胡椒碱的抗抑郁及神经保护作用研究

胡椒碱的抗抑郁及神经保护作用研究 廖红波 1, 2 , 刘屏 13 , 胡园 1 , 王东晓 1 , 林辉 1 (1. 解放军总医院 临床药理药学研究室 , 北京 100853; 21江西中医学院 , 江西 南昌 330004) [摘要 ]　目的 :观察胡椒碱的抗抑郁及细胞保护作用。方法 :利用小鼠强制游泳实验、悬尾实验考察胡椒碱抗抑郁作用 ; 采用皮质酮损伤 SH2SY5Y神经细胞和分离培养新生大鼠海马神经前体细胞两种体外模型 ,测定细胞存活率 (MTT法 ) ,观察 胡椒碱对神经细胞增殖的影响 ,并初步探讨其抗抑郁的作用机制。结果 :胡椒碱 (10, 20 mg·kg- 1 )给药后 ,能明显缩短小鼠 在行为学实验中的不动状态时间 ,并且该作用随剂量增大效应逐渐降低 ;胡椒碱 (114, 7, 35μmol·L - 1 )可对抗皮质酮对 SH2 SY5Y的损伤作用 ,且对所培养具有神经前体细胞特性的细胞 ,具有促进神经前体细胞增殖的作用。结论 :胡椒碱具有较好的 抗抑郁作用 ,其作用可能是通过调控神经干细胞的增殖、迁移和分化及对功能性神经再生的保护和促进作用实现的。 [关键词 ]　胡椒碱 ; SH2SY5Y;悬尾 ;强迫游泳 ;抗抑郁 ;神经前体细胞 [收稿日期 ]　2008212220 [基金项目 ]　国家自然科学基金项目 (30600801) [通信作者 ]　3 刘屏 ,博士生导师 ,研究员 ,研究方向为天然药物化 学和中药药理学 , Tel: ( 010) 66936676, 68234090, E 2mail: liup ing126 @1261com 　　抑郁症 ( dep ression)是一种以持续的心境低落 为主要特征的情感障碍性精神疾病 ,随着各种应激 因素的加剧 ,其发病率正在快速攀升、高发且难根 治 ,抑郁症还与癌症、中风、心血管疾病等各种严重 疾病存在着密切的联系 [ 1 ] ,其发病机制非常复杂 , 从最早的单胺假说 ,到下丘脑 2垂体 2肾上腺 ( HPA ) 轴负反馈失调 ,再到神经细胞凋亡、坏死等机制都可 能与抑郁的发病有关。随着发病机制的深入研究 , 也为研制安全、有效的新药指明了方向。近年来 ,尤 其是抗抑郁天然药物的研究取得了一定发展 ,为临 床获得高疗效、低副作用的药物提供了广阔的前景。 胡椒碱 (p iperine) 属于桂皮酞胺类生物碱 , 在自然 界中存在广泛 ,尤其在胡椒科植物中大量存在 , 胡 椒碱的药理作用较为广泛 [ 2 ] ,文献报道其可非选择 性抑制单胺氧化酶而具有抗抑郁作用 ,前期的研究 发现 ,胡椒碱具有很好的细胞保护作用 [ 2 ]。基于促 神经元再生是抗抑郁剂的共同作用原理之一 ,保护 海马神经元死亡的抗抑郁作用假说 ,本文观察在经 典抑郁模型上胡椒碱的抗抑郁作用以及海马原代神 经细胞模型上探讨胡椒碱的抗抑郁作用是否通过促 保护神经细胞途径实现。 1　材料 111　动物 　SPF级昆明种小鼠 (18～22 g) ,雌雄各 半 ,合格证号 SCXK2(军 ) 20072012。SH2SY5Y细胞株 , 24 h内新生 W istar大鼠 ,均由军事医学科学院动物中心提供112　药品试剂 　胡椒碱 DMEM /F12 (1∶1)培养基(Hyclone公司 ) ; B27添加剂、N2 添加剂 ( Gibco公司 ) ;表皮生长因子 ( ep idermal growth factor, EGF)、碱性成纤维细胞生长因子 ( basic fibroblast growthfactor, bFGF)均为 Pep ro TECH公司 ;噻唑蓝 (32[ 4,52D imethylthiazol ] 22, 52diphenyltetr2azolium brom ide,MTT, Merck公司 ) ;阳性药地昔帕明 ( Sigma公司 ) ;皮质酮 ( Sigma公司 ) ;二甲基亚砜 (北京化学试剂公司 ,批号为 060730)。113　仪器 　MCO215AC型 CO2培养箱 ( SANYO ) ;3K15型冷冻离心机 ( Sigma公司 ) ; DNM 29602G酶标仪 (北京普朗新技术有限公司 )。2　方法211　小鼠悬尾实验 　将小鼠随机分为空白组、阳性药组 ( 地昔帕明 20 mg·kg- 1 ) 、胡椒碱组 ( 10, 20,40 mg·kg- 1 )。各组动物每日灌胃给药 1次 ,连续给药 7 d。