板蓝根多糖对猪繁殖与呼吸综合征疫苗免疫猪T细胞亚群的影响

·中医中药与免疫· 板蓝根多糖对猪繁殖与呼吸综合征疫苗免疫猪 !细胞亚群的影响! 张红英! 赵现敏! 崔保安! 夏平安! 邱! 妍! ! 胡! 梅! 王远阁 （河南农业大学牧医工程学院 河南省动物性食品安全重点实验室，郑州 "#$$$%） " " 中国图书分类号" #$%&’ (&" " 文献标识码" )" " 文章编号" (***+,-,.（&**/）*&+*($,+*, ［摘! 要］! 目的：研究板蓝根多糖对猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗免疫猪 &细胞亚群及抗体的影响。方法：以板蓝根多 糖作为免疫增强剂联合猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗免疫仔猪，通过流式细胞仪检测猪外周血 ’() *、’(" *、’(+ *细胞百分 数，并用 ,-./0法检测猪血清中抗猪繁殖障碍与呼吸道综合征病毒抗体水平。结果：板蓝根多糖能显著提高仔猪的 ’() *、 ’(+ *淋巴细胞的百分数和特异性抗体滴度。结论：板蓝根多糖能显著增强猪对常规灭活病毒疫苗的免疫应答能力。 ［关键词］! 板蓝根多糖；免疫增强剂；仔猪；猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗；&细胞亚群 0112345 61 7#89 6: ! 5;<=6=;>?4@6:5 @: 4A2 @BB;:2 C25=6:52 46 =6C3@:2 C2=C6+ D;34@E2 ?:D C25=@C?46CF 5F:DC6B2 ?442:;?42D E@C;5 E?33@:2 !"#$% "&’()*+’(，!"#, -+.’)/+’，012 3.&)#’，-2# 4+’()#’，521 *.’，"1 /6+，7#$% *8.’)%69 0&::6(6 &; #’+<.: "8=>.’?@A .’? B6C6@+’.@A /6?+D+’6，"6’.’ #(@+D8:C8@.: 1’+E6@=+CA；F6A G.>&@.C&@A &; #’+<.:)?6@+E6? H&&? I.;6CA，"6’.’ 4@&E+’D6，!J6’(KJ&8 "#$$$%，0J+’. ［)<54C?34］! G3（ .?@/）1A & 4BC;1;B<58:1A4 19 ;:D<384 :A 873 :EEBA3 234;1A43 81 ;126:A3 23;21>B68:F3 5A> 234;:25812= 4=A>21E3 5883AB583> F:2B4 F566:A3GI24A6D5：& <=E;716=834 4BC;1;B<58:1A4 :A 873 ;:DH <384 ;732:;7325< C<11> I323 83483> 58 >:99323A8 8:E3 I:87 ;126:A3 23;21>B68:F3 5A> 234;:25812= 4=A>21E3 5883AB583> F:2B4 F566:A3（@??/ F566:A3）I:87 12 I:871B8 .?@/ C= 6=819= I323 83483> C= @??/ 5A8:C1>= 8348 J:8G #25;>45： .@?/ 61B<> :E;21F3 873 ;21;128:1A 19 ’() * 5A> ’(+ * :A 873 ;:D<384 ;732:;7325< C<11> 5A> C1148 873 ;21>B68:1A 19 4;36:5< 5A8:C1>=G J6:3>;5@6:：&73 234B<84 4BDD3483> 8758 .?@/ 61H:A16B<583> I:87 @??/ F566:A3 61B<> 3A75A63 :EEBA3 234;1A43 19 ;:D4G .8 :4 5 ;183A8:5< :EEBA148:EB<5812= 912 ;:D4G ［K2F L6CD5］! .?@/；.EEBA1<1D:6 5>KBF5A8；@:D<384；@126:A3 23;21>B68:F3 5A> 234;:25812= 4=A>21E3 5883AB583> F:2B4 F566:A3；& <=E;716=83 4BC;1;B<58:1A4 ! ! 猪繁殖与呼吸综合征（@126:A3 23;21>B68:F3 5A> 234;:25812= 4=A>21E3，@??/）是由猪繁殖与呼吸综合 征病毒（@126:A3 23;21>B68:F3 5A> 234;:25812= 4=A>21E3 F:2B4，@??/L）引起的一种以母猪繁殖障碍和新生仔 猪呼吸道症状为特征的传染病。@??/L 感染可导 致猪体免疫功能下降，影响疫苗（如猪瘟）的免疫效 果，使猪群对其他病原体的易感性增高。目前对该 病尚无有效的治疗方法，临床上主要使用 @??/L灭 活苗或弱毒苗进行免疫预防，弱毒苗免疫效果较好， "本文为国家“十五”食品安全重大攻关专项（%$$MN0+$"0)$HMM），河 南省杰出人才创新基金（$O%M$$%M$$）项目 !南京农业大学动物医学院，南京 %M$$P# 作者简介：张红英（MPO+ 年 Q），女，在读博士，主要从事分子免疫学 研究； 通讯作者及指导教师：崔保安（MP"+ 年 Q），男，教授，博士生导师，中 国畜牧兽医学会副理事长，主要从事畜禽疫病 病原及分子免疫学研究，,HE5:<：C515A6B: R 73A5BG 3>BG 6A。 