氯通道ClC3 反义寡核苷酸对过氧化氢诱导的大鼠主动脉平滑肌细胞凋亡

[文章编号] � 1007�3949( 2006) 14�05�0369�05 �实验研究� 氯通道 ClC�3反义寡核苷酸对过氧化氢诱导的大鼠主动脉 平滑肌细胞凋亡的影响 周 园, 周家国, 丘钦英, 黎小妍, 刘 捷, 关永源 (中山大学中山医学院药理学教研室, 广东省广州市 510080) [关键词] � 病理学与病理生理学;氯通道; ClC�3 反义寡核苷酸;细胞凋亡; H2O2 ;血管平滑肌细胞 [摘 � 要] � 目的 � 研究 ClC�3 反义寡核苷酸对H2O2 诱导的大鼠主动脉平滑肌细胞凋亡的影响。方法 � 蛋白免疫 印迹法检测 ClC�3 蛋白达;形态学方法、DNA 琼脂糖电泳、MTT 法和流式细胞仪观察和 H2O2 诱导的大鼠主动 脉平滑肌细胞形态学改变、DNA断裂、细胞存活率和凋亡率及 ClC�3 反义寡核苷酸转染对其影响。结果 � ClC�3 反 义寡核苷酸转染抑制内源性 ClC�3 蛋白表达后,可加重 H2O2 诱导大鼠主动脉平滑肌细胞形态学改变及 DNA 断裂, 细胞凋亡率由52. 8% 13. 6%增至 75. 7% 5. 8% ( n= 6, P < 0. 01) ,而细胞存活率由 48. 9% 4. 3%进一步降低为 31. 3% 4. 3% ( n= 6, P < 0. 01)。结论 � ClC�3 反义寡核苷酸转染促进H2O2 诱导的大鼠主动脉平滑肌细胞凋亡。 [中图分类号] � R363 [文献标识码] � A Effects of ClC�3 Antisense Oligonucleotide on H2O2�Induced Apoptosis in Rat Aortic Vas� cular Smooth Muscle Cells ZHOU Yuan, ZHOU Jia�Guo, QIU Qin�Ying, LI Xiao�Yan, LIU Jie, and GUAN Yong�Yuan ( Department of Pharmacology , ZhongshanMedical College of Sun Yat�Sen University , Guangzhou , 510080, China ) [ KEY WORDS] � Chloride Channel; � ClC�3 Antisense Oligonucleotide; � Apoptosis; � H2O2 [ ABSTRACT] � � Aim � To investigate the effects of ClC�3 antisense oligonucleotide on H2O 2� induced apoptosis in rat aortic vascular smooth muscle cells. � � Methods� Western�blot was performed to detect the expression of ClC�3 protein. � Morpholog� ical determination, DNA agarose gel electrophoresis, MTT assay and flow cytometry analysis were performed to measure the mor� phological changes, DNA ladder, viability and apoptotic rate and effects of ClC�3 antisense oligonucleotide on rat aortic smooth muscle cells. � � Results � The antisense oligonucleotide specific to ClC�3 mRNA decreased the expression of ClC�3 protein and enhanced the apoptotic events induced by H2O2 including ultrastructural alteration and DNA ladder. � The apoptotic cell death rate increased from 52. 8% 13. 6% to 75. 7% 5. 8% ( n= 6, P < 0. 01) , and whereas the viability further decreased from 48. 9% 4. 3% to 31. 3% 4. 3 % ( n= 6, P< 0. 