水稻细胞质铜锌超氧化物歧化酶基因的序列和表达分析

热带亚热带植物学报 2007，15(2)：101-106 Journa／ofTropical and Subtropical Botany 水稻细胞质铜锌超氧化物歧化酶基因的 序列和表达 王 峰 ，一，王宏斌 ，王金发 (1．中山大学有害生物控制与资源利用国家重点实验室、基因工程教育部重点实验室，生命科学学院，广州 510275： 2．暨南大学药学院基因组药物研究所，广州 510632) 摘要：以水稻(Oryza sativa)品种 Cpslo17幼穗为材料，通过 RT．PCR克隆了长度为 698 bp的编码水稻细胞质铜锌超氧 化物歧化酶基因(OsCu／Zn-SOD)。序列分析表明其覆盖基因完整编码框，编码由 152个氨基酸组成的蛋白，它与玉米 (Zea nl~ize)Cu／Zn-SOD基因序列的相似率为88％。TargetP和 ChloroP预测编码蛋白N端无信号肽序列，且此编码区 段有 8个外显子和 7个内含子。利用 Swiss-Model站点预测 OsCu／Zn-SOD三维结构，并分析其铜锌离子结合位点的结 构。RT-PCR结果表明OsCu／Zn-SOD在水稻不同品种均有表达，但表达量存在差异，OsCu／Zn-SOD在 Cpslol7的分裂旺 盛的幼嫩组织如幼穗、开花期花序和未成熟种子中表达量较高，而在叶片中表达量相对较低，在愈伤组织中表达微弱。 关键词 ：水稻；铜锌超氧化物歧化酶；序列分析；基因组结构；RT-PCR 中闰分类号 ：Q786 文献标识码：A 文章编号：1005—3395(2007)02—0101—06 Sequence and Expression Analysis of Cytoplasmic Copper／zinc Superoxide Dismutase Gene in Rice WANG Feng ， WANG Hong—b i n ，WANG J i n—fa (I．The StateKeyLaboratory ofBiocontrol andtheKeyLaboratory ofGenc En~ncedng ofMinistryofEducation,School ofL Science， Sun Yat-sen University,Guangzhou 510275，China；2．Institute ofGenomic Medicine，College ofPharmacy, S~nan University,Guangzhou 510632，China) Abstract： The 698 bp cytoplasmic copper／zinc—superoxide dismutase gene (Os Cu／Zn-SOD) was cloned by RT-PCR from young panicles ofrice Cpslo17，a wide—compatible rice cultivar (Oryza sativ ．DNA sequence analysis indicated that the gene consisted ofa full-open reading frame and encoded a protein of 152 amino acid residues． The nucleatide sequence of Os Cu／Zn-SOD shares 88％ identity to maize Cu／Zn．SOD． No signal peptide was predicted by TargetP an d ChloroP． Further an alysis of encoding segment of cl￡ DD revealed that it contained 8 exons an d 7 introns． The putative three-dimensional structure of OsCu／Zn．SOD was predicted by the Swi ss-Model server and Cu2+and Zn2+binding sites of OsCu／Zn．SOD were analyzed．RT．PCR results showed differential expression ofOsCu／Zn-SOD in leaves ofbothjapnica and indica rice．