但本身存在散毒危险［M，%］。而灭活苗由于引起的体 液免疫应答不完全，免疫效率不高，而且 @??/L 具 有抗体依赖性增强作用（0(,），低滴度的特异性抗 体不但起不到免疫保护作用，还会增强 @??/L的复 制，导致长期、持续性感染，因此提高疫苗免疫的保 护抗体水平和细胞免疫是抵抗 @??/L 感染的关 键［)H#］。 板蓝根多糖可促进小鼠胸腺的发育和胸腺细胞 的增殖，间接地维持胸腺微环境，促进 & 淋巴细胞、 胸腺上皮细胞分泌胸腺素和细胞因子，提高机体的 免疫力，但尚未见用于猪的报道［O］。为了研究在生 产条件下，板蓝根多糖对猪繁殖障碍与呼吸道综合 征（@??/）灭活疫苗免疫猪的免疫调节作用，本研 究将板蓝根多糖作为免疫增强剂联合猪繁殖障碍与 呼吸道综合征灭活疫苗免疫仔猪，通过特异性抗体、 猪外周血 ’() *、’(" *、’(+ *表达细胞百分数指标 的检测，为研究板蓝根多糖的免疫调节机理和 @??/的免疫分子机理提供实验数据，为新型免疫 ·")M· 中国免疫学杂志 %$$S 年第 %) 卷 增强剂的研制提供实验依据。 !" 材料与方法 !# !" 材料 !# !# !" 板蓝根多糖! 板蓝根购自河南省医药公司， 水提醇沉法提取板蓝根多糖，用生理盐水配制成 "# $% & $’，("()湿热高压灭菌 "* 分钟备用。 !# !# $" 试验动物! (* +% ,# 日龄长白二元杂交断 奶仔猪，河南省种猪育种中心提供。 !# !# %" 主要试剂! -../ 抗体检测 012/3 试剂盒， 购自 245066 公司（ -../ " 7 . /89 4:; *<=(>? @3"<#）；淋巴细胞分离液（上海华精生物高科技发 展公司，批号：*#*,*"）；猪繁殖与呼吸综合征油乳 剂灭活疫苗（哈尔滨兽医研究所，批号："**#*(#）； A2BC标记鼠抗猪 C5,8（4DE =#(*?*"）、鼠抗猪 C5=F （4DE =#(#?*"）、鼠抗猪 C5>F（4DE =#"*?*"）、A2BC?抗 小鼠 2%@单克隆抗体购自晶美生物工程有限公司； DGHIJKJ’8 C溶血素（L8J+$FM公司生产，-43((><=）。 !# $" 方法 !# $# !" 动物分组接种! 长白二元杂交断奶仔猪 (" 只，012/3 抗体检测阴性，编号，称体重，0NJ8’’ 处 理，随机分成 , 组，每组 = 只，每只平均体重（(*E # O *E >）+%。分组情况：LP 组猪繁殖障碍与呼吸道综 合征疫苗 Q高剂量板蓝根多糖（* 日龄口蹄疫高 效苗二免 = $’。 !# $# $" 血样采集 ! 分别在免疫前 , 天，免疫后第 S、(=、"=、,=、==、#=、R< 和 S< 天于前腔静脉采血，一 部分不加抗凝剂，分离血清，T "*)冻存，备用；另一 部分用 05B3?U盐作抗凝剂用于 B细胞亚群检测。 !# $# %" 血清 012/3抗体检测! 按照 245066 公司 的猪繁殖障碍与呼吸道综合征病毒抗体检测试剂盒 （-D9JIM8 98G9DVWJHIX8 FMV 98YGI9FHD9K YKMV9D$8 XI9WY FMHIZDVK H8YH +IH）说明书进行，/ & - 值 [ *E = 为阴性， \ *E = 为阳性。 !# $# &" B 细胞亚群检测! 每管加入经过预实验确 定体积的鼠抗猪淋巴细胞 C5,、C5=、C5> 单克隆抗 体 (* !’，相应对照管加入抗小鼠 2%@ 单克隆抗体 (* !’，分别加入全血 #* !’，混匀，室温避光作用 "* 分钟，加入 DGHIJKJ’8 C溶血素 "#* !’，室温避光作用 (* 分钟，加入 -L/溶液 #** !’，混匀，室温避光作用 (* 分钟，( #** 9 & $IM 离心 (* 分钟，弃去上清，再加 入 -L/溶液 #** !’，重悬细胞，流式细胞仪分析。 !# $# ’" 数据分析! 试验数据以 ! O " 表示，统计学 处理采用 /-// ((E # 软件进行方差分析。 $" 结果 $# !" 免疫猪血清中的 012/3 抗体测定! 免疫前 , 天各组猪血清中 -../ 抗体均为阴性（数据未显 示）。, 组猪于免疫后 (= 天均能检测到血清中特异 性抗体，对照组抗体水平要比两个多糖组抗体水平 高，且差异显著；低剂量板蓝根多糖组（L1 组）抗体 水平在免疫后 ==、#=、R< 天显著高于对照组；高剂量 板蓝根多糖组（LP 组）抗体水平在免疫后 "=、,=、 ==、#=、R<、S< 天显著高于对照组（C 组），在第 #= 天，LP组抗体比 C 组抗体高出 S=]，见表 (。由此 可见，板蓝根多糖在免疫 "= 天后能有效刺激猪繁殖 障碍与呼吸道综合征病毒抗原特异性抗体的生成。 $# $" 免疫猪外周血 B 细胞亚群检测! 流式细胞仪 为美国 L8J+$FM CDW’H89，型号 0-2C/61。 $# $# !" 对外周血 C5, Q淋巴细胞的影响 ! 免疫后 S ^== 天 C5, Q细胞在外周血中所占百分数，试验组 均高于对照组（LP组第 "= 天除外），某些时间点差 异很显著。随着时间的延长，板蓝根多糖对 C5, Q 淋巴细胞的影响仍有显著差异，见表 "。 $# $# $" 对外周血 C5= Q淋巴细胞的影响 ! 