01) by ClC�3 antisense oligonucleotide transfection. � � Conclusion � ClC�3 anti� sense oligonucleotide potentiated apoptosis induced by H2O2 in rat aortic smooth muscle cells. [收稿日期] � 2006�03�13 � � � � [修回日期] � 2006�05�09 [基金项目] � 国家自然科学基金( 30472021, 30500616) ; CMB( 00730) ; 广东省自然科学基金( 5300822) [作者简介] � 周园,博士研究生,研究方向为心血管药理,联系电话 020�39358085, E�mail 为 zyxxgyl@ 126. com。周家国,博士,副教授,研 究方向为心血管药理, E�mail为 zhoujg@ mail . sysu. edu. cn。通讯作者 关永源,教授,博士研究生导师,研究方向为心血管药理, 联系电话 020�87331857,E�mail为 guanyy@mail. sysu. edu. cn。 � � 血管平滑肌细胞( smooth muscle cell, SMC)增殖 与凋亡的失衡是动脉粥样硬化的重要病理改变之 一[ 1]。已知在细胞增殖与凋亡过程都伴随有细胞容 积的改变,增殖早期,多数细胞会因代谢增强而增加 氨基酸、水等物质的进入, 导致细胞肿胀; 而细胞凋 亡早期的典型特征之一就是在正常渗透压下产生的 凋亡性容积减低现象。近年来研究表明, 容积调节 性氯通道( volume�regulated chloride channel, VRCC)参 与上述过程的调控[ 2]。VRCC 广泛分布于哺乳动物 组织和细胞,在调节细胞容积、免疫反应、细胞膜电 位及细胞的增殖、凋亡等过程中发挥了重要作用,但 其分子基础迄今尚未完全明了[ 3]。有报道认为 ClC� 3可能编码了 VRCC [ 4] , 但这一观点仍有广泛争 议[ 5]。最近, 我们在血管 SMC 上的研究发现, ClC�3 蛋白是VRCC的分子基础[ 6] ,应用 ClC�3反义寡核苷 酸抑制 ClC�3蛋白表达后可明显抑制内皮素 1诱导 的SMC增殖 [ 7] , 但 ClC�3 氯通道是否参与血管 SMC 的凋亡过程尚未见报道。本实验在以往研究的基础 上,观察 ClC�3 反义寡核苷酸转染大鼠主动脉 SMC 后,对H2O2 诱导的细胞凋亡的影响。 1 � 和方法 1. 1 � 药品、试剂与仪器 DMEM�F12、LipofectAMINE2000 购于 Invitrogen 369CN 43�1262/ R中国动脉硬化杂志 2006年第 14卷第 5期 转载 http://www.paper.edu.cn中国科技论文在线 公司; 新生牛血清购于 Hyclone 公司;胰蛋白酶购于 Sigma 公司; Western�blot Kit购于Bio Rad公司; CLC�3 多克隆抗体购于 Alomone Labs公司; ��actin 抗体购 于New Marker公司;二抗购于 Cell signaling 公司; 硫 代磷酸化修饰的 ClC�3寡核苷酸片段由上海生物工 程公司合成并纯化。CO2 培养箱 (美国 Labtech 公 司, C200型) , 倒置显微镜 (日本 Nikon 公司, TS100 型) ,高速冷冻离心机(德国Hettich 公司,U32R 型) , 微型电泳仪、垂直电泳和水平电泳装置(美国 Bio� Rad 公司, PAC300型) ,凝胶扫描分析系统(美国Ad� vanced American Biotechnology 公司, 5434478 型) , 酶 标仪(美国 Bio�TEK 公司, ELX800 型) , 流式细胞仪 (美国 Beckman 公司, EPICS- Elite型)。 1. 2 � 细胞培养及药物处理 组织贴块法培养大鼠主动脉平滑肌细胞( aortic smooth muscle cells, ASMC)。无菌条件下分离雄性 SD大鼠( 150~ 200 g)胸主动脉,轻柔去除外膜、内皮 后,将中膜肌层剪碎( 1~ 2 mm2 ) , 均匀铺于培养瓶 上, 4~ 6 h后加入含 20 %小牛血清,青霉素、链霉素 各100 kU�L 的 DMEM�F12培养基, 37 ! 、5% CO2 静 置培养。细胞生长近融合时, 倒置相差显微镜观察, 可见细胞呈梭形,高低起伏排列为∀峰与谷#状。特 异的��act in免疫组织化学法染色表明 SMC 纯度> 95%。选择生长良好的第 8~ 14代细胞用于实验。 实验时,细胞以 80%密度接种于96孔板和35mm 培 养皿或6孔板中,瞬时转染 48 h后加入H2O2 处理。 H2O2 诱导细胞凋亡模型按文献 [ 8] 方法, 细胞以 80%密度接种于 96 孔板和 35 mm 培养皿或 6 孔板 24 h后,给予 800 mol�L H2O2 处理细胞24 h。 