OsCu／Zn．SOD was expressed highly in panicles during young ear an d the flowering stages or in immature seeds ， however less in leaves an d faintlyin callus． Key words：Rice；Sequence an alysis；Genomic structure；RT．PCR 收稿 日期 ：2006-08．18 接受 日期 ：2006-12．08 基金项目：科技部植物转基因重大专项资助项目(J00-A-009)，国家 自然科学基金项目(30370809)资助 ’通讯作者 Corresponding author 维普资讯 http://www.cqvip.com 热带亚热带植物学报 第 l5卷 生物在整个生长发育过程中受到各种不良环 境的影响，这些非生物和生物胁迫均能导致细胞产 生大量的活性氧。另外细胞正常的代谢过程，如酶 促反应、电子传递过程及小分子 自身氧化等，也能 产生活性氧。活性氧具有较高的化学活性，可改变 膜的结构和通透性，使许多细胞内成分失去生物活 性和功能，它们还可使染色体降解、断裂，对生物细 胞具有一定的毒性【1]。超氧化物歧化酶(Superoxde dismutase，SOD：E．C．1．15．1．1)是 1种重要的金属抗 氧化酶，它广泛存在于生物体中，能够催化超氧阴 离子 自由基歧化为过氧化氢与氧气，专一清除体内 活性氧，平衡机体氧自由基。根据辅基部位结合的 不同金属离子可将 SOD分为4类：锰超氧化物歧 化酶(Mn．SOD)，铁超氧化物歧化酶(Fe．SOD)，铜锌 超氧化物歧化酶(Cu／Zn．SOD)和镍超氧化物歧化酶 (Ni．SOD)[r3]。在植物中，Cu／Zn．SOD是4种超氧化 物歧化酶中含量最丰富的一类。Cu／Zn．SOD主要位 于植物细胞质和叶绿体中，其中叶绿体 Cu／Zn．SOD 由核基因编码，在细胞质中合成后由信号肽引导进 入叶绿体内。Cu／Zn．SOD含有铜离子和锌离子 2个 金属辅基，金属辅基的解离和构象的改变对于 SOD 活性至关重要。Cu／Zn．SOD在植物抗氧化逆境中发 挥着重要作用，它与植物的抗逆性和抗衰老有密切 关系，有研究表明在植物中过量表达 Cu／Zn．SOD能 提高植物的抗盐、抗旱、抗寒等抗逆性能 。随着国 民经济的发展，生态环境的恶化，一些不良环境因 子越来越严重地危害着农业生产，提高作物对不良 环境的抗性顺应时代的需求。近年来，水稻基因组 序列的完成使分析基因的结构成为可能，本实验采 用分子生物学方法，从水稻中分离与抗逆性相关的 OsCu／Zn．SOD基因，并对其基因组结构、编码蛋白 序列及三维结构、金属辅基结合位点、表达模式进 行分析，从而了解 OsCu／Zn．SOD的作用分子机制， 并为开展植物抗逆基因工程研究奠定基础。 1材料和方法 材料 所用水稻(Oryza sativa)~种包括广亲 和品种 Cpslo17，粳稻 2个品种：中花 11和丰锦；籼 稻4个品种：粤航、珍紧占、广超丝苗、丰丝占。各品种 叶片取自16hd 光照、光照强度为60 Ixmol m 。·的 28~C下培养的幼苗，穗和种子取自田间正常生长的 水稻植株，水稻愈伤组织诱导和继代培养均在含有 2 mg L-i 2,4．D的Nj3 培养基上进行。取材后迅速 投入液氮并保存于 ．70℃。克隆载体 pBluescript SK十 及大肠杆菌菌株 DH5{x为本室保存。 主要试剂 Concert Plant RNA Reagent购 自 Invitrogen公司；ReverTra Ace反转录酶和 RNase Inhibtor为Toyobo公司生产；Oligo(dT)、胶回收试剂 盒、焦碳酸二乙酯(DEPC)、 DNA聚合酶购自北 京鼎国公司； 高保真 DNA聚合酶购自斯威生公 司：限制性内切酶、DNA Marker、dNTP、T4 DNA连 接酶等购自Takara公司；PCR引物 由上海博亚生 物技术有限公司合成。 总 RNA 的 提 取 按 照 Invitrogen公 司 Concert Plant RNA Reagent的说明书进行。 第一链 eDNA合成及 PCR扩增 参考粳稻 日本 晴 (Oryza sativa L．CV．