高剂量 多糖组外周血中 C5= Q细胞除了在第 S、第 S< 天略 高于对照组外，其它时间点均低于对照组，两组之间 差异不显著；低剂量多糖组外周血中 C5= Q细胞除 了在第 "=、第 ,= 天略高于对照组外，其它时间点均 略低于对照组，两组之间差异不显著；L1 组在免疫 后的第 "= 天，外周血中 C5= Q细胞百分数显著高于 LP组，其他时间点差异不显著，见表 ,。 $# $# %" 对外周血 C5> Q淋巴细胞的影响! C5> Q细 胞在外周血中所占百分数，LP 组均高于对照组，在 免疫后第 S、==、S< 天差异显著；L1 组除第 R< 天外 也均高于对照组，在免疫后第 S、"=、== 天差异显著； 两个试验组之间仅在免疫后第 R<、S< 天差异显著， 高剂量组高于低剂量组，见表 =。 $# $# &" 对外周血 C5= Q & C5> Q比值的影响 ! 免疫 后 S 天 外周血中 C5= Q & C5> Q细胞比值 , 组之间差 异显著，高剂量组和低剂量组的比值均低于对照组； 其它时间点 L1组和对照组之间差异不显著（除 == ·#,(·张红英等! 板蓝根多糖对猪繁殖与呼吸综合征疫苗免疫猪 B细胞亚群的影响! 第 " 期 表 !" 免疫后血清中 #$%&’抗体动态（& ( )值，! * "，# +,） -./0 !" -12 345.678 9.:7.;7<5 <= >.6?@2 ( ?<>7;792（&( )）:.;7<> 32;2:67523 /4 #$%&’ .=;2: 766A57B.;7<5（&( ) 9.@A2，! * "，# +,） !"#$%& ’ ( )* ( +* ( ,* ( ** ( -* ( ./ ( ’/ ( 01 23 2’+ 4 23 2)+)）23 .*’ 4 23 2+))） )3 5+* 4 23 2,- )3 //. 4 23 2))） +3 .- 4 23 2))） ,3 /-, 4 23 2))） +3 ’.5 4 23 2))） ,3 *., 4 23 2) 06 23 2-) 4 23 225)）23 *’. 4 23 2+,)）+3 .+/ 4 23 ))+)）+3 -.5 4 23 2))）+） +3 *5+ 4 23 2))） *3 +,, 4 23 2))） ,3 ’,/ 4 23 2))）+） -3 2.) 4 23 2))） 7 23 +*, 4 23 2)) )3 .*, 4 23 2,. +3 )-2 4 23 2-. +3 2., 4 23 2) )3 *+, 4 23 2) +3 *,’ 4 23 2) +3 *.2 4 23 2) ,3 ,,. 4 23 2) 8#9:：7#;%<":( =>9? @#A9"#B C"#$%，)）! D 23 2-；7#;%<":( =>9? 01 C"#$%，+）! D 23 2-E 表 C" 免疫后不同时间点猪外周血 DEF G细胞百分比（H，! * "，# +,） -./0 C" DEF G ?: ?2:7?12:.@ @46?1<84;2>（H，! * "，# +,） !"#$%& ’ ( )* ( +* ( ,* ( ** ( -* ( ./ ( ’/ ( 01 -,3 2 4 *3 , — -,3 5 4 -3 2)） -.3 2 4 .3 ))） */3 / 4 -3 + */3 + 4 ,3 5 -)3 + 4 -3 + -’3 . 4 -3 ) 06 .,3 ’ 4 -3 ))） — *-3 ’ 4 *3 + -23 ) 4 *3 5 -)3 , 4 *3 /)） */3 * 4 *3 - *’3 ’ 4 -3 , -’3 - 4 *3 / 7 *-3 . 4 *3 2 — *’3 . 4 *3 5 *. 4 *3 ’ **3 + 4 *3 . *53 . 4 -3 ) -+3 2 4 -3 . -,3 + 4 *3 ’ 8#9:：7#;%<":( =>9? @#A9"#B C"#$%，)）! D 23 2-；—3 8#9 9:&9:(E 表 F" 免疫后猪外周血 DE, G细胞百分比（H，! * "，# +,） -./0 F" DE, G ?: ?2:7?12:.@ @46?1<84;2>（H，! * "，# +,） !"#$%& ’ ( )* ( +* ( ,* ( ** ( -* ( ./ ( ’/ ( 01 )53 - 4 ,3 - — +’3 / 4 *3 /)） +/3 / 4 -3 2 +23 , 4 -3 - ++3 * 4 -3 + ++3 ’ 4 -3 ) +,3 5 4 .3 + 06 +-3 , 4 *3 2 — )/3 / 4 ,3 ’ +-3 * 4 *3 5 )’3 , 4 *3 ) ++3 2 4 *3 + +)3 + 4 .3 , +-3 - 4 -3 * 7 ++3 5 4 ,3 5 — ++3 + 4 *3 ’ +’3 - 4 -3 + +) 4 .3 + +,3 5 4 -3 2 +.3 + 4 *3 / +*3 * 4 -3 2 8#9:：7#;%<":( =>9? 06 C"#$%，)）! D 23 2-；—3 8#9 9:&9:(E 表 ," 免疫后猪外周血 DEJ G细胞百分比（H，! * "，# +,） -./0 ," DEJ G ?: ?2:7?12:.@ @46?1<84;2>（H，! * "，# +,） !"