1. 3 � 反义、正义和随义寡核苷酸转染 靶向人 ClC�3 mRNA 起始密码区的反义和正义 序列参照文献 [ 9]合成。反义序列是 5∃ �TCC ATT TGT CAT TGT�3∃ ; 正义序列是5∃�ACAATG ACA AAT GGA�3∃。本实验室以随机方式了随义系列 5∃� TCT ATT CCT GTA TTG�3∃ , 其与反义寡核苷酸片段 碱基组成相同, 但随机排列且与 Genebank中已知的 与 ClC�3有关的序列无同源性。为保证稳定性, 寡 核苷酸的前三个碱基被硫代磷酸化修饰。转染按 LipofectAMINE2000说明书进行,即将正义、随义及反 义寡核苷酸和脂质体分别稀释于无血清、无抗生素 DMEM�F12培养基中至所需浓度,室温放置 5 min后 将寡核苷酸与脂质体缓慢混匀, 室温孵育 20 min。 吸弃细胞原培养基, 换无血清、无抗生素的培养基, 将寡核苷酸与脂质体混合物加入孔或皿中。转染 6 h 后换成含血清的培养基继续培养。寡核苷酸标记 FAM荧光以观察细胞对寡核苷酸的摄取。 1. 4 � Western�blot 检测 用冰浴的 PBS洗涤细胞两遍, 加入细胞裂解液 ( 50 mmol�L Tris�Cl, 150 mmol�L NaCl, 0. 2 g�L NaN3 , 1 g�L NP�40, 1 g�L SDS, 5 g�L 脱氧胆酸钠, 5 mg�L apro� t inin, 1 mmol�L PMSF)裂解 30 min,刮下细胞, 4 ! , 12 kr�min,离心 10 min, 吸取上清进行蛋白质定量。将 蛋白质等量样本加入6 % SDS凝胶加样缓冲液混合, 与蛋白质分子质量 Marker 一起进行 SDS�PAGE 电 泳。电泳完毕后, 恒压 100 V 电转 2 h,将蛋白转移 到硝酸纤维素膜上,用 5%脱脂奶粉 PBST 缓冲液室 温封闭 2 h,洗脱后加入 ClC�3多克隆抗体( 1&400稀 释)与�- actin抗体(稀释倍数为1&400) , 室温温育 1 h。PBST 洗膜 1 h,室温下孵育二抗(抗 ClC�3抗体 1 &1 000, 抗 �- actin抗体 1&1 000, 抗生物素二抗 1& 1000) 1 h, PBST 洗膜 1 h。化学发光法检测,加检测 液于硝酸纤维素膜上,与膜作用 3 min,曝光到 X光 片上。胶片用凝胶成像系统扫描、分析条带灰度值。 1. 5 � 存活率测定(MTT 法) MTT 被线粒体中的琥珀酸脱氢酶代谢后,产生 深紫色的甲月赞结晶,其量与活细胞数成正比,故常用 于细胞活性测定。接种于 96孔板的细胞处理相应 时间后,加入MTT( 5 g�L) 10 L,置 37 ! 、5% CO2 培 养箱中孵育 4 h 后去除培养基, 加入二甲基亚砜 (DMSO) 100 L 溶解结晶体, 于酶标仪 ( Bio�Tek, USA)上在波长为 570 nm 处测定吸光度 OD值, 细胞 存活率( %) = 处理组 OD值�对照组OD值% 100%。 1. 6 � 形态学观察(Hoechst33258染色) 接种于 35 mm培养皿的细胞处理相应时间后, 移去培养基, 用PBS洗细胞 2次,甲醇&冰醋酸( 3&1, 体积比)固定 10 min, 然后用蒸馏水洗细胞 2次, 晾 干,加入 5 mg�L Hoechst33258 ( Promega Chemical Co, USA)染色5 min,用蒸馏水洗 2次,室温下晾干, 在荧 光显微镜(激发波长 360 nm, 发射波长 450 nm)下观 察并随机拍照。 1. 7 � DNA断裂片段分析 细胞经H2O2 处理 24 h 后, 移去培养基, PBS洗 涤 2次后, 加入 500 L 细胞裂解液( 10 mmol�L Tris� HCl, 1 mmol�L EDTA, 0. 5% Triton X�100, 100 g�L 蛋 白酶 K)裂解 10 min, 将裂解液小心吸入 Eppendorf 管, 37 ! 水浴过夜,用酚&氯仿( 1&1, 体积比,下同)、 酚&氯仿&异丙醇( 25&24&1)、氯仿各抽提 1 次, 12 kr� min,离心 10 min。取上清, 加 1�10体积 300 mmol�L 乙酸钠和2倍体积无水乙醇沉淀过夜, 12 kr�min,离 370 ISSN 1007�3949 Chin J Arterioscler, Vol 14, No 5 中国科技论文在线 http://www.paper.edu.cn 心10 min。弃上清,将沉淀用体积分数为 0. 70乙醇 洗涤 2次,加入20 L TE(含20 mg�L RNase A)溶解, 37 ! 水浴 1 h。样品在含 0. 5 mg�L EB 的 1. 