23种植物提取物对胡椒瘟病病原菌的抑制作用

i 镰妁 2010，36(6)：128—131 23种植物提取物对胡椒瘟病病原菌的抑制作用 苟亚峰 ， 刘爱勤 ， 孙世伟 ， 桑利伟 ， 李志刚。 (1． 家再要热带作物工程技术研究中心，儋州 571737； 2．中国热带农业科学院香料饮料研究所，万宁 571533) 摘要 为了筛选对胡椒瘟病菌具有较好抑菌活性的植物提取物，采用菌丝生长速率法测试了23种热带特有植物提 取物对胡椒瘟病菌的抑菌作用。结果明，供试植物干样提取物浓度为 10 mg／mI 时，圆滑番荔枝、黄皮、蔓马缨 丹、益智、假菊和酸豆提取物的抑菌活性较好，其中圆滑番荔枝提取物的抑菌率高达 100 ；当浓度为 5 mg／mI 时， 圆滑番荔枝、黄皮和蔓马缨丹提取物的抑菌率仍超过 5O ，分别为 82．94 、78．39 和74．19 ，其对病原菌茵丝生 长的 E 。分别为 1．647 l、2．966 2、2．953 4 mg／mL。 关键词 植物提取物； 胡椒瘟病菌； 抑菌活性 中图分类号： S 482．28 文献标识码 ： A DOI： 10．3969／j．issn．0529—1542．2010．06．029 Inhibitory effects of 23 plant extracts against Phytoph thora capsici Gou Yafeng 。 。， Liu Aiqin ， Sun Shiwei ， Sang Liwei ， Li Zhigang (1．State Engineering and Technology Research Center r Important Tropical Crops，Danzhou 571737，China； 2．Research Institute ofspice and Beverage Crops，CATAS，Wanning 571533，China) Abstract To screen the plant extracts against Phytophthora capsici，the inhibitory activity of 23 tropic plant extracts were tested using mycelial growth rate method．The results showed that the inhibition rate of 10 mg／mL Annona glabra Linn．，Artabotrys hexapetalus(Linn．f．)Bhandari，Clausena lansium (Lour．)Skeels，Lantana morttevidensis Briq．，Alpinia oxyphylla Miq．，P／per sarmentosum Roxb．and Tamarindus indica Linn．extracts had high inhibition rate to P．capsici，among which A．glabra had an inhibition rate up to lO0％ ．When the con— centration was 5 mg／mL，the inhibition rates of A．glabra，C．1ansium and L．morttevidensis extracts were 82．94％，78．39％ and 74．19％，respectively．The ECj。values of them were 1．647 1，2．966 2 and 2．953 4 rag／ mL，respectively． Key words plant extraction； Phytophthora capsici； inhibitory activity 由疫霉属病原菌 PhytophthOFa capsici引起的 胡椒瘟病是一种传染力很强的土传病害，常在雨季 时发生，感病严重的胡椒可整株萎蔫枯死，造成严重 的经济损失。国内刘进平l1，邢谷杨[2 等人综述了 胡椒瘟病的防治方法，但以化学防治技术为主。