GB 26351-2010-T 蜚蠊抗药性检测方法 德国小蠊不敏感乙酰胆碱酯酶法

ICs 11。020 CO5 中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准 GB/T26351-ˉ 2010 蜚蠊抗药性方法 德国小蠊不敏感乙酰胆碱酯酶法 Test1Ⅱethods oF cockroach resistance to iⅡsecticidesˉˉ Test1nethods oF insensitive acetylchoIinesterase For Blattella germaⅡica zO11-0卜14发布 2011-05-01 实施 中华人民共和国卫生部 中国国家标准化管理委员会 发 布 GB/T2635⒈-2010 前 言 本标浪按照 GB/T1.1-⒛ 09给出的规则起草。 本标准由中华人民共和国卫生邯提出并归口。 本标准起草单位:北京市疾病预防控制中心、中国农业大学、中国人民解放军军事医学科学院傲生 物流行病研究所。 本标准主要起草人:曾晓亢、高希武、马彦、钱坤、佟颖、梁沛、赵肜盲。 ????? www.bzfxw.com ???? www.bzfxw.com 蜚蠊抗药性检测方法 德国小蠊不敏感乙酰胆碱酯酶法 1 范围 本标准规定了德国小蠊 ( 酶(AChE)的检测方法。 本标准适用于德国 学检测。 2 术语和定义 下列术语和 2.1 乙酰胆碱 能够抑制 mmol/L。 2.2 单位为 mol/L或 F1代 F1 从现场捕 3 试虫 现场采集德 条件下储存不超过 ld,-20℃条件下 4 试剂 4.1 磷酸氢二钠(Naz HPo‘); 4.2 磷酸二氢钾(KH2Po4),化学窕 4.3 曲拉通 Ⅺ100(Triton X-100)。 4.4 乙酰硫代胆碱(ATCD,分析纯。 4.5 5,5’-二硫双硝基苯甲酸(DTN0,分析纯。 4.6 磷酸缓冲液(0.1mol/L,pH7.5PBs):称取 30.18g NazHPO4·12H20和 2.16gKH2Po4,蒸馏 水定容至 1000mL。 4.7 DTNB-乙 醇显色剂 :称取 12。 4mg DTNB,溶于 125mL95%乙醇中,加人 50mL磷酸缓冲液 ,最 后用蒸馏水定容至 250mL,4℃避光保存。 4.8 ATCh溶液 :称取 28.9mg ATCh溶于 10mL蒸馏水中,— zO℃避光保存。 4.9 ATC卜DTNB混合溶液 :称取 75mg ATCh和13mg DTNB,用100mL磷酸盐缓冲液溶解。 1 GB/T2635⒈-2010 甲酸酯类药剂抗 www.bzfxw.com GB/T2635⒈-2010 5 分光光度法 5.1 仪器设备 5.1.1 分光光度计。 5.1.2 恒温水浴箱。 5.1.3 玻璃组织匀浆器。 5.1.4 台式冷冻离心机(离心力 10000g以上)。 5.1.5 加液器。 5.2 杀虫药剂的配制 用丙酮或其他的有机溶剂将杀虫药剂配制成母液,实验前用磷酸盐缓冲液稀释到区分浓度(常见杀 虫药剂对敏感德国小蠊品系乙酰胆碱酯酶的区分浓度参见附录 A)的 2倍 ,溶剂在反应体系中的最终浓 度应小于 1%。 5.3 操作步骤 5.3.1 将单头德国小蠊雄性成虫 ,放人 4℃预冷的玻璃组织匀浆器中,加 人 1mL4℃预冷的磷酸盐缓 冲液(pH7.5,0.1mol/L,含0.1%Triton Ⅺ100),充分匀浆。 5.3.2 匀浆液在 4℃ ,10,000g,离心 15min,弃沉淀 ,取上清即为酶液 ,冰浴保存各用。 5.3.3 取 4支试管 ,分别加人上述酶液 0.1mL,在其中 3支试管中分别加人杀虫药剂水溶液 0.1mL, 使其终浓度达到区分浓度 ,第 4支试管中加人 0.1mL磷酸盐缓冲液作为无药剂对照管 ;另 取 1支试管 加人 0.2mL磷酸盐缓冲液 ,作为空白对照。 