0 g�L 琼 脂糖凝胶上以 60 V电泳 1 h,紫外灯下观察拍照。 1. 8 � 流式细胞仪检测 荧光染料碘化丙啶( PI)染色后, 流式细胞仪分 析细胞的 DNA含量,根据亚二倍体峰计算凋亡细胞 的百分率。取待测细胞, 常规消化后, PBS 洗涤 2 次, 1. 5 kr�min, 离心 3 min收集细胞,用 70%的乙醇 4 ! 固定 24 h。测定前离心洗去乙醇,加碘化丙啶染 液(含 50 mg�L PI, 10 mg�L RNase A, 1 g�L Triton X� 100, 10 g�L柠檬酸钠和 5 g�L NaCl) , 室温下避光染 色30 min。流式细胞仪测定荧光强度值并以Multi� cycle 软件处理结果,计算凋亡率。 1. 9 � 统计方法 结果用 x s 表示,用方差分析进行统计判断, 计算由SPSS 11. 0标准版统计软件完成。 2 � 结 果 2. 1 � 大鼠主动脉平滑肌细胞 ClC�3蛋白的表达 为了检测寡核苷酸片段被大鼠主动脉平滑肌细 胞摄入情况, 用标记 FAM 荧光的寡核苷酸进行转 染。结果如图1所示,对照组细胞无荧光,而转染反 义、正义及随义寡核苷酸的细胞在荧光显微镜下呈 绿色荧光,表明寡核苷酸被细胞摄入。 图 1. 大鼠主动脉平滑肌细胞转染荧光标记寡核苷酸( 200 % ) � � A 为对照组, B为正义组, C为随义组, D为反义组。 � � 用 100 mg�L ClC�3反义寡核苷酸转染 24、48和 72 h后,大鼠ASMC内源性 ClC�3蛋白的表达量分别 降低 20. 1% 2. 8%、54. 8% 1. 6%和 54. 2% 3. 3% , 48 h时的抑制作用最强(图 2和表 1)。 图 2. ClC�3反义寡核苷酸转染后不同时间大鼠主动脉平滑肌细胞 ClC�3 蛋白表达的免疫印迹结果 表1. 转染 ClC�3 反义寡核苷酸不同时间后 ClC�3 蛋白表达 的变化 ( x s , n= 6) 细胞分组 时间 相对灰度值 空白对照组 ∋ 100% 反义转染组 24 h 80% 2. 8% a 反义转染组 48 h 45% 1. 6% b 反义转染组 72 h 46% 3. 3% b a 为 P < 0. 05, b为 P < 0. 01,与对照组比较 � � 当用 25、50、100和 200 mg�L 的 ClC�3反义寡核 苷酸转染细胞 48 h后,内源性 ClC�3蛋白的表达分 别降低 21. 2% 1. 6%、38. 9% 3. 1%、57. 5% 5. 1%和 56. 9% 4. 7% (图 3和表 2) ,其中以 100 mg�L 抑制作用最强。而正义( 100 mg�L)和随义寡核苷酸 ( 100 mg�L)以及 LipofectAMINE2000 对 ClC�3 蛋白的 表达没有明显影响( n= 6, P> 0. 05)。 2. 2 � 细胞凋亡的形态学检查 荧光显微镜下, 细胞经 Hoechst 33258 染色后, 正常胞核呈均匀荧光,而 800 mol�L H2O2 处理 24 h 后,细胞皱缩、变圆, 染色质浓集,可见凋亡小体(图 4)。转染 100 mg�L ClC�3反义寡核苷酸可促进H2O2 诱导的细胞凋亡样形态学改变, 而 ClC�3 正义、随义 寡核苷酸及脂质体转染则无明显影响(图 4)。 表 2. 转染不同浓度 ClC�3 寡核苷酸后 ClC�3 蛋白表达的变 化 ( x s , n= 6) 细胞分组 浓度 相对灰度值 空白对照组 ∋ 100% 脂质体转染组 ∋ 99. 0% 3. 2% 正义转染组 100 mg�L 97. 0% 2. 0% 随义转染组 100 mg�L 101% 3. 8% 反义转染组 1 25 mg�L 79. 0% 1. 6% a 反义转染组 2 50 mg�L 61. 0% 3. 1% a 反义转染组 3 100 mg�L 43. 0% 5. 1% a 反义转染组 4 200 mg�L 43. 0% 4. 7% a a为 P< 0. 01, 与空白对照组比较。 371CN 43�1262/ R中国动脉硬化杂志 2006年第 14卷第 5期 中国科技论文在线 http://www.paper.edu.cn 图 3. 不同浓度 ClC�3 反义寡核苷酸转染后大鼠主动脉平滑肌细胞 ClC�3 蛋白表达的免疫印迹结果 图4. 转染 ClC�3 寡核苷酸对H2O2 诱导的主动脉平滑肌细胞 形态学改变的影响 ( 400 % ) � � A 为对照组, B为H2O 2 组, C 为脂蛋白( a) + H2O 2 组, D为随义+ H2O2 组, E为正义 + H2O2 组, F 为反义+ H2O2 组。 2. 3 � DNA断裂片段分析结果 大鼠主动脉平滑肌细胞经 H2O2 处理 24 h后, 电泳出现DNA ∀梯状图谱# (图 5)。