黄 家峰利用 1：2：100的波尔多液、1．5 硫酸铜溶液和 硫酸铜粉进行胡椒瘟病防治试验 一。Kasim R研究 了甲霜灵、疫霜灵等对胡椒瘟病的室内和大田防治 效果_lr。由于长期使用化学农药不仅容易引起抗药 性，而且容易破坏胡椒园的生态环境和降低胡椒产 品品质。因此，本研究针对胡椒瘟病病原菌筛选了 18科 23种植物乙醇提取物的抑菌活性，以期寻找 到能较好防治胡椒瘟病的植物，为开发一种新的植 物源杀菌剂奠定基础。 l 材料与方法 1．1 试验材料 1．1．1 供试病原菌菌种 供试病原菌由中国热带农业科学院香料饮料研 究所病理实验室提供。 1．1．2 供试植物 供试的 18科 23种植物分别采自中国热带农业 收稿 日期： 2009—09—30 修订日期： 2010—0l 12 基金项目： 国家科技支撑}[-~JJ项 目(2007BAD48B06—06)；海南省自然科学基金项目(309055) 联系方式 E mail：gouyf2007@163．corll；Tel：0898—62552070 36卷第 6期 苟 峰等：23种植物提取物对胡椒瘟病原菌的抑制作刚 · 129 · 科学院香料饮料研究所和中国医学科学院药用植物 研究所海南分所内，具体植物名录见表 1。 表 1 供试植物样品 科名 种名 夹竹桃科 火戟科 萝摩科 姜科 爵床科 马鞭草科 茜草科 五加科 罗汉松科 玉蕊科 番荔枝科 楝科 胡椒科 芸香科 棕榈科 百合科 蝶形花科 苏木科 夹竹桃(Nerium indicum MI11．) 锡兰叶下珠(Phyllanthus myrtifolius Moon) 红桑 (Acalypha wilkesiana Muel1．一Arg．) 牛角瓜[Calotropis gigantean(L|)Dryand．] 益智(Alpinia oxyphylla Miq．) 硬枝老鸦嘴[Thunbergia erecta(Benth．)Roxb．] 蔓马缨丹(Lantana montevidensis Briq．) 栀子(Gardenia jasminoides Ellis) 鹅掌藤(Schefflera arboricola Hayata) 竹柏[Nageia nagi(Thunb．)()I Kuntze] 玉蕊~Barringtonia racemosa(L )Spreng．] 圆滑番荔枝(Annona glabra nn．) 番荔枝(A squamosa L．) 鹰爪EArtabotrys hexapetalus(L f．)Bhandari] 苦楝(Melia azedarach L．) 假萄(Piper sarmentosum Roxb．) 黄皮~Clausena lansium (Lour．)Skeels] 槟榔(Areca catechu L．) 山菅兰~Dianella ensifolia(L．)13(2．] 鸡冠刺桐(Erythrina crista—galli L．) 凤凰木[Delonix regia(goj．)RaL] 酸豆(Tamarindus indica LiIn ) 洋金凤[Caesalpinia pulcherrima(L．)Sm．] 1．2 供试植物提取物的制备 供试植物样品的前处理和提取均参照冯俊涛 等 j的方法，稍有改进。将采集植物样品在室内晾 1～2 d后分别放入 55～60℃恒温箱内烘干，粉碎， 过4O目筛，加入约 l0倍量(w／v)的分析乙醇，置避 光处，冷浸提时间分别为 72、48、24 h，合并滤液，浓 缩得乙醇提取物浸膏，称重，计算提取率，并于 0～ 4℃冰箱中密封保存备用。 1．3 抑菌活性测定 采用菌丝生长速率抑制法l6 。每种植物提取 物重复 3次。具体做法为：称取 1 g乙醇提取物浸 膏，先用 1 mL乙醇溶解，再用无菌蒸馏水定容至 10 mL，制成浓度为 100 mg／mI 的乙醇提取物母 液。再用无菌蒸馏水稀释制成浓度为 5O mg／mL 的乙醇提取物。