台湾虫草子实体提取物高分辨液质联用分析

安徽医药AnhuiMedicalandPharmaceuticalJournal2010Mar；14(3) ·265· ◇药学研究◇ 台湾虫草子实体提取物高分辨液质联用 何亚琼1，胡车林2，王金彬2，章能胜2 (1安徽省宿州卫生学校，安徽宿州234000；2安徽省微生物防治重点实验室，安徽农业大学，安徽合肥230036) 摘要：目的分析天然台湾虫草子实体的活性成分。方法用高分辨液质联用分析法，对其甲醇提取物及二氯甲烷和乙酸乙酯 混溶剂提取物进行了成分分析。结果甲醇提取物中主要含有甘露醇、醌茜素、油酸和一种可能为羰基氨基酸类的化合物。对 二氯甲烷和乙酸乙酯混溶剂提取物的分析发现其主要成分可能为醌茜素、麦角甾醇、硬脂酸、软脂酸、油酸、亚油酸、Ternatin、C。： H∞N。O。、C，。HnN。O。、C；。H弛N：O。以及一种挥发性强或难离子化的极性小分子化合物，上述化合物都是首次在台湾虫草子实体 中发现，其中化合物C。：H加N。O。、C。。H，：N。O。和C。，H，。N：O。为3种新化合物。结论通过本研究可以为进一步研究台湾虫草 的活性成分及开发其药用价值打下坚实的基础。 关键词：黄山被毛孢菌丝体；天然台湾虫草子实体；HPLC—DAD．MS；活性成分 HPLC·-DAD--HRMSanalysisofextractsfromfruitingbody ofCordycepsformosana HEYa．qion91，HUFeng—lin2，WANGJin—bin92，ZHANGNeng．shen2 (I．SuzhouHealthSchool，Suzhou234000，China；2．AnhuiProvincialKeyLaboratoryofMicrobial PestControl，AnhuiAgriculturalUniversity，Hefei230036，China) Abstrad：AimToanalyzebioactiveconstituentsfromfruitingbodyofCordycepsformosana．MethodMethanolandmixedsolventof chloroformandethylacekIteextractsfromCordycepsformosanawereanalyzedwithHPLC·DAD·HRMS．ResultsThemethanolextract mainlycontainedmannitol，skyrin，oleicacidandapossiblecarbonylaminoacid．Theethylacetateextractspossiblycontainedskyrin．er- gosteml，stearicacid，palmicacid，oleicacid，linoleicacid，tematin，C12H30N808，C14H32N404，C19H38N206andakindofstrongvolatileor difficultionizedsmallmolecule．ThesecompoundswffrereportedforthefirsttimefromfruitingbodyofCordycepsfor,Msana．Themole— culesC12H30N808，C14H32N404andC19H38N206werenewcompounds．ConclusionThroughthisstudy，itlaysasolidfoundationfor studyingactiveingredientsandmedicalvalueofCordycepsfor．tosana． Keywords：Cordycepsformosana；fruitingbody；HPLG—DAD-HRMSanalysis；bioactiveconstituents 台湾虫草Cordyceps．加册珊彻nKobayasi＆Shimizu于1981 年在台湾被首次发现，2002年安徽农业大学李春如等人发现 该虫草在中国大陆的黄山地区也有分布⋯，并应用经典的分 离方法得到其无性型，经形态和分子生物学方法鉴定该无性 型为一被毛孢属新种，命名为黄山黄山被毛孢Hirsutellahuan- gshanensisC．R．Li，M．Z．Fan＆Z．Z．Li旧t3J。虽然该虫草无性 型菌丝的成分及生物活性已有报道[4．5)，但由于天然虫草数 量较少，有关其子实体的成分尚无研究报道。从其无性型菌 丝成分研究结果来看，该虫草中应含有较多生物活性成分，同 时近年来的的大量研究表明虫草是一含有较多特异生物活性 成分的类群旧o，因此值得对其成分进行深入研究。 