100 mg�L ClC�3 反义寡核苷酸转染加重 DNA断裂程度,而正义、随 义寡核苷酸及脂质体转染没有明显影响(图 5)。 图5. 转染不同 ClC�3 寡核苷酸对 H2O2 诱导的细胞 DNA 断 裂的影响 � � A为对照组, B为 H2O2 组, C为脂蛋白( a) + H2O2 组, D为正义+ H2O2 组, E为随义+ H2O2 组, F为反义+ H2O2 组。 2. 4 � 细胞存活率检测结果 大鼠主动脉 SMC 存活率见表 3。H2O2 处理引 起细胞存活率下降。ClC�3反义寡核苷酸转染可浓 度依赖性地加重 H2O2 引起的细胞死亡, 100 mg�L ClC�3反义寡核苷酸转染使细胞存活率下降( n = 6, P< 0. 01) ,与其对内源性 ClC�3蛋白表达的抑制程 度相一致,而 ClC�3正义、随义寡核苷酸及脂质体转 染对 H2O2 引起的细胞死亡没有明显影响( n= 6, P > 0. 05)。 表 3. 大鼠主动脉平滑肌细胞存活率的变化 ( x s , n= 6) 细胞分组 浓度 细胞存活率 空白对照组 ∋ 100% H2O 2 处理组 ∋ 49% 4. 3% H2O 2+ LP组 ∋ 48% 3. 4% H2O 2+ 正义组 100 mg�L 49% 4. 9% H2O 2+ 随义组 100 mg�L 51% 5. 3% H2O 2+ 反义组 1 25 mg�L 45% 5. 3% a H2O 2+ 反义组 2 50 mg�L 38% 4. 5% b H2O 2+ 反义组 3 100 mg�L 31% 4. 3% b a为 P< 0. 05, b为 P < 0. 01,与H2O 2 处理组比较。 2. 5 � 细胞凋亡率检测结果 用流式细胞仪检测细胞凋亡的变化如图 6所 示, ClC�3反义寡核苷酸转染可使细胞凋亡率由 52. 8% 13. 6%升至 75. 7% 5. 8% ( n = 6, P< 0. 01, 表 4) , 而ClC�3正义、随义寡核苷酸及脂质体转染对 此没有明显影响(表 4, n= 6, P> 0. 05)。 表 4. 大鼠主动脉细胞凋亡率的变化 ( x s , n= 6) 细胞分组 细胞凋亡率 空白对照组 2. 2% 1. 4% H2O 2 处理组 52. 8% 13. 6% H2O 2+ LP组 57% 10% H2O 2+ 正义组 54% 13% H2O 2+ 随义组 58% 12% H2O 2+ 反义组 75. 7% 5. 8% b b为 P < 0. 01,与 H2O 2 处理组比较。 3 � 讨 论 正常情况下,血管平滑肌细胞增殖与凋亡的平 衡决定血管壁的生长、结构,二者失衡可引起血管重 372 ISSN 1007�3949 Chin J Arterioscler, Vol 14, No 5 中国科技论文在线 http://www.paper.edu.cn 图6. 大鼠主动脉平滑肌细胞流式细胞分析 � � A 为对照组, B为H2O2 组, C为脂蛋白( a) + H2O2 组, D为正义+ H2O2 组, E为 随义+ H2O2 组, F 为反义+ H2O2 组。 构,是动脉粥样硬化的重要病理改变[ 10] 。研究如何 调控平滑肌细胞的凋亡和增殖, 对揭示动脉粥样硬 化的病因和防治具有重要意义。 已知细胞的增殖和凋亡过程均伴随有细胞容积 的变化。在增殖早期, 细胞因代谢增强而增加氨基 酸、水等物质的进入, 可导致细胞肿胀; 而细胞凋亡 早期的典型特征之一是在正常渗透压条件下发生的 细胞皱缩,即凋亡性容积减低现象,提示通过调节容 积可能调控细胞的增殖与凋亡。容积调节性氯通道 是维持细胞容积的动态平衡中的主要氯通道, 研究 表明,VRCC在细胞的增殖、凋亡发生过程中有重要 作用。氯通道阻断剂 NPPB、DIDS 等可抑制多种细 胞的增殖反应[ 11,12]。在神经元和PC12细胞, 氯通道 阻断剂NPPB、SITS 和 DIDS等不仅抑制细胞的调节 性容积减低过程,而且可保护细胞的凋亡 [13]。但亦 有不一致甚至完全相反的报道, 如 VRCC 阻断剂 NPPB、IAA�94对家兔心肌细胞缺血再灌时的细胞凋 亡并无保护作用,反而促进凋亡,增加缺血诱发的心 肌梗死面积 [ 14, 15] 。这些差异可能与氯通道阻断剂缺 乏选择性有关, 如NPPB、SITS、DIDS等不仅可抑制容 积调节性氯通道,而且对 Ca2+ 激活的氯通道亦有明 显阻断作用, SITS、DIDS 不仅阻断氯通道而且阻断 ATP�敏感性 K+ 通道、SLC4 家族 ( Na+ �HCO3- 转运 体)等 [16, 17]。最近在 ClC�3基因敲除小鼠研究中发 现, ClC�3 氯通道相对特异性阻断剂 DIDS 和 NPPB 对心肌细胞的凋亡仍有明显的保护作用[ 18] 。