参照文献方法 ,末次给药 30 m in后 ,将小鼠尾部距末端约 2 cm处用夹子固定 ,使小鼠倒挂在悬尾箱内 ,其头部离箱底约 5 cm。小鼠悬挂 2 m in后 ,立刻开始观察 ,观察持续 4 m in,累计此 4 m in内 小鼠的不动 ( 小鼠在空中停止挣扎 ,或仅有细小的 肢体运动 ) 时间 [ 3 ]。 212　小鼠强迫游泳实验 　各组末次给药 30 m in 后 ,将小鼠放入高 20 cm ,直径 14 cm 的圆柱形玻璃 缸中 ,每缸 1只 ,缸中水深 10 cm,水温 ( 25 ±1) ℃。 ·2651· 第 34卷第 12期 2009年 6月 　　　　　 　 　 　 　 　　　　　 　 　 　 　 Vol. 34, Issue　12 　 June, 2009 小鼠游泳 2 m in后 ,立即开始观察 ,观察持续 4 m in, 累计此 4 m in内的不动 (小鼠在水中停止挣扎 ,或动 物呈漂浮状态 ,仅有细小的肢体运动 )时间 [ 4 ]。 213　皮质酮损伤 SH2SY5Y细胞模型建立 　用含 10 %胎牛血清 ,青霉素 100 U·mL - 1 ,链霉素 100 U ·mL - 1的 DMEM 培养基 ,在 37 ℃, 5% CO2饱和湿 度的孵箱中培养 ,待进入对数生长期的 SH2SY5Y细 胞达到 70% ～80%融合 ,用 0125%胰酶消化约 2 m in,镜下观察细胞呈圆形 ,细胞部分悬起 ,立即加 入与胰酶等体积 DMEM 完全培养基终止消化 ,用 吸管吹打细胞至培养瓶壁上细胞全部吹打下来 , 用吸管转移入 15 mL尖头离心管 , 1 200 r·m in - 1 离心 5 m in,弃去上清液 , DMEM 培养基重悬细胞 , 以 1∶3的比例传代。用细胞计数器调节 SH 2SY5Y 细胞浓度约 1 ×105个 /mL ,每孔 80μL 接种于 96 孔板 ,继续培养。24 h后 ,每孔加入 10μL皮质酮 400μmol·L - 1损伤 ,加入已配的药物 10μL ( 015 μmol·L - 1地昔帕明 , 114, 7 , 35μmol·L - 1胡椒 碱 ) ,每个实验组均设 5个复孔。于 72 h后终止培 养 ,每孔加入终质量浓度为 5 g·L - 1的 MTT 20 μL , 37 ℃, 5 % CO2温箱中继续培养 4 h,待蓝紫色 的结晶形成后 ,吸弃上清 ,每孔加入 DMSO 150 μL ,摇床振摇 10 m in,充分溶解细胞中的蓝紫色结 晶物 ,用酶标仪测定 570 nm 波长处吸光度值 ,重 复实验 3次。 214　新生大鼠海马神经前体细胞培养 　无菌剥离 新生 24 h的大鼠全脑 ,置于冰冷的磷酸盐缓冲液解 剖液中 ,解剖显微镜下分离双侧海马组织 ,用手术刀 将之切成糜状 , 1125 g·L - 1的胰蛋白酶 37 ℃消化 30 m in。之后用含 100 mL ·L - 1血清的 Dulbecco ’s 改良的 Eagle ’s培养基 /F12培养基终止胰酶消化 , 1 500 r·m in - 1离心 8 m in后弃上清 , Dulbecco’s改良 的 Eagle’s培养基 /F12培养基重悬沉淀 ,再次离心 5 m in后弃上清 ,将沉淀重悬于神经干细胞培养基中 (Dulbecco’s改良的 Eagle’s培养基 /F12培养基 + 20 g·L - 1 B27添加剂 + 10 g·L - 1 N2添加剂 + 20μg ·L - 1表皮生长因子 + 20μg·L - 1碱性成纤维细胞 生长因子 ) ,过 200目细胞筛 ,得到单细胞悬液。锥 虫兰染色后进行活细胞计数 ,以 (4～5) ×105个 /mL 的密度将细胞接种于 50 mL细胞培养瓶中 , 37 ℃, 体积分数为 5%的二氧化碳条件下培养 ,第 3天半 量换液 , 7 d后收集神经球 ,巴斯德管轻柔吹打成单 细胞后更换培养瓶 ,传代密度为 012 ×105个 /mL。 经神经干细胞表面抗原 2巢蛋白免疫荧光化学鉴定 和神经干细胞分化鉴定培养的细胞为神经干细胞。 四甲基氮唑兰法观察药物对神经干细胞增殖的影 响 :第 2代神经球分散为单细胞之后 ,以 014 ×104 个 /mL密度接种于预先用多聚赖氨酸包被过的 96 孔板中 ,然后分别给予不同浓度的地昔帕明或胡椒 碱 ,培养 4 d后 ,加入 015 g·L - 1的四甲基氮唑兰 (100μL /孔 ) , 4 h后 ,直接加入 100 g·L - 1的十二 烷基硫酸钠 ( 100μL /孔 ) ,待蓝色颗粒充分溶解后 (12～16 h) ,双波长扫描分光光度计测定标本在 570 nm 处的吸光度 (A570 nm ) ,实验结果。 