#$%& ’ ( )* ( +* ( ,* ( ** ( -* ( ./ ( ’/ ( 01 **3 * 4 ,3 .)） — *)3 - 4 -3 ))） ,53 ) 4 -3 2 *+3 . 4 -3 ))） ,.3 + 4 -3 2 ,+3 ’ 4 *3 2 ,,3 5 4 -3 , 06 **3 ’ 4 *3 +)） — ,53 * 4 ,3 / ,/3 * 4 *3 / *+3 2 4 -3 ,)） *23 / 4 .3 ) *)3 ) 4 ,3 /+） *+3 - 4 *3 ,)） 7 ,23 + 4 ,3 / — ,)3 / 4 *3 ) ,*3 , 4 *3 , ,+3 , 4 *3 5 ,*3 5 4 -3 / ,’3 * 4 *3 . ,,3 . 4 *3 5 8#9:：7#;%<":( =>9? @#A9"#B C"#$%，)）! D 23 2-；7#;%<":( =>9? 01 C"#$%，+）! D 23 2-；—3 8#9 9:&9:(E 表 K" 免疫后猪外周血 DE, G ( DEJ G细胞比率（H，! * "，# +,） -./0 K" DE, G ( DEJ G :.;7< 75 ;12 ?7I@2;> ?2:7?12:.@ @46?1<84;2>（H，! * "，# +,） !"#$%& ’ ( )* ( +* ( ,* ( ** ( -* ( ./ ( ’/ ( 01 23 *+ 4 23 25))） — 23 .’ 4 23 25, 23 ’5 4 23 2,) 23 *5 4 23 2+))） 23 .+ 4 23 2+* 23 ./ 4 23 2* 23 ’2 4 23 2+ 06 23 -’ 4 23 2’+)）+） — 23 -+ 4 23 2++)） 23 .* 4 23 2+)） 23 *) 4 23 2,,)） 23 -* 4 23 2,)） 23 -+ 4 23 2))） 23 .2 4 23 2+)） 7 23 ’- 4 23 )2) — 23 ’2 4 23 2-+ 23 52 4 23 2- 23 .- 4 23 2.) 23 .5 4 23 2++ 23 ’2 4 23 2, 23 ’, 4 23 2, 8#9:：7#;%<":( =>9? @#A9"#B C"#$%，)）! D 23 2-；7#;%<":( =>9? 01 C"#$%，+）! D 23 2-；—3 8#9 9:&9:(E 天外）；06组 7F* G H 7F5 G比值低于对照组，且两组 之间差异显著；两个试验组之间差异也显著（除 ** 天外），高剂量组 7F* G H 7F5 G比值低于低剂量组， 见表 -。 F" 讨论 F0 !" 板蓝根多糖对细胞免疫的影响I 7F, G存在于 所有成熟 J 淋巴细胞表面，是鉴定和区别 J 淋巴细 胞的主要标志，而 7F5 G主要是细胞毒性 J 细胞，其 检测结果代表着整个机体细胞免疫功能状态。在试 验中所用的疫苗是 KLLM 灭活油乳剂苗，灭活苗一 般诱导体液免疫，之所以出现 7F5 G J淋巴细胞百分 数增加，可能与试验中接种其他相关弱毒疫苗有关。 本试验是在生产条件下研究板蓝根多糖对 KLLM 灭 ·.,)· 中国免疫学杂志 +22’ 年第 +, 卷 活苗免疫效果的影响，试验动物除了使用 !""# 灭 活苗免疫外，其它疫苗的防疫按正常程序进行。试 验结果说明板蓝根多糖在提高机体体液免疫的同时 还可明显提高机体的细胞免疫功能。 !" #$ 板蓝根多糖对体液免疫的影响$ 板蓝根多糖 和猪繁殖障碍与呼吸道综合征灭活疫苗联合使用， 在免疫的初期（%& 天前）和中后期对 !""# 抗体的 影响有一定差别。在免疫的初期，注射多糖组抗体 水平均低于对照组，而在中期和后期抗体水平均显 著高于对照组，且一直持续到试验结束，这说明板蓝 根多糖可有效提高机体特异性抗体的表达，明显提 高猪群抗体水平。关于在试验初期抗体水平稍微下 降这一现象在以前未见报道，这可能是由于板蓝根 多糖在体内首先刺激 ’淋巴细胞的增殖（由表 ( 可 以看出），淋巴细胞产生的 ’)( 型细胞因子如 *+,& 等随后又刺激了 - 淋巴细胞的活化，经过一个过程 后，机体抗体水平再逐渐升高所致，其内在机理和原 因有待进一步研究。 !" !$ 板蓝根多糖剂量对抗体水平的影响$ 本试验 中高剂量板蓝根多糖组抗体水平在免疫 (& 天后均 高于对照组（多数时间点差异显著），在第 .& 天，-/ 组抗体比对照组抗体高出 0&1，直到试验结束，高 剂量组抗体水平还显著高于对照组。而低剂量板蓝 根多糖组抗体水平在免疫 && 天后才显著高出对照 组。因此，合适的剂量是影响板蓝根多糖提高抗体效 价作用的重要因素，但对不同种属动物、不同个体，究 竟多大剂量为最佳剂量尚有待进一步试验研究。 !" %$ 关于 !""# 免疫抗体产生规律$ 从表 % 可以 看出，免疫后抗 !""#2 特异性 3+*#4 抗体，无论是 试验组还是对照组均出现不同程度的起伏，对照组 在免疫后 && 天抗体下降，之后持续上升；-/ 组在 免疫后 && 天抗体下降，.& 天上升，56 天下降，06 天 又上升；而 -+组在免疫后 56 天抗体下降，06 天上 升。此抗体消长现象不符合常规灭活苗一次免疫后 抗体消长规律。作者曾怀疑猪群中是否有 !""#2 野毒感染，用 "’,!7" 方法对免疫前 8 天、免疫后 8&、&&、.& 天血清中 !""#2 进行检测，结果均未检 测到 !""#2（数据未显示）。 9:;;:<=等［0］的试验显示多毒株 !""