提示 氯通道阻断剂对凋亡的影响可能尚存在与 ClC�3氯 通道无关的其它机制。 我们前期的研究结果表明, ClC�3反义寡核苷酸 抑制 ClC�3蛋白表达的同时, 亦明显抑制 ET�1诱导 的主动脉平滑肌细胞的增殖 [ 8] 。本实验中, 我们采 用 ClC�3反义寡核苷酸转染,发现ClC�3蛋白的下调 可促进H2O2 诱导的血管平滑肌细胞凋亡。我们的 研究结果提示 ClC�3氯通道通过促进细胞增殖和抑 制细胞凋亡调控血管平滑肌细胞的功能。 [参考文献] [ 1] � Bennett MR, Evan GI, Scnwattz SM. � Apoptosis of human vascular smooth mus� cle cells derived from normal vessels and coronary atherosclerotic plaques [ J] . � J Clin Invest, 1995, 95 ( 2) : 2 266�272 [ 2] � Lang F, Ritter M, Gamper N, Huber S, Fillon S, Tanneur V, et al. � Cell vol� ume in the regulation of cell proliferation and apoptotic cell death [ J] . � Cell Physiol Biochem , 2000, 10 ( 5�6) : 417�428 [ 3] � Eggermont J, Trouet D, Carton I, Nilius B. � Cellular function and control of volume�regulated anion channels [ J] . � Cell Biochem Biophys , 2001, 35 ( 3) : 263�274 [ 4] � Duan D, Winter C, Crowley S, Hume JR, Horowitz B. � Molecular identification of a volume�regulated chloride channel [ J] . � Nature, 1997, 390 ( 6658) : 417� 421 [ 5] � Weylandt KH, ValverdeMA, Nobles M, Raguz S, Amey JS, Diaz M. � Human ClC�3 is not the swelling� activated chloride channel involved in cell volume regu� lation [ J] . � J Biol Chem, 2001, 276 ( 20) : 17 461�467 [ 6] � Zhou JG, Ren JL, Qiun QYHe H, Guan YY. � Regulation of intracellular Cl- concentration through volume�regulated ClC�3 chloride channels in A10 vascular smooth muscle cells [ J] . � J Boil Chem, 2005, 280 ( 8) : 7 301�308 [ 7] � Wang GL, Wang XR, Lin MJ, He H, Lan XJ, Guan YY. � Deficiency in ClC�3 chloride channels prevents rat aortic smooth muscle cell proliferation [ J] . � Circ Res , 2002, 91 ( 10) : e28�32 [ 8] � Ryer EJ, SakakibaraK, Wang C, Sarkar D, Fisher PB, Faries PL, et al. � Pro� tien kinase C delata induces apoptosis of vascular smooth muscle cells through in� ducection of the tumor suppressor p53 by both p38�dependent and p38�depenet� ment and p38�indepedentment mechanisms [ J ] . � J Biol Chem, 2005, 280 ( 42) : 35 310�317 [ 9] � Wang L, Chen L, Jacob TJ. � The role of ClC�3 in volume�activated chloride cur� rents and volume