建立检测嗜肺军团菌mip基因的PCR—微孔板反向探针杂交法

军团萄． 1) 绚娘 落医科走学擘报 J ShanghaiMedUnlv 60一乩6 建立检测嗜肺军团菌 mip基因的 PCR一 微孔板反向探针杂交法 R √ 朱利平 石尧忠 陈一平 李忠明 钟 平“ 邬祥惠 翁心华 (上 面j毒 _华山医院传染病学教研室— 。‘ 0； 美国食物药品管理局3I1s 缸th 一 A d urg，MD 20877 USA；出上悔生物铜品研究所 上悔 200052) 近年来随着对军团菌基因水平的深入研究和聚 合酶链反应(P(1R)及其相关技术的不断发展，为军 团菌检测提供了一个快速、敏感、特异的诊断方法， 并已用于环境水和临床标本中的军团菌检测，具有 较好的检测效果⋯1。但是 ，要使之成为常规的临床 诊断方法，尚需不断完善和发展。我们 旨在建立一 种新的 P( 扩增产物检测系统，并应用于致病性军 团菌的检测。 材料和方法 菌株及其 DNA抽提 嗜肺军 团菌(血清型 l、 2、3、4⋯5 6 8型)、米克戴德军团菌(Lm)均来 自美 国疾病控制中心，由上海市卫生防疫站、本校中山医 院提供。 铜绿假单胞菌、大肠杆菌、奇异变形杆菌、金黄 色葡萄球菌、流感杆菌、肺炎杆菌、结核杆菌均为临 床分离菌株，由本院细菌室和抗生素研究所提供。 肺炎支 原体、衣原体为 PCR试剂盒中的阳性 DNA，由无锡市三爱斯生化科技开发有限公司 提供。 菌株 DNA抽提 采用蛋 白酶 K消化、酚氯仿 抽提经典方法进行 J。 PCR引物及探针 的设计与合成 引物选 自嗜 肺军团菌(Lp)的巨噬细胞感染增强子(mlp)基因区 内，引物 Lmip一1核酸序列 为 5’GGTGACTC~d3． 0朗 TrA啪 3’，引物 Lmip一2核酸序列为 5 G0 AATAGGTa CAAcG一3’，扩增 引物长度 为 630 bp[ ，其中引物 Lmip-2标记荧光素 FITC；探 针 Lmip一3核 酸 序 列 5’。GAGCAA 踟 一 cAAC0GATGCCA03’，并在 5’端标记一含 6碳的 氨基连接臂。引物及探针的合成、标记委托美 国食 物药品管理局(F1]lA)完成。 PCR扩增及其扩增产物分析 (1)PCR扩增及 琼脂糖凝胶电泳分析步骤参见文献[4]；(2)微孔板 反 向探针 杂 交分 析：① 将 40 pmol／L探针 溶 于 100“I磷酸盐缓冲液(50 mmol几 Na2HP04 pH8．5，1 mmol／L EUI'A)中，并包被于 DNA—BINDS96微 孔板(美 国 Coming Co$tar公 司提供)上；②马来酸 缓冲液(100 mmol几 顺丁烯二酸、150 mmol／L NaC1 pH7．5)漂洗 3次；③加入200 I／孔封闭液(磷酸盐 缓冲液、3％BsA)37℃30 min后弃液；④分别将 1O “1PCR产物热变性 5rain后球水浴 5min，再溶于 100“I的6×S9C(1×SSC：0．15tool／LNaC1、0．015 mol／L柠檬酸钠，pH7．0)杂交液中，继之加入到已 包被的微孔板中，37℃微摇 60mln；⑤用 37℃预热 的洗涤液(2×sSC、0．1％SDs)漂洗 2次后 37℃浸 泡5min，弃液 ；⑥ 向结合有 PCR产 物的孔内加入 100 l：1 000碱性磷酸酶标记的抗 FITC抗体 ，37 ℃微摇 30 min；⑦马来酸缓冲液漂洗 3次；⑧向每孔 内加入 100“I新鲜配制 的底物 PNP 2mg／ml，24 rain后 ELISA仪读 0D 值 ，以 OD405>0 15为阳 性标 准。 动物实验 9只豚鼠(由本校实验动物部提供) 中 7只实验组豚鼠，经腹腔感染米克戴德军团菌，并 在不同感染天数予 以解剖，共获 22份标本 ，2只对 照组豚鼠经腹腔注射灭菌生理盐水，4 d后解剖获 6 份标本。对上 述标 本行培 养、病 理及 DNA抽提、 PCR扩增及其产物的检测。 结 果 P( 扩增产抽检测敏 感性酌比较 琼脂糖凝 胶电泳法(图 1)最低限度可以测 出模板 l：106稀释 的扩增产物，即可测得 DNA含量 为 150 fg的军 团 菌基因组 DNA。 微孔板反向探针杂交法(图 2)最低限度可以测 出模板 1：10 稀释的扩增产物，即可测得 DNA含量 为 l5 的军团菌基因组 DNA，相当于 1～2个军团 菌，而且作为阴性对照的背景信号低。 