然后将培养基融化后冷却至 50℃ 左右时，把 4 mL不同浓度的植物提取物分别与 36 mL／瓶的 PDA培养基混合，摇匀后分装于 3个 直径为 9 cm的培养皿中，静置，制成含乙醇提取物 浓度分别为 10 mg／mL和 5 mg／mL的 PDA含毒 培养平板。以加入等体积的乙醇无菌水 PDA培养 平板为对照。取菌落直径为 6 mm、培养 7 d的胡 椒瘟病病原菌的外层菌块放置于培养平板中央，在 25～28℃、光照和黑暗交替的条件下培养。待对 照菌落外缘接近培养皿边缘时，用十字交叉法分别 测量菌落直径，求其平均值，按下式分别计算抑 菌率。 抑菌率一 对照菌落生长直径一处理菌落生长直径 对照菌落生长直径 1．4 室内抑菌毒力(EC5。)测定 × 100 。 选择对胡椒瘟病菌菌丝生长抑菌活性较好的几 种植物提取物进行室内抑菌毒力测定。将供试的植 物提取物分别稀释为 5个浓度，按一定比例加入到 融化好的 PDA培养基中，参照 1．3中的方法进行， 每处理 3次重复。利用生长速率法筛选不同提取物 的适宜浓度梯度，并在适宜浓度梯度下进行提取物 对病原菌的毒力测定，计算出各种提取物的抑制中 浓度 (EC5。)。 1．5 试验数据统计分析 试验结果用 Microsoft Excel软件进行整理；经 DPS统计软件进行多元分析；将菌丝生长抑制率换 成几率值(．y)、药剂浓度转换成以 10为底的对数值 ( )，作毒力 回归直线，求出毒力回归方程( —a+ bx)和相关系数(R)，计算抑制中浓度(ECj。)。 2 结果与分析 2．1 供试植物乙醇提取率 23种供试植物提取物的制备均采用冷浸提的 方法提取，并减压浓缩至浸膏，得各植物的提取率如 表 2所示。 表 2 供试植物提取率 供试植物 提取率／ 供试植物 提取率／ 供试植物 提取率／v 槟榔 27i 29 牛角瓜 13．73 番荔枝 17．96 黄皮 2最52 益智 l1．1O 鹅掌藤 8．31 假琦 14．38 栀子 l3．84 蔓马缨丹 7．O2 lh菅兰 22．11 洋金风 15．24 鸡冠刺桐 1O．3O 苦楝 l7．16 竹柏 23．95 硬枝老鸦嘴 l 8_96 夹竹桃 34．98 玉蕊 8．08 锡兰叶下珠 19．O9 凤凰木 18．67 红桑 18．9l 圆滑番荔枝 l7．15 酸豆 32．57 鹰爪 1O．54 1)供试植物提取率是指供试植物采集部位的提取率。 从表 2可以看出，不同植物的乙醇提取物提取 率差异较大，这与各种植物所含的化合物不同有关。 夹竹桃和酸豆 的提取率较高，分别为 34．98 和 靴一叶枝叶叶茎枝茎枝叶籽籽叶叶叶叶茎叶黩茎枝叶叶枝 · 13O· 主氢钧‘氛船 201O 32．57 ；蔓马缨丹、玉蕊、鹅掌藤等植物的提取率较 低，分别为 7．O2 、8．08 和8．31 。 2．2 供试植物提取物对菌丝生长的抑制作用 由表 3可知，在提取物浓度为 10 mg／mL时， 供试植物提取物对胡椒瘟病菌菌丝生长抑菌率 达 50 以上的植物有 7种，分别为圆滑番荔枝、 黄皮、蔓马缨丹、鹰爪、假药、酸豆和益智，其中圆 滑番荔枝、黄皮 和蔓马缨丹提取物 的抑菌率较 高，分别为 1O0 、87．55 9／6和 85．66 。当提取 物浓度为 5 mg／mL时，黄皮和蔓马缨丹提取物对 病原菌的抑菌率仍超过 50 ，分别为 78．39 和 74．19 。 2．3 几种植物提取物对胡椒瘟病菌的室内抑菌毒 力(EC50)测定 对试验 2．2中抑菌活性较好的圆滑番荔枝、黄 皮和蔓马缨丹等 3种植物提取物进行室内抑菌毒力 测定，结果见表 4。 从表 4中可以看出，3种植物提取物对胡椒瘟 病菌的EC5。在 1．647 l～2．953 4 mg／mL之问，其 中圆滑番荔枝提取物对胡椒瘟病菌的 EC5。最低， 为 1．647 1 mg／mL。以 E 。的大小作为判定供试 植物抑菌活性的参考，则可以看出圆滑番荔枝提取 物对胡椒瘟病菌菌丝生长具有较强的抑制作用。 由图 1中3种植物提取物对胡椒瘟病菌菌丝生长 的毒力曲线可以看出，3种植物提取物对胡椒瘟病 菌的抑菌活性随着供试植物提取物浓度的增大而 增大。 