Nipponbare)铜 锌 超 氧化 物 歧化 酶 基 因序 列 [明自主 设 计 引物 P1： 5’CTCCTCCTTCATCCTCCTCGTCGTC3’．P2： 5’CATAGTTCATTGGGCGCCAACGATG3’。 自主 设计看家基因 actin gene引物为 P3：5’AGAGCTA． CGAGCTTCCTGATGGAC 3’和 P4：5’GAGAGA． TGCCAAGATGGATCCTCC 3’)。取 1 水稻幼穗 总RNA，第一链 eDNA合成体系为 20 l：2 总 RNA，1 l 5 pmol／L Oligo(dT)，4 p．1 5xBuffer，2 p．1 10 mmol／L dNTP，100 U ReverTra Ace，20 U RNase inhibitor。反转录前先将总RNA和 Oligo(dT)于70~C 预热 2 min去 除 RNA 的高级 结构 ，冰 上放 置 2 min后于 42℃反转录 1 h，取单链 eDNA产物按照 文献方法进行 RT．PCR反应闭。设定 PCR扩增程序 为 ：94℃ 5 min预变性 ，94℃ 30 s，60oC 30 s，72oC 1．5 min扩增 30个循环，72℃延伸 5 min。取 5 l产 物于0．8％琼脂糖凝胶中电泳检测。 PCR产物的克隆及测序 PCR产物经琼脂 糖凝胶电泳回收后与 pBluescriptlEcoRV载体以平 末端方式连接，用氯化钙法将连接产物转化入大肠 杆菌 DH5{x感受态细胞。通过蓝白斑筛选白色单菌 落 ，按照文献进行菌液 PCR初步鉴定和酶切鉴 定[71。将有插入片断的3个独立的阳性克隆送交上 海博亚公司进行测序。 序列 的电子 拼接及序列分析 用 BLASTN 程序搜索 GenBank水稻 EST数据库，将同源的EST 片断拼接得到水稻铜锌超氧化物歧化酶基因的末 维普资讯 http://www.cqvip.com 2 I】警酋： 坼~i／．1ltg 件魍 c化柳l 化哺“ fr,'Ji 刊书J止让廿惭 I(13 端】}列 TIGR 5、；iI．1 远f．BLASTN J ．』拽 之 J 『 豫 门水 稻 滴 凡 l 包 讳 (Bacterial m'tificialt2hrOmOSOIll'd、BA(1 降 ， 求 cDNA 0氍 BAC兜降的 。}f ，舒斩 旧j 站 川DNASIS(2 5)软什分析 ⋯段嵌J(-~fL甘J。 氰 J 酸摩吼 ExPASy PROSITE m删生川顺n0分 r I等tU点等- ¨ 矗：N术端 J点坡f。j 0州是的 洲JiJ TargelP V1 0： ChloroP 进"：Clustal xfl 81)车¨ GeneDoc f}j米州 i l序∥I进{J 多 j 别耿 分析 三维结构预测 通过 Inte．rt'let将 OsCw'Zn—SOD 氧 帻 州1‘送刮 Swiss—Model ” ^ 接 褂 OsCu／Zn SOD的 ‘维’ I'H J“il{=i_『．川 3D Molecular viewer戟仆舒析l -绯构 技倘锌高 J 绗台矗f t 构 ． 2结粜羊¨分析 2．1 Os n—SOD基 因的 扩增和克隆 以水祸- ki,(’pslo1 7 1内11¨ RNA 为模扳 合成 第 l链 cDNA． 此 键eDNA为模扳．⋯p／ ¨ 断雠 酶以 Cu／Zn-S~)D 特 引物 P1干¨ 】)2进行 PCR扩增 t罔 Ij．搿剖凡小为700 bp -^冉的特 增 J 段 ，1 茨【『flI J『 克降 pBlucsc~ipt／Et RV救 体，丰蟾取 l也荫 ．陋叫箍定 洲l芋 2[Ill(J一 l_一 500 —— ． l k轿f ； 一 }JJ II 呐PCR{1埔 Fig 、 PCR amplification Ol*f} {l1 Z |J gene in rice 2．2 OsCu／Zn—SOD基 因序列分析 将 所 } }序 列 捉 受 GenBank (宁 刮 {j DQ058108)．ji 逊⋯．4 ‘ 比较 致埘它 Sakamoto 等报道VJ tii f除 1个僦』 l¨=J外 其它 敛．这 个砒 改变4 ll¨ 墒陵n0 L 娈 Jk,91、它f _}、 求f Ⅵ川“ )的 Cu／Z*．_50D jl 州似 他血 ． 88c／r 嗣l{爱 ‘^ IIfjⅢ l¨fl¨ )技泡 4 H“jf川川⋯ ：， Ⅲ ii) n0 C,／Zn．．