1材料 1．1 虫草样品 台湾虫草Cordyceps加刺口加采自安徽黄 山，采后立即用苔藓保湿处理，将鲜样带回实验室处理。 基金项目：国家自然科学基金项目(No30570189，No30871676)；国家 863项目(No2007A^021506) 通讯作者：胡丰林，男，教授，硕士生导师，研究方向：活性物质的提取和 纯化，E—mail：hufenglin@hotmail．eom 1．2仪器2K15·超速离心机为Sigma公司产品：FreeZonel2 冷冻干燥系统购自美国Labonconco公司；梅特勒AE200型电 子天平为中国上海分析仪器厂产品；高分辨液质联用分析仪 (6210TimeofflightLC／MS)，包括Agilent1100高效液相色谱 (HPLC)、二极阵列检测器(DAD)、飞行时间质谱仪(TOF)和 电喷雾离子源(ESI)，购于美国Agilent公司。色谱柱填料为 SynergiHydro，粒径为4斗m，规格为250mill×4．6咖。 1．3仪器试剂 分析纯二氯甲烷购自上海建信化工有限公 司；分析纯乙酸乙酯购自安徽淮南化学试剂厂；分析纯甲醇为 上海一试化学试剂有限公司产品；色谱纯甲醇为美国Tedia 公司产品。 2方法 2．1样品准备将天然台湾虫草子实体与虫体分开，用双蒸 水将子实体洗涤2遍，冻干粉碎备用。为较全面地提取出虫 草中成分，本研究用两种极性溶剂进行提取，其中极性部分以 甲醇为提取剂；中低极性部分采取二氯甲烷和乙酸乙酯1：1 混合溶剂，混合溶剂中二氯甲烷对偶极距变化大的化合物有 较大亲和力，而乙酸乙酯对含氧化合物有较大的亲和力。提 取的料液比按1：20(w／V)进行。提取时先浸泡30rain，40 万方数据 安徽医药AnhuiMedicalandPharmaceuticalJournal2010Mar；14(3) KHz的超声波处理30rain后，浸提24h。过滤后得到的提取 液用氮气吹于，即得粗提物。将其分别用甲醇配成1g·L“ 溶液离心后取上清备用。 2．2液相(HPLC)、质谱(MS}和紫外光谱(Uv)分析用 高效液相一紫外．高分辨质谱联用(HPLC．DAD．HRMS)进行分 析，分析时可同时得到紫外光谱和质谱。样品以HPLC的自 动进样器进样，进样量为3一。色谱柱为SymrsiHydro。洗 脱速度为1．0ml·win～。甲醇提取物的流动相条件为：从0 —3min用100％水洗脱；3—30rain甲醇由0％上升到100％， 然后100％甲醇继续洗脱10win。二氯甲烷和乙酸乙酯混合 溶剂的流动相条件为：从0—30rain甲醇由30％上升到 100％，然后100％甲醇继续洗脱10win。紫外检测为200— 600nm全波长扫描。质谱ESI离子源的雾化气压为35Psi， 氮气流速为12L·win～，温度为325。C；阳离子模式时离子 化电压为4000V，碎片电压250V；阴离子模式时离子化电压 为3500V，碎片电压175V。 3结果 3．1 甲醇提取物分析 将甲醇提取物按前面方法进行 HPLC-HRMS．DAD分析，结果见图1和2。从HPLC图(图1) 上可看到有2个主峰，表明台湾虫草子实体甲醇提取物中主 要有2个具有较强紫外吸收的物质。从RtI．02win峰对应 的紫外光谱可看到该化合物的最大吸收在200砌以下，表明 没有大的共轭体系存在。从Rt25．13win峰对应的紫外光谱 可看到该化合物在222、258、300和461nln下有特征吸收峰， 表明该化合物有大的共轭体系存在。 20 30／rain 圈1 甲醇提取物高效液相色谱及主峰的紫外光谱 从阴离子流图谱(图2)上可看到4个较强的峰，保留时 间分别为1．04、1．51、25．52和26．50rain，其中Rt1．51和 25．52win两峰与HPLC中Rt1．02和25．13rain两峰相对应 (注：HPLC的DAD检测器与MS的TOF检测器间的死时间差 0．4min左右)，另外两峰对应的化合物由于含量低或无紫外 吸收而在HPLC图中无明显吸收峰。该4个离子流峰对应化 合物的质谱如图2所示。 固2 甲酵提取物阴离子流图谱及主峰的质谱 质谱分析显示：Rtl．04rain峰对应的质谱离子分别为 C5H8N04一(误差0．55ppm)和C4H8N02一(误差0．51ppm)， 可能分别为(M—H)一和(M-COOH)一，对应的可能分子式为 C，H。N0。。经天然产物数据库查询发现，该分子式对应有多 个氨基酸类化合物，包括具有较强生物活性的羰基氨基酸类 化合物。 Rt1．51win峰对应的质谱离子分别为C。