PCR扩增产物检测特异性 凝胶 电泳法与微 孔板反向探针杂交法检测结果显示，Lpl、Lp2、Lp3、 Lp4、Lp5、Lp6、Lp8、Lm均 阳性 ，而铜绿假单胞菌、 大肠杆菌 、奇异变形杆茁、金黄色葡萄球菌、流感杆 一 维普资讯 http://www.cqvip.com 朱利平 ，等．建立检测嗜肺军团茁 mip基因的 PCR一微孔板反 向探针杂交法 菌、肺炎杆菌、结核杆菌、肺炎支原体、衣原体及阴性 对照均低于 Cutoff值 0．15，电泳法也未见 阳性条 带。 固1 模板 1：10梯度稀释PCR扩增产物电泳检测 Fig1 Detectloa of10一fold—dilutedDNA from L． poemnophila by gel deetmphoa~ ,Sto pIes1 to8 corr~ dto10一 fold dilutions．starting at 150 ．0f DNA from L．Paeun~ hila introduced曲 template intheFCR ．Sample 9 _舾 the blank PCR m tur锚 曲 control 1-2 ¨ 孝 I¨ 裹 l 不同赡染天数培养与PCR法阳性辜比较 Tab 1 o lp is0nof the positive№ of speelmems deleeted by culture and DNA ampllflealion assays (” ．“ po di g the nmnber of∞忸 I speeimens~( )corm~ ndlng the ntanber of sD n detected positive 讨 论 90年代初 ，国外学者提出采用微孔板探针杂交 法检测 P( 扩增产物 ，已相继报道应用于细菌、真 菌、病毒等病原微生物的检 测_5一 。但 是，该方 法 由于使用链酶亲和素包被孔板 ，在后序洗板过程中 易被洗脱，造成结果的稳定性不够L8J，为此，本实验 采用美国Costar公司研制的 DNA—BINDT 微孔板 系统来检测军团菌PCR扩增产物，目前 国内外文献 尚未见报道。该板应用特殊工艺吸附一层琥珀酰亚 胺酯 ，很容易与氨基化的 DNA、蛋白质上的氨基发 生共价偶联．形成特异性偶联物，较传统的链酶亲和 素被动吸附微孔板更为牢固，一旦结合则不被洗脱， 而其他非特异性结合物 (如未标记 的DNA、dNTPs、 蛋白质分子等 )可被完全洗脱 ，从而保证其结合的特 异 性。在传 统 PCR扩 增 产物检 测方 法 中，利 用 Southern印迹杂交法检测军团菌灵敏度最高，较凝 胶电泳法高 10倍 J，我们将微孔板杂文法与凝胶电 泳法相比较 ，结果显示灵敏度也较电泳法高 1O倍， 提示本方法敏感性达到了与同位素探针杂交检测相 一 致的水平 。 通过对豚鼠感染后的组织标本军 团菌检测．结 果也显示组织标本军团菌培养阳性者，PCR一微孔 板反向探针杂交法均阳性。随着感染时问延长，培 养阳性率逐渐下降，在感染后 7．5 d培养阳性率为 零 ，PCR一凝肢电泳法 阳性率为 22．2％，而 PCR一 微孔板反向探针杂交法阳性率达 44．4％，此时组织 的病理改变更显著。初步实验结果表明有较好的检 出率，但进一步评估尚有待干更多标本的检测。 本工作结果显示能特异地检出嗜肺军团菌和米 克戴德军团菌。在致病性军团菌中，嗜肺军团菌占 85％以上，而米克戴德军团菌较嗜肺军团菌更易感 染免疫受损患者_】 ，因此 ，两者 的特异性检测具有 重要 的临床价值。此外 ，由于本方法敏感性高，又可 与现有的酶联反应试剂、仪器相配套，并避免放射性 同位素的使用，因而在临床研究中具有很好 的应用 前 景 。 关蕾词 微孔板反向杂文； 嗜肺军团茁； mip基因 聚合酵链反应 中国固书资料分类法分类号 RS10 4 参 考 文 献 1 朱刺平，石尧患 军团苗棱酸拉鹚的进展．中率侍枭病l奇志．1995． 13(1)：60-42 (下转第64页】 维普资讯 http://www.cqvip.com 上海医科大学学报 1999年 1月，26(1) 表4 对z酰彝基酚分散片稳定性考察结果 Tab 4 Stability of dispe商b1etablets (2c±5) Examine jtern ／d Co]oLtT~W hite．Degrad~6on：No 讨 论 分散片的处方主要组分为药物与至少一种崩解 剂和遇水形成高粘度的落 胀辅料等配伍 而成 ，控制 其质量的关键因素是：①选用适宜的辅料；②控制药 物和辅料的粒度。本处方中原料药过 100目筛 ，与 辅料同过 80目筛 ，其 目的是控制粒度和混合均匀。 