SO1)JIt J 的 cDNA训似 分 圳为 839}和 82％ 此 ” 越． 厂r ， 卜50f) 丌被 【责 ~,}|Qopen reading frame．ORFl }到ln cDNA- 始崭蚂J问地序刮纣 i i Kozak觇0』lJ，终 ll 密矾 l、游 l07 bp处 』AATAA的J J『_】 ． 号．羟过 EST 伸 干¨ 『 J 拼攘，将所得J 州li'q 5’ l 3’ 舒圳主=_[ j-46 bp 目I 100 bp 终 ¨譬 5 r游 283 bp处“l PolvA jt 骘 基剑水稻L二 仃糙桶、籼 { 个一l l’ ．￡ 序划公布．比较 r阿个、J 种I'l J r^ f J_51111 段的 刖．技小 阳个1 种的 ，^C 卜．SOD J L 圳 剁除了 第 1个l J 儿个城 敛． 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I ()pen and full b⋯ dentate untranslaled cxr}ns and coding c s rcs~vtively 2．3 osCu／Zn—SOD 蛋白序 列及 结构 分析 OsCu／Zn—NOD J^ 编 】个 ⋯ I 52 个氰 旅 艘虮成 等 I ^ 为5 72，舒 为 I5 3 kDa的 OsCw'Zn—SOD蚩 剐OsCu／Zn．SOD 1’ 氰堆陵目l 成进"舒忻 {嵌2 侮矩l f1 螭(Gly)．1【Gly 甲均分 J r蝼个序列tf『．Gly怕 利 1。蚩f l质 链f由折替 I．IB JJ5l技必 {，构 麓．OsCu／Zn SOD『杓 Gly的数 l I lf JC它物补九勺(’u理n—SOD 』^术 做 ．这提 d-H物种l10 Cu忽J1一soD ‘^脞砸i．1勺折舜 眷-：f j -’ I i构 l¨『fll 幽 ． OsCu／Zn—SOD不 维普资讯 http://www.cqvip.com 热带亚热带植物学报 第 15卷 含色氨酸，只含 1个酪氨酸。色氨酸和酪氨酸含量 低是 Cu／Zn．SOD的显著特点，因此这类蛋白具有 独特的紫外吸收光谱，在 280 nlTl处没有最大吸 收峰圆，VectorNTII su 9．0软件预测 1 mgml 的 OsCu／Zn-SOD在 280 nlTl下的理论吸收值仅为 0．1。 肽链中还有 10个组氨酸 (His)和 2个半胱氨酸 (Cys)，它们分别对结合金属离子和形成二硫键至关 重要。TargetP V1．0和 ChloroP预测结果一致显示 OsCu／Zn-SOD无信号肽序列，提示该蛋白定位于细 胞质中。 蛋 白序列对比分析 (图 3)显示不同来源的 Cu／Zn-SOD之 间表现 出高 度 的序 列 同源 性和 明显的进化保守性。OsCu／Zn．SOD与玉米、凤梨 (Ananas COlnO$ )、菠菜 ( ino~m o racea)等 的 Cu／Zn-SOD有高度同源性，包含保守的铜离子结合 位点(I-Iis-45，His_47，His-62和 His-119)及保守的锌 离子结合位点(His．62，His．70，His．79和 Asp．82) 堋。 将 OsCu／Zn-SOD序列提交给 Swiss．Model，预测的 OsCu／Zn．SOD 三 维 结构 如 图 4A 所示 ，用 3D Molecular viewer软件显示其铜锌离子结合位点的 结构如图4B所示。 2．4 OsCu／Zn．SOD 的表达模式分析 Sakamoto[~在 1992年克隆了 OsCu／Zn-SOD[63， 但没有分析它的基因组结构，表达模式及在品种间 的差异。本研究利用 RT．PCR检测 OsCu／Zn-SOD的 表达情况，结果如图5所示，OsCu／Zn-SOD基因扩增 产物大小为 698 bp，同时扩增的actin基因产物大 小为 335 bp，OsCu／Zn．SOD在各不同品种的叶片中 都有表达，在广亲和品种 Cpslol7和粳稻品种丰锦 中表达量较低，表达量存在品种差异，这可能预示 着品种抗逆程度的不同。OsCu／Zn-SOD在 Cpslol7 的各个不同器官中均有表达，但在分裂旺盛的器官 如幼穗、开花期花序和未成熟种子中表达量较高， 在光合作用器官叶片中表达量相对较低，在愈伤组 织中表达微弱。 