#2灭活苗 免疫猪的 3+*#4 抗体在免疫后 (> 天略有下降，8. 天后又持续上升。 本试验所用疫苗为油乳剂苗，试验组和对照组 免疫后 %& 天均能检测到特异性阳性抗体。而使用 8 种油乳剂灭活疫苗，( 种 3+*#4 试剂盒（包括 *?, @3A,3+*#4）检测特异性抗体，结果 ( 种油乳剂灭活 疫苗均没有出现任何抗体应答反应。同是油乳剂 苗，结果却截然不同，可能和疫苗质量、猪体的个体 差异有关。尽管吴延功等未检测到阳性抗体，但初 次免疫后 # B !值却出现一定的升降起伏。 邱德新等［>］对猪接种不同剂量的 !""#2 弱毒 苗后，从免疫后第 %& 天，3+*#4 和微量血清中和试 验（#?）均可检测出 !""#2 抗体，中和抗体从第 %& 天开始出现，抗体水平逐渐上升，到第 &6 C 58 天时， 中和抗体水平达到峰值，然后出现下降趋势，但这种 抗体一直持续到试验结束（0D 天）仍为阳性，在 & 个 不同的免疫剂量组中有 8 组出现些微的抗体波动。 综上所述，本试验中所呈现的抗 !""#2特异性 3+*#4抗体的消长规律是由 !""#2的特殊性所致， 还是未检测到的野毒感染所致有待进一步研究，此 抗体消长与同时接种的其它疫苗有无关系也有待进 一步探讨。 致谢：感谢河南省肿瘤医院病理科马杰主任、赵 婷茹老师在流式细胞分析方面所给予的大力帮助和 支持。 %$ 参考文献 %$ EFGHF;:GH 9 +，+D%N ($ -KPGFI 4，?:F;UFG W，X;FYU:FL:RZ E - !" #$N /FPFIK;KHKVU R)<;;FGHF L:P) TKIR:GF IFTIKMVRP:SF （8,&）：%>0,%6.N 8$ ?:;V[K; @，!;N &$ 母安雄，濮文正，蒋建一 !" #$N & 种猪生殖和呼吸综合征灭活疫苗 免疫效果比较［W］N 中国兽医杂志，(DD8；86（6）：%>,%6N .$ ]KKG J W，9V + +，^:==FI=N >$ 邱德新，陈焕春，吴$ 斌 !" #$N 猪繁殖与呼吸综合征弱毒活疫苗 的安全性和体液免疫研究［W］N华中农业大学学报，(DD&；(8（&）： &80,&&(N ［收稿 (DD5,D5,(D$ 修回 (DD5,D>,D0］ （编辑$ 许四平） ·08%·张红英等$ 板蓝根多糖对猪繁殖与呼吸综合征疫苗免疫猪 ’细胞亚群的影响$ 第 ( 期 板蓝根多糖对猪繁殖与呼吸综合征疫苗免疫猪T细胞亚群的影 响 作者： 张红英， 赵现敏， 崔保安， 夏平安， 邱妍， 胡梅， 王远阁， ZHANG Hong-Ying， ZHAO Xian-Min， CUI Bao-An， XIA Ping-An， QIU Yan， HU Mei， WANG Yuan-Ge 作者单位： 张红英,赵现敏,崔保安,夏平安,胡梅,王远阁,ZHANG Hong-Ying,ZHAO Xian-Min,CUI Bao- An,XIA Ping-An,HU Mei,WANG Yuan-Ge(河南农业大学牧医工程学院,河南省动物性食品安全 重点实验室,郑州,450002)， 邱妍,QIU Yan(南京农业大学动物医学院,南京,210095) 刊名： 中国免疫学杂志 英文刊名： CHINESE JOURNAL OF IMMUNOLOGY 年，卷(期)： 2007，23(2) 被引用次数： 6次 参考文献(8条) 1.Mengeling W L.Lager K M.Vorwald A C Safety and efficacy of vaccination of pregnant gilts against prcine reproductive and respiratory syndrome 1999(07) 2.Botner A.Nielsen J.Oleksiewicz M B Heterologous challenge with porcine reproductive and respiratory syndrome(PRRS) vaccine virus:no evidence of rectivation of previous European-type PRRS virus infectious 1999(3-4) 3.Nilubol D.Platt K B.Halbur P G The effect of a killed porcine reproductive and respiratory syndrome virus(PRRSV) vaccine treatment on virus shedding in previously PRRSV infected pigs 2004(1- 2) 4.母安雄.濮文正.蒋建一 4种猪生殖和呼吸综合征灭活疫苗免疫效果比较[期刊论文]-中国兽医杂志 2003(09) 5.Yoon K J.Wu L L.Zimmerman J J Antibody-dependent enhancement(ADE) of porcine reproductive and respiratory syndrome virus(PRRSV) infection in pigs 1996(01) 6.Hu X C.Huang X D.Xu Y Efect of Baphicacanthus ca-sia(nees)brem lectin on thymus development in mouse[期刊论文]-Chinese Journal of Anatomy 2000(06) 7.William L M.Kelly M L.Ann C V Comparative safety and efficacy of attenuated single-strain and multi-strain vaccines for porcine reproductive and respiratory syndrome 2003 8.