5.3.4 将上述 5支试管于 30℃保温 5min,再分别加人 0.1mL乙酰硫代胆碱(ATCh),30℃继续保 温 15min后,加入 1.6mL DTNB一乙醇显色剂。 5.3.5 以空白对照调分光光度计 0点 ,于 狃2nm波长下测定无药剂对照管和药剂处理管的光密度值 (OD412)。 5.3.6 按上述方法检测 100头德国小蠊。 5.4 结果表述 测定 AChE残存活性的计算见公式(1)。 E=2坠 ×100% ⋯⋯⋯¨⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯(1)OD 式中: E ——AChE残存活性 ; oDt——药剂处理管平均光密度值 OD。12; oDc——无药剂对照管平均光密度值 oD。12。 5.5 判别标准 AChE残存活性大于 20%为不敏感的 AChE。 具有不敏感 AChE的个体为对有机磷或氨基甲酸酯 类药剂具有抗性的个体 ,抗性个体在种群中的比例达到 10%时为抗性种群。 2 ????? www.bzfxw.com ???? www.bzfxw.com GB/T26351-ˉ2010 6 酶标仪法 6.1 仪器设备 6.1.1 酶标仪。 6.1.2 恒温水浴箱。 6.1.3 玻璃组织匀浆器。 6.1.4 台式冷冻离心机(离心力 10000g以上)。 6.1.5 加液器。 6.2 杀虫药剂的配制 用丙酮或其他的有机溶剂将杀虫药剂配制成母液,实验前用磷酸盐缓冲液稀释到区分浓度(常见杀 虫药剂对敏感德国小蠊乙酰胆碱酯酶的区分浓度参见附录 A)的 2.5倍 ,溶剂在反应体系中的最终浓度 应小于 l%。 6.3 操作步骤 6.3.1 将单头德国小蠊雄成虫,放人 4℃预冷的玻璃组织匀浆器中,加人 1mL奎℃预冷的磷酸盐缓冲 液(pH7.5,0.1mol/L,含0.1%Triton Ⅺ100),充分匀浆。 6.3.2 匀浆液在 4℃ ,10ooo g离心 15min,弃沉淀,取上清即为酶液,冰浴保存备用。 6.3.3 在酶标板中的4个孔中分别加人上述酶液 0.1mL,在其中 3个孔中分别加人一定浓度的杀虫 药剂溶液 0。 05mL,使其终浓度达到区分浓度,第 4个孔中加人 0。 05mL磷酸盐缓冲液作为无药剂对 照管,在 30℃保温 5min后,分别加人 0.1mL ATCh~DTNB混合溶液,在 狃2nm测定 5min时间动 力学曲线,曲 线的斜率作为反应初速度(v)。 计算平均值。 6.4 结果表述 测定 AChE残存活性的计算见公式(2)。 E=垦 ×100% ⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯(2) Vc 式中 : E ——AChE残存活性 ; vt ——药剂处理组平均反应初速度 ; vc——无药剂对照组平均反应初速度。 6.5 判别标准 AChE残存活性大于 20%为不敏感的 AChE。 具有不敏感 AChE的个体为对有机磷或氨基甲酸酯 类药剂具有抗性的个体 ,抗性个体在种群中的比例达到 10%时为抗性种群。 www.bzfxw.com GB/T26351-2010 附 录 A (资 料性附录) 常用杀虫药剂对敏感傅国小蛴品系乙酰胆谐酝酶的区分浓度 表 A。 1给出了敌敌畏和残杀威对敏感德国小蜾品系乙酰胆碱酯酶的区分浓度。 表 A。 1 常用杀虫药剂对敏盛德国小臻品系乙酰胆碱酯酶的区分浓度 ?? ?? ?? ? ? ? ? 〓 ?? ? 杀虫药剂 区分浓度 LG。 md/L 敌敌畏(DDVP) 猡宅豸、厉1(pr°poxur) o.056×10ˉ4 4.69X10ˉ 4 注:敏感品系来自北京市疾病预防控制中心医学昆虫饲荞室,测 定时间为 2005年 3月 。 版权专有 侵权必究 +揖劳:155066· 1-42182 GB/T 26351-2010 定价 : l0。00元 ????? www.bzfxw.com ????