215　数据分析 　数据以均值 ±差表示 ,药物作 用采用 One2way ANOVA 方法分析 ,组间差异 ( P < 0105或 P < 0101) 由 Dunnett′s test分析。 3　结果 311　胡椒碱对小鼠悬尾和游泳不动时间的影响 　 给药 1周后 ,可明显缩短小鼠在应激环境中的不动 时间 ,延长悬尾和游泳时间 ,明显缓解其行为绝望状 态 ,提示胡椒碱具有良好的抗抑郁作用。胡椒碱 40 mg·kg- 1剂量组作用最差 ,显示出倒置的量效关系 曲线 (表 1)。 表 1　胡椒碱对小鼠悬尾和游泳不动时间 的影响 ( €x ±s, n = 10) 组别 剂量 /mg·kg - 1 悬尾不动时间 /m in 游泳不动时间 /m in 对照　　 - 92167 ±22196 121175 ±25171 地昔帕明 20 58124 ±191752) 59188 ±271272) 胡椒碱　 10 62124 ±211302) 76150 ±291632) 20 65134 ±241131) 91138 ±27147 1) 40 66113 ±271171) 110178 ±23149 　　注 :与对照组比较 1) P < 0105, 2) P < 0101。 312　胡椒碱对皮质酮所致 SH2SY5Y细胞损伤的影 响 　倒置显微镜下观察 SH2SY5Y细胞的形态变化 , 正常组和阳性组 ,胡椒碱组 SH2SY5Y细胞突起明 显 ,呈梭形、不的三角形或多边形。模型组 SH2 SY5Y细胞大部分胞体皱缩 ,突起缩短消失或断裂 , 细胞呈圆形。MTT检测结果可知 ,皮质酮对 SH2 SY5Y细胞表现出明显的损伤现象 ,阳性组与模型 组比较有显著性差异 ,胡椒碱组与模型组比较有显 著性差异 ,对剂量有依赖性 ,高剂量 ( 35 μmol· L - 1 )最好 (表 2)。 ·3651· 第 34卷第 12期 2009年 6月 　　　　　 　 　 　 　 　　　　　 　 　 　 　 Vol. 34, Issue　12 　 June, 2009 表 2　胡椒碱对皮质酮损伤的 SH2SY5Y细胞 存活率的影响 ( €x ±s, n = 5) 组别 剂量 /μmol·L - 1 A570 nm 增值率 /% 正常 - 2117 ±0108 100 皮质酮 400 1103 ±01141) 47147 地昔帕 015 1168 ±01153) 77142 胡椒碱 114 1156 ±01142) 71189 7 1164 ±01143) 75158 35 1169 ±01163) 77188 　　注 :与正常组比较 1) P < 0101;与模型组比较 2) P < 0105, 3) P < 0101。 313　胡椒碱对海马神经干细胞增值的影响 　与对 照组比较 , 地昔帕明可以增加神经前体细胞的 A570 nm ( P < 0101 )。同样 , 胡椒碱在 114, 7, 35 μmol·L - 1浓度下 ,也可增加神经前体细胞的 A570 nm ( P < 0105) (表 3)。 表 3　胡椒碱海马神经干细胞增值率的影 ( €x ±s, n = 5) 组别 剂量 /μmol·L - 1 A570 nm 增值率 /% 正常　　 - 0168 ±0103 100 地昔帕明 015 0176 ±01011) 111176 胡椒碱　 114 0173 ±01021) 107135 7 0174 ±01021) 108182 35 0175 ±01011) 110129 　　注 :与正常组比较 1) P < 0101。 4　讨论 强迫游泳实验 ( FST)和悬尾实验 ( TST)是国际 上用于抗抑郁药物初筛的两个最常见动物模型 [ 526 ]。 两种模型的作用原理均是通过对动物施以无法逃避 的应激刺激 ( inescapable stressor)造成动物的行为绝 望 ( behavioural despair)而模拟人类的抑郁症症状 , 又称为行为绝望抑郁动物模型。在这两种模型下 , 胡椒碱明显缩短小鼠在应激环境下的不动时间 ,显 示了其抗抑郁的作用。而其在量效关系上呈现的曲 线倒置现象可能与其在较高剂量下的中枢抑制作用 有关 [ 7 ]。多数研究认为抑郁症的发生与脑内单胺 递质不足有关 ,尤其是与 52羟色胺、多巴胺、去甲肾 上腺素等关系密切 [ 8 ]。