辅料 PVPPxL一10(N一乙烯 一2一毗咯烷酮的交联不 溶性均聚物)是粒度在 0～74 gm，具有优异的助流 性、塑变性和粘联性 的溶胀材料。PVPPx~一1o具有 很高的毛细管活性及水合能力 ，迅速将水吸人片中， 然后膨胀崩解。内加 PVPPxL一1o的吸水使固体颗粒 崩解为更细小的粉末从而增加 了主药的溶 出。辅料 可压性淀粉使处方具有更好的可压性和流动性，且 有促进溶出的效果H J。从稳定性考察的结果看，本 处方所用的辅料 PVPP~一1o、可压性淀粉 以及 PVP 等对主药的溶出度和含量测定没什 么影 响。对乙酰 氨基酚分散片性质稳定。 两种辅料的应用不仅使对乙酰氨基酚分散片可 以在普通压片机上制作，而且完全符合英 国药典的 质量要求 ，与其他 国内外普通片相比具有较强的市 场竞争力。它 10rain的落 出度可达 90％以上，20 rain的溶 出度达 95％以上，优于国产对 乙酰氨基酚 普通片，不亚于百服宁、泰诺等产品。 处方中硫脲(H2NC~NH2)作抗氧剂L5J，硫脲除 具有抗氧化的作用以外 ，还能与金属离子形成加合 物 。有利于对乙酰氨基酚分散片的稳定。 、 关键词 对乙酰氨基酚； 分散片； 溶 出虚 ； 稳定性 中国图书资料分类法分类号 R944．4 参 考 文 献 1 BfifishnlBrma嘶 B&衄 5 ．BP．k柑 叽 ，theUr~tedKingdon forHM SO，1993 755 2 黄胜毙．分散片进展．中国药学杂志．1992，27(4)：226～228 3 藏叶军。黯讳芳 。吴柏林 ，等．薄层层析法鉴别对乙酰氨基酚及其 降懈产物对氨基酚．上海医科太学学报 ．1998，25(2)：121 4 王洪光，张故华．可压性淀粉对片嗣溶出度帅影响 中嘲医药工业 隶志，1992 23(6)：259～2 5 顾学裘 药物帝I剂注解 (第二艋)．北京 ：人民出版社．1981，725～ 727 (1998—02—27收稿)(洗 玲 编辑) f上接第61页) 2 张饪，赵寿元 ．分子生物学基本实验方法 上海 ：复且大学出版杜 ． 1989：305～ 307 3 Ja lIac B．N 出 M．I3en~ein N．et 81 I)eteet~a of legionella印p in bmaelmelvmlsx1 flulds byDNA amplification，ClinMitre- bid，1992，30(4)：920—924 4 朱利平 ，石尧患，陈一平，等 寨台酶链反应 诊断军团苗箍染帅实 验研究．中年侍枭病杂志，1998：16(3)：158～160 5 】∞ D．R nb扎n A，We'~ich S，et 81 Ermine—Linked ira— n f∞B鼙ay{or detection of PeR 一~ x01ified DNA of Le h in bmelmel,~ larfILlid．，ain h ，1995．33(5)：1274—1252 6 F~itaSI，L础 BA， n可 ，et 81． 廿o6啪 d∞ p 把 l im— m帅 0assay幻 det毗 p0R一 啪 edDNA fmm ( l山 sp* in Noad CAinMim ，1995．33(4)：962—967 7 Inc~ e S， ndoR M [cmp e hybridi~tion of帅 med D 帆 se T帅t CAinM 1990，28(6)：1469—1472 8 Lunel~ E．J目 JS．Fm~ehM Detection 0』r ∞ a Ⅲpnetm~一 niae by砌 wn日ase clan re．etCh and non~dioective h．vbfidi~tlon in mi~ titer a硝 ．J0inM b制 ．1993．31(5)：1088—1094 9 s1丑nd1＆dL MN， l S，T∞ pk LS，et Sp筐l嵝 Bc detee— ∞ of kg h p工1日m 袖 da in帅竹 by DNA 帅 m龃t and 蜥 出髓6∞．Ja M 曲 ．1989，27(6)：1257—1261 10 ManedI GL．germ~t JE。 13．R． neipk3 w~ ice ofinfee· 6ous d e&瞄 4tl-ed．New york：Cht~dulI IAvir~ ae。1995， 2O 一2103 (1998—02—16收稿)(张暑峰 编辑) 维普资讯 http://www.cqvip.com