邱德新.陈焕春.吴斌 猪繁殖与呼吸综合征弱毒活疫苗的安全性和体液免疫研究[期刊论文]-华中农业大学学报 2004(04) 相似文献(10条) 1.会议论文 张红英.崔保安.赵现敏.邱妍.夏平安.胡梅.王远阁 板蓝根多糖对猪繁殖与呼吸综合征疫苗免疫抗体和 T细胞亚群的影响 2006 为提高猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗的免疫水平,以板蓝根多糖作为免疫增强剂联合猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗免疫仔猪,通过ELISA法检测猪血清 中抗猪繁殖障碍与呼吸道综合征病毒抗体水平,并用流式细胞仪检测猪外周血CD3+、CD4+、CD8+细胞百分数.试验结果表明:板蓝根多糖能显著提高仔猪的 特异性抗体滴度和CD3+、CD8+淋巴细胞的百分数,证明板蓝根多糖能显著增强猪对常规灭活病毒疫苗的免疫应答能力. 2.期刊论文 张红英.崔沛.崔保安.王学斌.陈红英.金钺.赵现敏.赵金凤.Zhang Hongying.Cui Pei.Cui Baoan. Wang Xuebin.Chen Hongying.Jin Yue.Zhao Xianmin.Zhao Jinfeng 板蓝根多糖对PRRS弱毒苗免疫猪抗体和T细胞 亚群的影响 -中国农学

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2008,24(6) 研究板蓝根多糖对PRRSV弱毒苗免疫抗体和猪外周血T细胞亚群的影响.35日龄断奶仔猪16只随机分为4组,将多糖分别以高、低两个剂量和猪PRRSV弱 毒苗同时注射,于免疫后不同的时间点采血,ELISβ方法检测猪PRRSV抗体水平,流式细胞术检测猪外周血中T淋巴细胞亚群的变化.弱毒苗免疫后7d,板蓝根 多糖高剂量组即可检测到PRRSV阳性抗体,而其它组在免疫后14d,均可检测到PRRS阳性抗体,板蓝根多糖对PRRS弱毒苗产生抗体的影响是和剂量密切相关的 ,高剂量能提高抗体水平,低剂量会阻碍PRRSV抗体的产生.板蓝根多糖和PRRS弱毒苗联合使用对猪外周血CD3+2和CD4+2细胞数量的影响不显著,在早期可促 进猪外周血CD88细胞的增殖.合适剂量的板蓝根多糖可以作为免疫增强剂与PRRSV弱毒苗联合使用. 3.学位论文 邱妍 四种中药多糖增强免疫和抗病毒作用及机理研究 2007 在动物生产中，通过应用免疫增强剂提高免疫功能，从而增强对病毒性传染病的抵抗力具有重要意义。然而目前常用的免疫增强剂大多是化学合成 类，存在药物残留隐患。随着人们对食品安全的关注，天然药物显示出一定优势。研究表明，许多中药成分有免疫增强作用。多糖为一类重要的中药成 分，不仅有抗病毒的作用，而且能增加机体的免疫能力，作为免疫增强剂具有安全低毒、不易在畜产品中产生有害残留等优点。本研究选择4种中药多糖 为研究对象，从体内、体外两个方面研究了它们的增强免疫和抗病毒的作用和机理，旨在为开发多糖类免疫增强剂提供理论依据。 试验Ⅰ、四种中药多糖的制备 为了给整个研究准备材料，选择文献报道具有较好免疫增强作用的黄芪多糖(APS)、板蓝根多糖(IRPS)、山药多糖(CYPS)、牛膝多糖(ARPS)4种中药 多糖作为研究对象。采用水煎醇沉法提取，用硫酸蒽酮法测定多糖的含量。结果，APS、IRPS、CYPS、ARPS的提取率(g/Kg)分别为37.4、59.1、53.6、 48.9，糖含量(％)分别为65.8、56.7、73.5、54.9。 试验Ⅱ、四种多糖对新城疫病毒感染细胞能力的影响 为了评价4种多糖的抗病毒作用和机理，将黄芪多糖(APS)、板蓝根多糖(IRPS)、牛膝多糖(ARPS)和山药多糖(CYPS)与新城疫病毒以3种顺序加入培养 的鸡胚成纤维细胞单层上，即先加多糖、先接种病毒、病毒和多糖感作后同时加入，观察细胞病变程度，并用MTT法测定细胞OD值的变化，以评价它们对 新城疫病毒感染细胞能力的影响。结果显示，APS和IRPS的效果较好，而且先加多糖后接种病毒可以减轻病毒造成的细胞病变，且有一定的量效关系。表 明，多糖的临床应用以早给药的效果为好。 试验Ⅲ、四种多糖对鸡脾脏淋巴细胞增殖及一氧化氮的影响 为了研究4种中药多糖增强细胞免疫的作用和机理，将5种浓度的黄芪多糖(APS)、板蓝根多糖(IRPS)、牛膝多糖(ARPS)和山药多糖(CYPS)分别加入到 培养的鸡脾脏淋巴细胞中，培养24h时收集细胞培养上清液，测定一氧化氮含量和一氧化氮合酶的活力；培养48h时用MTT法测定淋巴细胞增殖的变化。结 果表明，适宜浓度的4种多糖均能提高细胞培养液中一氧化氮的含量、一氧化氮合酶的活力和促进淋巴细胞增殖，且效果相当。这可能是多糖提高细胞免 疫功能的机理之一。 试验Ⅳ、四种多糖对鸡外周血淋巴细胞IL-4和IFN-γ的mRNA表达的影响 为了研究4种中药多糖增强免疫的作用和分子机理，用Primer Premier软件