regulationin bovine epithelial cells demonstrated by antisense in� hibition [ J] . � J Physiol, 2000, 524 ( Pt1) : 63�75 [ 10] � Mayr M, Xu Q. � Smooth muscle cell apoptosis in arter iosclerosis [ J] . � Exp Gerontol , 2001, 36 ( 7) : 969�987 [ 11] � Wondergem R, Gong W, Monen SH, Dooley SN, Gonce JL, Conner TD, et al. � Blocking swelling�activated chloride current inhibits mouse liver cell prolifera� tion [ J] . � J Physiol , 2001, 532 ( 3) : 661�672 [ 12] � Xiao GN, Guan YY, He H. � Effects of Cl� channel blockers on endothelin�1� induced proliferation of rat vascular smooth muscle cells [ J] . � Lif e Sci , 2002, 70 ( 19) : 2 233�241 [ 13] � Wei L, Xiao AY, Jin C, Yang A, Lu ZY, Yu SP. � Effects of chloride and po� tassium channel blockers on apoptotic cell shrinkage and apoptosis in cortical neurons [ J] . � Pflugers Arch, 2004, 448 ( 3) : 325�334 [ 14] � Szabo I, Lepple�Wienhues A, Kaba KN, Zoratti M, Gulbins E, Lang F. � Ty� rosine kinase�dependent activation of a chlor ide channel in CD�95�induced apop� tosis in T lymphocytes [ J] . � Proc Natl Acad Sci USA , 1998, 95 ( 11) : 6 169� 174 [ 15] � Souktani R, Ghaleh B, Tissier R, d∃ Anglemont deTassigny A, Aouam K, Be� dossaP, et al. � Inhibitors of swelling�activated chlor ide channels increase in� farct size and apoptosis in rabbit myocardium [ J] . � Fundam Clin Pharmacol , 2003, 17 ( 5) : 555�561 [ 16] � Romero MF, Fulton CM, Boron WF. � The SLC4 family of HCO3� transporters [ J] . � Pflugers Arch, 2004, 447 ( 5) : 495�509 [ 17] � Remillard CV, Lupien MA, Crepeau V, Leblanc N. � Role of Ca2+ � and swelling�activated Cl� channels in alpha1�adrenoceptor�mediated tone in pres� surized rabbit mesenteric ar terioles [ J] . � Cardiovasc Res , 2000, 46 ( 3) : 557� 568 [ 18] � Takahashi N, Wang X, Tanabe S, Uramoto H, Jishage K, Uchida S, et al. � ClC�3�independent sensitivity of apoptosis to Cl� channel blockers in mouse car� diomyocytes [ J] . � Cell Physiol Biochem , 2005, 15 ( 6) : 263�270 (此文编辑 � 胡必利) 373CN 43�1262/ R中国动脉硬化杂志 2006年第 14卷第 5期 中国科技论文在线 http://www.paper.edu.cn