. 产淀粉酶发酵培养基 :牛肉膏 3 g ,蛋白胨 10 g ,酵母膏 1 g ,可溶性淀粉 50 g ,FeSO4 ·7 H2 O 0. 1 g , MnSO4 . H2 O 0. 5 g , CaCl2 ·2 H2 O 0. 1 g ,柠檬酸钠 0. 5 g ,水 1 000 mL ,p H = 7. 27 ,121 ℃湿热灭菌 20 min. (2)实验步骤. ①制备牛肉膏蛋白胨培养基和各种浓度的诱变培养基 ; ②菌株活化 :将实验室提供的出发菌种接种于以上牛肉膏蛋白胨培养基重新培养 ,37 ℃,24 h 左右 ; ③接种培养 :将活化的菌种分别接入各诱变培养基上诱变培养和牛肉膏蛋白胨培养基空白培养 , 37 ℃,48 h 左右 ; ④制备种子培养基和发酵培养基 ; ⑤制备菌种 :在无菌操作条件下 ,将灭菌的种子培养液按每瓶 100 mL 分装于 500 mL 三角瓶中 ,将各 浓度诱变和空白的枯草芽孢杆菌菌株接种于种子培养基中 ,37 ℃,121 r/ min 振荡培养 16 h ,作菌种 ; ⑥按 10 %的接种量将以上菌种接种于装有无菌发酵培养基的大三角瓶中 ,恒温摇床培养 ,维持 37 ℃ 振荡培养至对数生长后期 (稳定期) (约 48 h) ,离心 3 000 r/ min ,10 min ,收集各种浓度诱变的上清液 ,备 用 ; ⑦将各上清液用无菌双蒸水按 10 g/ 100 mL 稀释 ,酶液用于测定α- 淀粉酶活力. 离心的沉淀物用于 DNA 提取和后续实验. (3) α- 淀粉酶活力的测定. 取 1. 5 mL 1 %可溶性淀粉 60 ℃预热 5 min ,加入 0. 5 mL 粗酶液 ,60 ℃反应 10 min ,冷却终止反应 , 取 0. 1 mL 反应液 ,加入 10 mL 碘液 ,摇匀后在 680 处测吸光度[6 ] . 酶活力单位 (U/ g) :在上述条件下使淀粉 - 碘液吸光度下降 0. 001 的酶量为 1 个酶活力单位. 酶活力单位 = (OD 空白 —OD) / 0. 001. OD 空白为淀粉 —碘液吸光度 ,OD 为加酶时的吸光度. 2 　结果与分析 测量 3 管牛肉膏蛋白胨培养的枯草芽孢杆菌产α- 淀粉酶的活力 ,其酶的平均活力为 96 U/ g. 利用相 同的方法在同一环境下依次测量培养基中秋水仙碱质量体积分数为 0. 01 %、0. 03 %和 0. 05 %的枯草芽孢 杆菌产α- 淀粉酶的 OD 值 ,且每个浓度水平分别测量 3 次 ,由此可得的α- 淀粉酶的活力依次为 107、111 和 138 (详见表 1) ,初步得出枯草芽孢杆菌产α - 淀粉酶的活力和秋水仙碱的浓度大小呈正相关. 表 1 　不同质量体积分数的秋水仙碱诱变培养的枯草芽孢杆菌产α - 淀粉酶活力 序号 质量体积分数梯度/ % 酶活力/ (U ·g - 1 ) 1 0 96 2 0. 01 107 3 0. 03 111 4 0. 05 138 3 　讨 　　论 3. 1 　秋水仙碱对枯草芽孢杆菌生长的影响 秋水仙碱其结构中的 C 环与微管蛋白结合 ,阻止其聚合成纺锤丝 ,使细胞分裂停止于中期 ,影响细胞 的正常分裂 ,进而影响细胞的正常生长. 但是细胞的生长有不同阶段 ,秋水仙碱是否对生长的其他阶段有 着相同的影响还需要进一步验证和探讨. 3. 2 　秋水仙碱对枯草芽孢杆菌产α - 淀粉酶活力的影响 秋水仙碱诱变处理后的枯草芽孢杆菌发酵产生的α - 淀粉酶活力都有所提高 ,且提高的程度与质量 体积分数有关. 秋水仙碱质量体积分数为 0. 01 %到 0. 03 %枯草芽孢杆菌产α - 淀粉酶活力提高 4 个单 位 ,酶活力提高3. 74 % ;质量体积分数为 0. 01 %到 0. 05 %酶活力提高 31 个单位 ,酶活力提高 29. 8 % ;质 量体积分数为 0. 03 %到 0. 05 %酶活力提高了 21 单位 ,酶活力提高 25. 2 % ,由此可见在秋水仙碱的一定 ·61· 安 　徽 　工 　程 　科 　技 　学 　院 　学 　报 2006 年 质量体积分数范围内 ,其浓度越高枯草芽孢杆菌α- 淀粉酶活力提高越大. 秋水仙碱对枯草芽孢杆菌产α- 淀粉酶活力的影响可能有 4种情况 :一是由于秋水仙碱阻止枯草芽孢 杆菌的细胞的正常分裂 ,导致细菌大量形成二倍体或多倍体 ,即产酶基因倍数增加 ,因而形成相同细菌数 目产生更高活力的酶 ;二是秋水仙碱可能造成产酶基因启动子的增强突变 ,从而提高了基因的转录水平 ; 三是秋水仙碱诱变其他相关调控元件的突变 ,进而提高了酶的表达水平 ;四是秋水仙碱通过作用α- 淀粉 酶合成通路中的中介物质而影响α- 淀粉酶的合成. 具体的作用机理尚需进一步进行基因分析测定. 参考文献 : [1 ] 　潘皎 ,张义正. 枯草芽孢杆菌基因启动子的分离与鉴定[J ] . 微生物学 ,2004 ,4 (44) :457 460. [2 ] 　邬显障.酶的工业生产技术[ M ] . 长春 :吉林科学技术出版社 ,1988 :357 381. [3 ] 　张树政 ,胡学智 ,等 ,酶制剂工业[ M ]. 北京 :科学出版社 ,1984 :485. [4 ] 　Beyer H ,WolfgangW. 有机化学教程[ M ] . 北京 :高等教育出版社 ,1989 :47. [5 ] 　Dewar M J S. Structure of colchicine[J ] . Nature ,1945 ,155 :141. [6 ] 　范秀容 ,李广武 ,沈萍. 微生物学实验[ M ] . 北京 :高等教育出版社 ,1994. Study onα - amylase excreted by bacillus subtil is acted with different content of colchicine N IE Guang2jun , XU E Zheng2lian , YU E Wen2jin , XIAO Bi2qing , C H EN J un (Dept . of Bioch. & Engn. , Anhui University of Technology and Science , Wuhu 241000 , China) Abstract :0. 01 , 0. 03 and 0. 05 percent of colchicine acted wit h Bacillus subtilis respectively. The result s showed that colchicine can inhibit Bacillus subtilis growth and t here is a positive relationship between t he mass ofα- amylase excreted by Bacillus subtilis and t he content of colchincine. The p urpose is to dis2 cuss t he effect s and t he mechanism , especially to choose bet ter bacteria. Key words :colchicine ;Bacillus subtilis ; Growt h ;α - amylase ·71·第 3 期 聂光军 ,等 :不同浓度的秋水仙碱对枯草杆菌产α- 淀粉酶的影响