设计

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了一对白介素-4(interleukin-4，IL-4)引物，一对干扰素- γ(interferon-γ，IFN-γ)引物。用荧光定量PCR方法测定4种多糖对鸡外周血T淋巴细胞IL-4、IFN-γ的mRNA表达的影响。结果表明，合适剂量的APS、 IRPS、ARPS和CYPS均能提高淋巴细胞IL-4、IFN-γ的mRNA表达水平，APS、IRPS的效果优于ARPS、CYPS。这可能是多糖增强免疫的分子机制之一。 试验Ⅴ、四种多糖对小鼠腹腔巨噬细胞功能、溶血素及溶血空斑形成的影响及剂量筛选 为了观察4种多糖对非特异性免疫功能的影响并筛选出合适的剂量，选取102只小鼠随机分为17组，16个试验组的小鼠分别腹腔注射4种浓度的黄芪多 糖(APS)、板蓝根多糖(IRPS)、牛膝多糖(ARPS)和山药多糖(CYPS)溶液，对照组注射生理盐水，每天1次，连续3天。第8天分别测定腹腔巨噬细胞吞噬功 能、溶血素及溶血空斑的变化。结果显示，4种多糖均能增强巨噬细胞的吞噬功能，提高溶血空斑及溶血素水平；APS在30 mg·kg<'-1>、IRPs在20 mg·kg<'-1>、ARPS和CYPS在50 mg·kg<'-1>时的效果较好。 试验Ⅵ、四种多糖对免疫雏鸡抗体效价及免疫器官指数的影响 为了研究4种多糖增强特异性体液免疫和非特异性免疫的作用和机理，选取450羽罗曼公鸡随机均分成9组，14日龄用新支二联弱毒苗点眼滴鼻首免、 28日龄肌肉注射二免，在首次免疫的同时，8个试验组分别肌肉注射高、低剂量的黄芪多糖(APS)、板蓝根多糖(IRPS)、牛膝多糖(ARPS)和山药多糖 (CYPS)溶液，对照组注射生理盐水，每天1次，连续注射3次。分别于首次免疫后第7、14、21、28、35、42、49和56天，用微量法测定新城疫HI抗体效价 ；于首次免疫后第10、20、30、40、50和60天，称取体重、脾脏、胸腺和法氏囊的重量，计算免疫器官指数。结果，低剂量的APS、IRPS和高剂量的 ARPS、CYPS均能显著提高ND HI抗体效价和免疫器官指数，且低剂量的APS、IRPS效果较好。表明4种多糖既可以协同疫苗增强特异性免疫，也能促进免疫 器官的发育以提高非特异性免疫。 试验Ⅶ、四种多糖对免疫雏鸡T淋巴细胞增殖及其CD4<'+>、CD8<'+>亚群的影响 为了研究4种多糖体内增强细胞免疫的作用和机理，选取450羽罗曼公鸡随机均分成9组，14日龄用新支二联弱毒苗点眼滴鼻首免、28日龄肌肉注射二 免，在首次免疫的同时，8个试验组分别肌肉注射高、低剂量的黄芪多糖、板蓝根多糖、牛膝多糖和山药多糖溶液，对照组注射生理盐水，每天1次，连 续注射3次。于首次免疫后第10、20、30、40、50和60天，分别用MTT法和流式细胞仪双染色法测定外周血T淋巴细胞增殖和CD3<'+>、CD3<'+>CD4<'+>和 CD3<'+>CD8<'+>T淋巴细胞含量的动态变化。结果表明，4种多糖均能显著促进外周血中T淋巴细胞增殖，提高CD3<'+>、CD3<'+>CD4<'+>T淋巴细胞含量和 CD4<'+>/CD8<'+>的比值，低剂量的APS和IRPS的效果最好。这可能是4种多糖增强细胞免疫的机理之一。 试验Ⅷ、四种多糖对免疫雏鸡黏膜免疫功能的影响 为了研究4种多糖增强黏膜免疫的作用和机理，选取450羽罗曼公鸡随机均分成9组，14日龄用新支二联弱毒苗点眼滴鼻首免、28日龄肌肉注射二免 ，在首次免疫的同时，8个试验组分别肌肉注射高、低剂量的黄芪多糖、板蓝根多糖、牛膝多糖和山药多糖溶液，对照组注射生理盐水，每天1次，连续 注射3次。于首次免疫后第10、20、30、40、50和60天，用E12SA方法测定空肠黏液中SIgA的含量，用免疫组织化学法测定盲肠扁桃体和十二指肠绒毛 SIgA细胞阳性面积。结果，4种多糖均能显著提高肠黏液中SigA的含量和盲肠扁桃体、小肠绒毛的SIgA阳性细胞数，低剂量的APS、IRPS和高剂量的 ARPS、CYPS效果较好。表明，4种多糖可以有效地增强黏膜的屏障作用，从而提高机体的抗感染能力。 4.会议论文 邱妍.崔保安.胡元亮.王德云.张红英 四种多糖对免疫雏鸡抗体效价和T淋巴细胞的影响 2007 随着人们对食品安全的关注,天然药物显示出一定优势。近年来研究发现,许多中药尤其是补益类中药具有免疫促进作用,多糖是其活性成分之一,对 机体的特异性和非特异性免疫功能具有增强作用,其作用机制是通过刺激单核-巨噬细胞系统的吞噬功能、促进淋巴细胞增殖和转化、促进抗体生成、诱 导细胞因子的分泌、激活补体系统等途径实现对机体免疫系统功能的调节。而且多糖是天然产物,对动物及人类安全、无毒副作用,因此受到人们的普遍 重视。本试验从黄芪、板蓝根、怀牛膝和怀山药四种中草药中提取黄芪多糖(APS)，板蓝根多糖((rRPS)，牛膝多糖(aRPS)，山药多糖(CYPS)，配合鸡新 城疫--传染性支气管炎二联疫苗免疫雏鸡，通过测定新城疫抗体效价、T淋巴细胞增殖、外周血CD3十、CDQ+和CDB+淋巴细胞百分率和CD4+/CDB+比值的动 态变化比较四种多糖的免疫增强效果，旨在为开发多糖类免疫增强剂提供理论依据。 5.期刊论文 赵现敏.崔保安.张红英.胡梅.王远阁.李改英.