前期也有报道表明 ,胡椒碱 可非选择性抑制单胺氧化酶 ,提示对脑内神经递质 含量的影响参与其抗抑郁作用 [ 7 ]。 但抑郁症的发病机制非常复杂 ,就目前研究来 说 ,海马损伤是抑郁症发生的主要原因之一 :由于 HPA轴功能亢进而导致血中糖皮质激素 ( Glucocor2 ticoids, GC)水平显著升高 ,高浓度的 GC使得中枢 神经系统 ,特别是海马组织主要的兴奋性神经递质 谷氨酸 ( glutamate, Glu)的释放增加 ,重摄取减少 , 使得脑内 Glu堆积 ;另一方面使自由基大量产生 , Ca2 +大量内流 ,使胞内 Ca2 +超载 ,细胞骨架受损 , 蛋白交错 ,最终导致海马神经元的死亡。 SH2SY5Y细胞来源于人的神经母细胞瘤 ,其形 态与正常神经元相似 ,呈锥形而且具有明显的轴突 , 某些生理功能亦与正常神经元有相似之处 ,是国际 上目前研究神经细胞功能较好的一种细胞模型。研 究表明高浓度 GC处理大鼠肾上腺髓质细胞瘤分化 株 PC12细胞后 ,细胞存活率比正常组降低 [ 8 ] ,并且 在原代培养海马神经元上也表现出类似的效应。 本实验基于胡椒碱在行为学模型上的抗抑郁 , 选用 GC损伤 SH2SY5Y神经细胞模型 ,观察胡椒碱 对神经细胞的保护作用 ,同时分离培养新生大鼠海 马神经前体细胞模型 ,观察胡椒碱对神经细胞增殖 的影响 ,探讨其抗抑郁的作用的另一途径。研究结 果表明 , GC对 SH2SY5Y细胞表现出明显的损伤 ,具 有抗抑郁活性的胡椒碱 (114～35μmol·L - 1 )可明 显抑制 GC的损伤 ,有一定的剂量依赖性 ,高剂量 (35μmol·L - 1 )组作用最好 ,说明其有较好的保护 神经细胞作用。 海马神经发生对于维持人类的正常学习记忆和 情绪控制都有重要的作用 ,初步的研究表明 ,抗抑郁 药物如三环类、单胺氧化酶抑制剂、选择性 52HT再 摄取抑制剂 ,都能促进海马的神经发生。本研究中 , 114, 7 , 35μmol·L - 1浓度的胡椒碱在海马神经干 细胞原代培养模型上 ,可增加神经前体细胞的增殖 , 与对照组比较有显著性差异。提示胡椒碱的抗抑郁 作用的另一途经可能是通过神经细胞保护 ,以及促 进海马干细胞增殖来抵抗或克服抑郁导致的神经元 萎缩和丢失实现的。 总之 ,对神经细胞的保护作用和神经元的再生 创造作用无疑为抑郁症治疗靶标的选择提供了新的 视角。胡椒碱作为一个药理作用广泛的天然活性化 合物 ,其抗抑郁作用的机制有待于更深入的研究。 [参考文献 ] [ 1 ]　李银贵 ,柯娟娟 ,蒋翠岚 1抗抑郁药物的研究进展 [ J ]1中国制 药信息 , 2000, 16 (9) : 11 ·4651· 第 34卷第 12期 2009年 6月 　　　　　 　 　 　 　 　　　　　 　 　 　 　 Vol. 34, Issue　12 　 June, 2009 [ 2 ]　刘屏 ,索婧侠 ,于腾飞 1胡椒碱药理作用的研究进展 [ J ]1中国 药物应用与监测 , 2007 (3) : 71 [ 3 ]　Steru L, Chermat R, Thierry B , et al1 The tail suspension test: A new method for screening antidep ressants in m ice[ J ]1 Psychophar2 macology, 1985, 85 (3) : 3671 [ 4 ]　张均田 1现代药理学实验方法 [M ] 1北京 : 北京医科大学中 国协和医科大学联合出版社 , 1998: 5811 [ 5 ]　Lan L, Nong W ang J, Kong L D, et al1 Antidep ressant effects of Banxia Houpu decoction, a traditional Chinese medicinal emp irical formula [ J ]1 Ethnopharmacol, 2000, 73 (1 /2) : 2771 [ 6 ]　Frazer A, Morilak D A1 W hat should animal models of dep ression model [ J ]1 Neurosci B iobehav Rev, 2005, 29 (4 /5) : 5151 [ 7 ]　李崧 ,王澈 ,李巍 ,等 1胡椒碱及其衍生物 3 , 4 次甲二氧桂皮 酰哌啶的抗抑郁作用 [ J ] 1 沈阳药科大学学报 , 2006, 123 (16) : 3921 [ 8 ]　黄文超 ,李云峰 ,罗质璞 1单胺递质对皮质酮所致的 PC12 细 胞损伤的保护作用 [ J ]1中国药理学通报 , 2003, 19 (1) : 1031 An tidepressan t2like effects of p iper ine and its neuroprotective m ech in ism L IAO Hongbo1, 2 , L IU Ping13 , HU Yuan1 , WANG Dongxiao, L IN Hui (11D epertm en t of C lin ica l Pharm acology and Pharm acy, Chinese PLA General Hospita l, B eijing 100853, Ch ina; 21J iangxi U niversity of Traditional Chinese M edicine, N anchang 330004, Ch ina) [ Abstract] 　O bjective: To observe the antidep ressant effect of p iperine and its neurop rotective mechinism1 M ethod: The be2 havioral studies were performed in forced swimm ing test ( FST) and tail suspension test ( TST) 1 To further exp lore the mechanism s un2 derlying their antidep ressant2like activities, CORT2induced neuroblastoma SH2SY5Y cells and isolated and cultured neural p rogenitor cells1 By usingMTT assay, the effect of p iperine on neural cells p roliferation was observed1 Result: The research results indicated that after a week of adm inistration, p iperine ( 10, 20 mg·kg- 1 ) could significantly reduce the duration of immobility in both FST and TST1 Piperine has the p rotective effect on neuroblastoma cells and increased p roliferation of hippocampus neural p rogenitor cells1 Con2 clusion: In the p resent study, we demonstrated that the antidep ressant2like effects of p iperine and its mechanism s m ight be involved by up2regulation of the p rogenitor cell p roliferation of hippocampus and cytop rotective activity1 [ Key words] 　p iperine; antidep ressant; SH2SY5Y; neural p rogenitor cells [责任编辑 　刘 　 ] 本刊重要启事 本刊已开通在线支付功能 ,作者请登录本刊网站 www. cjcmm. com. cn“作者中心 ”,点击在线充值 ,可以 选择网上银行 (没开通网银功能的帐户可以选择信用卡充值 )和手机充值卡 2种充值方式 ,充值成功后系统 会显示您的账号余额。然后您可以根据稿件状态和编辑部邮件来缴纳相应的费用 ,如审稿费 ,发表费 等。如有疑问请咨询鲍雷编辑 : 13683362408, 178562955@ qq. com。 ·5651· 第 34卷第 12期 2009年 6月 　　　　　 　 　 　 　 　　　　　 　 　 　 　 Vol. 34, Issue　12 　 June, 2009