H。，06一(误差 0．21ppm)和c6H904～(误差2．31ppm)，可能分别为(M- H)一和(M-2H20．H)一，对应的可能分子式为C。H。。06。资料 查询发现该化合物的色谱保留时间、分子式、质谱碎片和紫外 光谱等都和虫草菌中普遍存在的甘露醇非常一致一1。 Rt25．52rain峰对应的质谱离子为c30H。，010一(误差 0．18ppm)，可能为(M—H)一，对应的可能分子式为C，oH，80舯 资料查询发现该化合物的色谱保留时间、分子式和紫外光谱 等都和本实验室先前在黄山被毛孢中鉴定的化合物醌茜素 (skyrin)非常一致u 3 o Rt26．50win峰对应的质谱离子为C18H3102一(误差0．04 ppm)，可能为(M·H)’，对应的可能分子式为c。。H，：O：。根据 该化合物极性低(保留时间长)、紫外吸收弱及分子式可初步 判断该化合物可能是亚油酸。 上述化合物在阳离子流上对应的峰都很弱甚至没有峰， 表明这些化合物都是偏酸性化合物，易形成阴离子，此与上述 推断化合物性质一致，进一步证明了上述推断的正确性。 3．2二氯甲烷和乙酸乙酯混合溶剂提取物分析将二氯甲 烷和乙酸乙酯混合溶剂提取物按前面方法进行HPLC．HRMS— DAD分析，结果见图3、4和5。从HPLC图(图3)上可看到有 3个主峰，表明台湾虫草子实体二氯甲烷和乙酸乙酯混合溶 剂提取物中主要有3个具有较强紫外吸收的物质。从Rt 2．09rain峰对应的紫外光谱可看到该化合物的最大吸收在 205砌以下，表明没有大的共轭体系存在。该化合物由于在 阴离子和阳离子质谱上都无对应吸收峰(图4和5)，表明它 可能是一挥发性极强或难离子化的小分子化合物。从Rt 17．06min峰对应的紫外光谱与甲醇提取物中的醌茜素完全 一致，都在222、258、300和4611'1111下有特征吸收峰。Rt 28．15rain峰对应的紫外光谱与普遍存在于真菌中的麦角甾 醇一致，通过样品对照，发现保留时间及紫外光谱都与麦 角甾醇完全一致，可初步判断为麦角甾醇。 从阴离子流图谱(图4)上可看到5个较强的峰，保留时 间分别为17．38、20．55、21．95、22．08和23．96rain，其中仅Rt 17．38rain峰与HPLC中Rtl7．06峰对应，其它峰对应的化合 物由于含量低或无紫外吸收而在HPLC图中无明显吸收峰。 该5个离子流峰对应化合物的质谱如图4所示。 Rt17．38min峰对应的质谱离子为C30H．，OIo。(误差0．41 ppm)，对应的可能分子式为c∞H180m。该化合物的来源、分子 式和紫外光谱等都和甲醇提取物中鉴定的醌茜素(skyrin)完全 一致，显然它就是醌茜素。从本研究来看醌茜素在甲醇、二氯 甲烷和乙酸乙酯混合溶剂中都有较好的溶解性。 Rt20．55win峰对应的质谱离子为C18H3102。(误差0．04 ppm)，对应的可能分子式为C，。H匏02。根据该化合物极性低 (保留时间长)、紫外吸收弱及分子式可初步判断该化合物 =日_皇．00皇喇0■0呐口《 ∞1u=ot釜丽暑主三f盈q苎蚤IIJluI 万方数据 安徽医药ArthuiMedicalandPharmaceuticalJournal2010Mar；14(3) ·267· 图3二氯甲烷和乙酸乙酯混合溶剂提取 物高效液相色谱及主峰的紫外光谱 图4二氯甲烷和乙酸乙酯混合溶剂提取 物阴离子流图谱及主峰的质谱 可能是亚油酸。 Rt21．95min峰对应的质谱离子为C1。H，10；一(误差o．15 ppra)，对应的可能分子式为C，。H，：O：。根据该化合物极性低 (保留时间长)、紫外吸收弱及分子式可初步判断该化合物可 能是软脂酸。 Rt22．08min峰对应的质谱离子为C1sH”02’(误差0．15 ppm)，对应的可能分子式为c。。H弘O：。根据该化合物极性低 (保留时间长)、紫外吸收弱及分子式可初步判断该化合物可 能是油酸。 Rt23．96min峰对应的质谱离子为C。。H350z一(误差Q．15 ppm)，对应的可能分子式为C。。H拍05。根据该化合物极性低 (保留时间长)、紫外吸收弱及分子式可初步判断该化合物可 能是硬脂酸。 从阳离子流图谱(图5)上可看到4个较强的峰，保留时 间分别为9．77、13．55、16．93和24．52min，这些蜂在HPLC图 中和阴离子流图中都无明显对应吸收峰，表明它们紫外吸收 弱或含量低同时不易离子化成阴离子。 Rt9．77rain蜂对应的质谱离子分别为C12H，lNsOs+(误 差0．39ppm)和C．2H30N808Na+(误差1．50ppm)，对应的可 能分子式为C。：H粥N。O。。