刘炜.ZHAO Xian-min.CUI Bao-an.ZHANG Hong-ying.HU Mei.WANG Yuan-ge.LI Gai-ying.LIU Wei 4种中药多糖对猪脾淋巴细胞增殖的影响 -河北农业大学学报2007,30(3) 为筛选免疫活性较好的中药多糖和研制新型猪用免疫增强剂,用MTT比色法比较了不同浓度的板蓝根多糖(IRPS)、牛膝多糖(ABPS)、山药多糖 (CYPS)和黄芪多糖(APS)等4种中药多糖对猪脾脏淋巴细胞增殖的影响.结果表明,IRPS,ABPS,CYPS,APS均能显著刺激ConA或LPS诱导的猪脾淋巴细胞增殖 (P<0.05),且4种多糖促进猪脾淋巴细胞增殖的作用与多糖浓度有关. 6.期刊论文 储岳峰.李祥瑞.胡元亮 9种中药成分对小鼠免疫细胞活性的影响 -南京农业大学学报2004,27(1) 测定了淫羊藿多糖、黄芪多糖、当归多糖、蜂胶多糖、板蓝根多糖、淫羊藿黄酮、蜂胶黄酮、人参皂甙和黄芪皂甙9种中药成分对小鼠外周血和脾脏 淋巴细胞增殖、腹腔巨噬细胞和脾脏NK细胞活性以及抗体生成细胞数量的影响.结果表明,黄芪多糖、淫羊藿多糖、当归多糖、板蓝根多糖、蜂胶黄酮、 人参皂甙均能显著或极显著促进ConA(刀豆蛋白A)和LPS(脂多糖)诱导的小鼠外周血和脾脏淋巴细胞增殖,黄芪多糖、淫羊藿多糖、当归多糖、蜂胶黄酮、 淫羊藿黄酮和人参皂甙均能极显著或显著提高小鼠腹腔巨噬细胞和NK细胞活性,黄芪多糖、蜂胶黄酮、淫羊藿黄酮、人参皂甙和淫羊藿多糖、黄芪皂甙极 显著或显著增加小鼠的抗体生成细胞数.结果表明,9种中药成分对小鼠免疫细胞具有不同的刺激能力,这种刺激能力可以作为筛选免疫增强剂的指标. 7.学位论文 张红英 3种植物多糖抗猪蓝耳病病毒及免疫增强作用研究 2007 猪蓝耳病即猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由猪蓝耳病毒(猪繁殖与呼吸综合征病毒，porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)引起的一种以妊娠母猪流产、各种年龄猪(特别是仔猪)呼吸障碍为特征的高度传染性疾病。 PRRSV感染导致猪免疫功能低下，对其他致病因子的易感性增加。目前PRRS几乎遍及世界各养猪国家，给世界养猪业造成了巨大的经济损失。对该病尚无 有效的治疗方法，临床上主要使用PRRSV疫苗进行免疫预防。PRRSV弱毒苗免疫效果较好，但本身存在散毒危险，灭活苗虽然安全性较高，但由于引起的 体液免疫应答不完全，导致免疫效率不高，且PRRSV的抗体依赖性增强作用(ADE)，可能会导致染毒猪长期持续性感染。因此提高疫苗免疫的保护性抗体 水平和细胞免疫作用是防制PRRSV感染的关键。 多糖具有增强免疫、抗病毒等功能。本文选用板蓝根多糖(IRPS)、黄芪多糖(APS)和山药多糖(CYPS)分别进行了体外、体内抗病毒作用及免疫试验 ；从细胞水平、分子水平研究了其对PRRSV的免疫调节作用，初步揭示了3种植物多糖免疫调节作用的机理，为PRRSV疫苗免疫增强剂的筛选提供了理论依 据。 1.采用现代的微波处理与传统的水煎醇沉相结合的方法从板蓝根、黄芪、山药中提取植物多糖，并用观察细胞病变(CPE)和中性红法研究了它们对 PRRSV感染Marc-145细胞的影响。结果发现：板蓝根多糖、黄芪多糖和山药多糖的提取率(g·kg-1)分别为59.1、37.4和53.6，糖含量(％)分别为56.7、 65.8和73.5。APS对PRRSV感染具有显著的阻断作用(在0.391 mg·mL-1～0.049 mg·mL-1），在较高浓度时具有显著的直接杀灭作用(P<0.05)。IRPS对 PRRSV感染具有显著的阻断作用(在0.196 mg·mL-1～O.024mg·mL-1安全浓度范围内)和直接杀灭作用(在较高浓度，P<0.05)℃YPS在高浓度区 (0.196mg·mL-1～0.098 mg·mL-1)可以有效阻断PRRSV对细胞的感染作用，对PRRSC无直接杀灭作用。表明这3种植物多糖均可阻断PRRSV对Marc-145细胞 的感染，但对侵入细胞后的PRRSV无抑制作用。 2.通过巨噬缨胞吞噬功能、溶血素及溶血空斑试验研究了不同裁量的3种多糖对小鼠免疫功能的影响，结果证实3种植物多糖均能增强小鼠巨噬细胞 的吞噬功能，提高溶血空斑及溶血素水平。板蓝根多糖、黄芪多糖和山药多糖提高小鼠免疫功能的最佳帮量分别为20mg·kg-1、30 mg·kg-1和50 mg·kg-1. 3.以板蓝根多糖、黄芪多糖和山药多糖作为免疫增强剂分别与PRRSV灭活苗、弱毒苗联合免疫仔猪，用ELISA方法检测免疫猪血清中抗PRRSV抗体水平 ，结果发现，同一种多糖对不同类型的疫苗免疫增强作用不同，其效果和剂量密切相关。板蓝根多糖高剂量对PRRSV灭活苗、弱毒苗均能提高免疫抗体水 平；低剂量板蓝根多糖能提高PRRSV灭活菌、降低PRRSV弱毒菌免疫抗体水平。黄芪多糖能显著提高PRRSV灭活疫苗的免疫抗体水平，高剂量的效果较好 ：与PRRSV弱毒菌同时使用，能抑制PRRSV抗体产生，其抑制作用和剂量密切相关，荆量越大抑制作用越强，特别是在免疫的早期。山药多糖可显著提高 PRRSV灭活苗免疫抗体水平，以低剂量效果较好，山药多糖与弱毒苗同时使用，会降低PRRSV抗体的水平。 4.研究了板蓝根多糖、山药多糖和黄芪多糖对体外培养的猪脾脏淋巴细胞增殖、以及分泌一氧化氮(NO)、IL-2、lL