腺病毒扩增

上海市张江高科技园区科苑路 151号 5201室 邮政编码 201203 Tel:021-50807707 Fax:021-50807708 网站名称: 新基因 网络实名:基因治疗 http://www.sino-gene.cn http://www.sino-gene.com http://www.sino-gene.org http://www.sino-gene.biz 版权声明：该实验方案及知识产权为新基因网站所有，未经授权，不得转载 -1- 在 293细胞中大量扩增腺病毒 一旦重组病毒已被纯化和鉴定，即可在 293 细胞中进行大量扩增。本手册提供了递增培养规模和腺病毒 感染周期的基本方法，按这一方法最终得到的病毒量约为 3×1011～3×1012。由于一个细胞中所含的病毒颗粒 为 1000～10000，因此 1L培养细胞可得到约 5×1012病毒颗粒。如果要把病毒用氯化铯梯度离心纯化，则必 须至少 3×108的细胞，这样才能正确分辨出病毒带。对于蛋白表达，则根据需要可在任何一步扩增步骤中停 止，离心沉淀细胞后按照适当的操作方法进行蛋白抽提（根据蛋白类型的不同抽提上清或细胞沉淀）。为优化 时间进程，每个感染周期必须与下一次细胞扩增培养同步。如果由于各种原因不能同步，则必须将病毒冻存， 直至下一次细胞培养开始后再融化病毒。注意每次扩增都将会剩下一些病毒，这些病毒先不必丢弃，以便下 一步扩增失败时备用。每次扩增最好都用最低代的病毒颗粒，这样产生突变型病毒的可能性会大大降低。 操作步骤： 1. 在 100mm培养皿或 75cm2培养瓶中加入 10ml DMEM5%培养 5×106 293细胞。 2. 取 0.5ul首次扩增的病毒保存液，加入 DMEM5%至 1ml，混匀，这样稀释得到的 MOI 值约为 5。 3. 移去培养液，小心加入病毒混合液，切勿破坏细胞单层，十字形慢慢晃动 3次，37℃ CO2孵箱中培养 90 分钟。 4. 加入 9ml DMEM5%。 5. 再培养 72小时，这时在 10ml溶液中大约有 5×109～5×1010个病毒颗粒，进行 MOI 测定以估计病毒颗粒。 注：如果此时得到的病毒量已足够，可立即进行病毒滴度测定。收集细胞，600×g离心 5分钟沉淀细胞， 去上清后加入最小体积（一般为原始体积的 1/10即 1ml）病毒保存溶液重悬细胞。-200C /370C冻融 3 次，台式离心机上以最大速率离心去除细胞碎片，收集上清，然后进行病毒滴定。 6. -20℃/37℃冻融 3次。 7. 转入 15ml无菌离心管中，台式离心机上以最大速率离心 10分钟，收集上清冻存于-20℃或-80℃。 8. 3个 175cm2培养瓶中各加入 107 293细胞进行培养。 9. 将 3ml细胞裂解液上清加入 12ml DMEM5%中，混匀。移去细胞培养液，每瓶小心加入 5ml混合液，十字 形慢慢晃动混匀 3次，370C 5%CO2孵箱中培养 90分钟。此时 MOI值约为 25。 10. 加入 DMEM5%至 30ml。 11. 再培养 48～72小时。此时 10ml培养液病毒量约为 3×1010～3×1011。若需要，进行 MOI 测定以估计病毒 上海市张江高科技园区科苑路 151号 5201室 邮政编码 201203 Tel:021-50807707 Fax:021-50807708 网站名称: 新基因 网络实名:基因治疗 http://www.sino-gene.cn http://www.sino-gene.com http://www.sino-gene.org http://www.sino-gene.biz 版权声明：该实验方案及知识产权为新基因网站所有，未经授权，不得转载 -2- 滴度。 注：如果此时病毒量已可以满足实验所需，则可立即进入病毒滴定步骤。600×g离心 5分钟收集细胞， 弃上清，加入 1/10原始体积的溶液重悬细胞。-200C /370C冻融 3次，台式离心机上以最大速率沉淀 细胞碎片，收集上清，进行病毒滴定。 12. 移入 50ml离心管中，台式离心机上最大速率离心 10分钟，取出上清保存。 13. 30瓶 175 cm2培养瓶中每瓶各加入 107 293细胞。 14. 将 45ml细胞裂解液上清加入 105ml DMEM5%混匀，从培养瓶中移去培养液，加入 5ml混合液感染细胞， 十字形缓慢晃动 3次混匀，370C培养 90分钟。此时 MOI值约为 25。 15. 加入 DMEM5%至 30ml/瓶。 16. 再培养 48-72小时，此时约有 3×1011～3×1012个病毒。若需要，进行 MOI测定估计病毒滴度。 如果要收集病毒颗粒，先收集被感染细胞，然后重悬在 5ml DMEM5%中。-200C /370C冻融 3次，离 心沉淀细胞碎片。此时 5ml DMEM5%中 3×1011～3×1012个病毒颗粒，浓度为 6×1010～6×1011vp/ml。然 后测定病毒滴度，或者用标准的氯化铯密度梯度离心法纯化病毒。 在 109细胞中扩增病毒可获得大量病毒保存液，而在 1010细胞中扩增则有一定技术性。切勿将扩增 后的病毒保存液再用来感染细胞，因这会大大增加 RCA产生量。有时不得不使用纯化空斑以最大可能降 低 RCA产量。如果已没有纯化的空斑，那么就不得不重新空斑纯化重组病毒，鉴定克隆后再进行扩增。 如果需要大于扩增 4轮后的病毒量，注意请用早期的病毒作为扩增源。比如，用第 2代病毒产生第 3代病 毒。如果没有第 2代病毒，那么必须用第 1代病毒来产生新的第 2代病毒。按这个原则进行扩增可使 RCA 水平尽可能低。 如果用于表达蛋白，则可以收集细胞后根据蛋白特点选择适当方法抽提蛋白。细胞沉淀中一般可提取 1-5mg蛋白，建议在小规模扩增后先测定感染后抽提蛋白的最佳时间，然后再大量扩增蛋白。 腺病毒扩增 第一代 第二代 第三代 第四代 每瓶细胞数 1×105 5×106 1×107 1×107 培养瓶大小 （cm2） 75 175 175 上海市张江高科技园区科苑路 151号 5201室 邮政编码 201203 Tel:021-50807707 Fax:021-50807708 网站名称: 新基因 网络实名:基因治疗 http://www.sino-gene.cn http://www.sino-gene.com http://www.sino-gene.org http://www.sino-gene.biz 版权声明：该实验方案及知识产权为新基因网站所有，未经授权，不得转载 -3- 培养瓶数 24孔板 1孔 1 3 30 感染来源 稀释的空斑 首次扩增后的病 毒保存液 第二代病毒 第三代病毒 每瓶接种量 0.1 mL 0.5 mL或 2.5×107 1 mL 1.5 mL 总培养体积 1 mL 10 mL 90 mL 900 mL MOI 0.01 5 25 25 滴度（VP/mL） 1×108～9 5×108～9 3.3×108～9 3.3×108～9 总病毒量 1×108～9 5×109～10 3×1010～11 3×1011～12