从分子式及离子特点等来看，该化 合物应是一不饱和度低，易形成阳离子的生物碱类物质。天 然产物数据库查询发现这是一新的分子。 Rt13．55rain峰对应的质谱离子分别为C37H醴N，08+(误 差0．12ppm)和C"H67N708Na+(误差2．41ppm)，对应的可 能分子式为C，，H。，N，O。。根据该化合物极性较低、紫外吸收 弱及分子式可推断该化合物可能为虫草中较常见的环肽类化 合物。天然产物数据库查询发现一种环肽类抗生索Tematin 的性质与本研究分子较相似，该化合物最初分离于D／dymo- cladiumternatum的发酵液中o Rt16．93min峰对应的质谱离子为C，。H33N404+(误差 0．03ppm)，对应的可能分子式为c，。H皱N。04。从分子式及离 子特点等来看，该化合物应是一不饱和度低，易形成阳离子的 生物碱类物质。天然产物数据库查询发现这是～新的分子。 Rt24．52rain峰对应的质谱离子分别为C。9H39N206+(误 差0．41ppm)和C一9H39N20。Na+(误差1．53ppm)，对应的可 能分子式为C。，H，sN：04。从分子式及离子特点等来看，该化 合物应是一不饱和度低，易形成阳离子的生物碱类物质。天 然产物数据库查询发现这是～新的分子。 4讨论 从上面分析初步推断天然台湾虫草子实体的甲醇提取物 及二氯甲烷和乙酸乙酯混溶剂提取物中可能畲有甘露醇、醌 图5二氯甲烷和乙酸乙酯混合溶剂提取 物阳离子流图谱及主峰的质谱 茜素和麦角甾醇，同时可能含有硬脂酸、软脂酸、油酸、亚油 酸、一种分子式为C，H。NO。的羰基氨基酸类化合物、环肽类 抗生素Ternatin、C12H30N809、C141432N404、C19H38N206以及一 种挥发性强或难离子化的极性小分子化合物。这些化合物都 是首次在台湾虫草子实体中发现，其中化合物C。：H∞N。O。、 C14H32N404和C19H38N206为3种新化合物。 上述化合物中甘露醇普遍存在于虫生真菌中，是真菌孢 子的抗逆和储藏物质；麦角甾醇是真菌细胞壁的组成部分；脂 肪酸及其酯也在真菌生理中也具有重要作用旧41，但这些物 质从活性成分开发的角度来看意义较小。相比较而言，具抗 肿瘤作用的醌茜素垮’6J、环肽类抗生素TernatinoioJ、羰基氨基 酸类物质以及3种新型生物碱，可能在新型生物活性物质的 开发中具有较大的意义，值得深入研究。 参考文献： 【1]LiCR，FanMZ，HuangB，eta1．ThegenusCordyeepganditsallies fromAnhui[J]．Mycosystema，2002，2l(2)：167-71． [2]李春如，夏成润，林英任，等．台湾虫草的被毛孢无性型新种及 其对黄粉虫的侵染研究[J]．菌物系统，2005，24(3)：349—55． [3]左登平，李春如，黄勃．等．台湾虫草及其无性型关系的分子 确证【J]．菌物学报，2008，27(2)：224—9． [4]何亚琼，胡丰林，左登平，等．一种被毛孢中天然色素的提取分 离和结构鉴定[J]．食品发酵与工业，2007．33(11)：121-4． [5]何亚琼，胡丰林，左登平，等．一株被毛孢菌丝体中具抗肿瘤活 性组分的分离纯化和液质联用分析[J]．菌物学报．2008，27 (30)：431—8． [6]胡丰林，李增智．虫草及相关真菌的次生代谢物及其活性[J]． 菌物学报，2007，26(4)：607—32． [7]HuFL，HeYQ，HuangB，ela1．Secondarymetabolitesinasoybean fermentationbrothofPaecilomycesmilitaris[J]．FoodChemistry， 2009，116：198—201． 【8]LiuQ，YingSH，FengMG，eta1．Physiologicalimplicationofintra— collul卑rtrehaloseandmannitolchangesinrespormeofentomopatho- geniefungusBeau∞dabassianatothermalst嗍[J]．Antoniev趴 Leeuwenhoek．2009。95：65—75． [9]KhachatouriansGG．Biochemistryandmolecularbiology0fento- mopathogenicfungi[J]．Berlin：SpringVerlag，1996：336—9． 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