趔 褥 褂 楹 是 趔 褥 褥 坦 曩 表3 供试植物提取物对病原菌的抑菌率测定结果 供试植物 抑菌率／％ 10 mg·mL一 5 mg·mL～ 1)抑菌率为 3次重复的平均值；“一”表示提取物对供试病原菌菌 丝生长具有促进作用；数据后标有相同字母表示在 5 水平上 差异不显著(DMRT)。 表4 3种植物提取物对胡椒瘟病菌 菌丝生长的毒力测定结果 取物0毒力回归方程( 一)相关系数(R)ECso／mg·mL 遥 碍 糌 坦 器 浓度对数 浓度对数 浓度对数 圆滑番荔枝提取物对病原菌的毒力曲线 黄皮提取物对病原菌的毒力曲线 蔓马缨丹提取物对病原菌的毒力曲线 图l 供试植物提取物对胡椒瘟病菌菌丝生长的毒力曲线 3 讨 论 ， 篡 望 国外 Anandaraj M等研究了印楝、飞机草、马缨 有较好的抑制作用 引。本研究室内抑菌活性测定结 36卷第 6期 苟亚峰等：23种植物提取物对胡椒瘟病原菌的抑制作用 果表明，23种植物无水乙醇提取物对胡椒瘟病菌均 具有不同程度的抑制作用，其中圆滑番荔枝提取物 的抑 制作 用 尤为 明显，当提取 物 质量 浓 度 为 10 mg／mL时，对胡椒瘟病菌抑菌率高达 i00 。番 荔枝科植物具有抗病毒、杀虫、抗癌等多种生理活 性。田丽娟 、徐丽珍⋯一、常世忠[ 等从圆滑番荔 枝中分离到了几种二萜类和生物碱等化合物，并发 现其具有较强抑制肿瘤的生理活性。前人的研究与 本试验的结果相结合可以看出，圆滑番荔枝无水乙 醇提取物对胡椒瘟病菌具有较好抑菌活性有可能就 是其中的二萜类和生物碱等化合物起主要作用，但 具体的活性成分还有待于进一步研究。 本试验仅测定了无水乙醇冷浸提法制备的提取 物对供试病原菌的抑菌活性，对于不同溶剂以及不 同的提取方法制备的提取物对供试病原菌的抑菌活 性是否具有一定的影响还有待进一步验证。目前， 人们关于植物提取物的抑菌活性研究已有不少理论 依据，但多数只是停留在实验室水平，真正应用于农 作物病害防治的较少 】¨。1 。因此，为了更加有效地 利用具有较好抑菌活性的植物，应深入研究起抑菌 作用的主要成分，分离、鉴定其化学结构，为新的植 物源杀菌剂的研制提供理论依据。 参考文献 [1] 刘进 ，郑成木．胡椒瘟病与辣椒疫霉[J]．热带农 、 科学， 2001(5)：27—31． [2] 邢谷杨．胡椒无公害生产及其主要病虫害防治l_J]．广西热带农 业，2004(6)：34—35． [3] 黄家峰．胡椒瘟病的观察及其防治[J]．热带农业科学，1986 (2)：44—45． r4] Kasim R．The control of foot rot disease of pepper caused by Phytophthora palmivora using fungicides[J]．Edisi Khusus PenelitianTanamanRempah danObat，1986，ll(2)：63—66． [5] 冯俊涛，石勇强，张兴．56种植物抑菌活性筛选试验[J]．西北 农林科技大学学报(自然科学版)，2001，29(2)：65—68． [6] 慕立义．植物化学保护研究方法[M]．北京：中国农业出版社， l994：79—81． [7] 陈年春．农药生物测定技术[M]．北京：北京农业大学出版社， 1991：191—192． [8] Anandaraj M，Leela N K．Toxic effect of some plant extracts on Phytophthora capsici，the foot rot pathogen of black pepper [J]．Indian Phytopathology，1996，49(2)：181—184． [9] Ezziyyani M，Requena M E，Egea G C，et a1．Biological control of Phytophthora root rot of pepper using Trichoderma harzia n1．i,lll and Streptomyces rochei in combination[J]．Journal of 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