裹 1水稻铜锌超氯化物歧化莓基因外显子和内含子交接区核苷酸序列分析 Table 1 Nucleotide sequence analysis ofexon-intronjunctions ofOsCtdZn-SOD gene 内含子用小写字母表示，外显子用大写字母表示。lntron and exon sequences are shown in small and capital letters ， respectively 裹 2 OsCu／Zn．SOD氨基酸组成分析 Table2 Componentanalys isofaminoacid sequenceofOsCu／Zn．SOD 维普资讯 http://www.cqvip.com 】’fn IM_ f 1 。p⋯u 峙≮：承稻 胞艟锕锌超 {也物歧 潞蕈 的序列和表达舒 3(’u,,Zn—SOD氯 眩 州 -ltL Fig 3 A131lno acid sexluen~e alignm enl ofthe Cu：Zn—SODs 乜捕啦表 、十¨1 f 缸 陵 轭包插群点0 鼬 75c,~ i9． 溅嵌色 彘 氟 ^5I)％ I ▲表 小住 午f 荆每 l馆商 结亡 5．★托·．、 慷健池似 RcsidResin black~hadlngindi~mte dcm residues Residues in dark gmy shading indicate highly cnn ed residues l≥75％ identity} Residues⋯ ligh L gray shading indicate∞nser、删 residuesf≥509~"idenmy)▲ dtmotesCu andZn： binding sites and★ dem~{es disulilde bond sties 一 A ●}{ 蚓 4 小搦 Ctt,'Zn SOD 弗 结构 肺删 F g 4 Predictton o1"rice Cu．；Zn—SOD ．-~wacture A 稀Cu：'Zn．SOD 吐 橱 Putalive three dimension strticluralI，flrice Cu'Zn—gOD： B 手霉C％wZn-gOD锕锌高 』 位 Cuj and Zn：binding siies ol riceCu：Zn—SOD 【1l 2000 iOO0 —50 ‘nn 25(I M l 2 j -4 5 f， l 2 3 J 5 6 M bp 一 2004 1 c)t】I 一 一 fl 一 50(I 250 图5 RT．PCR讣fi J痛 l—SOD f一 Fig 5 RT· R anal~,i s。I_(Is ∞ SoD expression A：I一7 水幅II¨I CulZ．． r 『J l PCRl‘辅 l粤 2 雄．3砖紧1 ．4 i超壬毫 ．5 } l1：h cD 10I’1#牲l- Lines 1 7 ale PUR products of ^ (．'IIIZ~I-,~OD inleaves of rice culti~．ars l Yuehang；2 Fengiin；j Zhenjinzhan：4 Guangehao~imi H0 5 ZhooghuaII 6 Cpslo 27． Fengsizhan；M DL2004)DNAmarker B Cpslo 1叶 2 3幼弛：4 ，EI6_咤2-：5采心 J ：6愈伽州 c nl l es．2 Stett~sz 3 Y~ungpm~iclcs；4 Pan训 attheI]o~'ering stage； Immature seeds；6 Callus 一 。 ‰ 维普资讯 http://www.cqvip.com 1O6 热带亚热带植物学报 第l5卷 参考文献 【l】 BowlerC，VanMontaguM，lnzeD．Superoxide dismutaseand stresstolerance ．AnnuRevPlan tPhysiolPlantMolBiol，1992， 43：83-1 16． 【2】Bannister J V，Bannister W H'Rotilio G．Aspects of the structure， function and applications of superoxide dismutase【J】．CRC Chit Rcv Biochem,1987，22：1 l 1-180． 【3】 YounHD，KimE J，Roe JH，et a1．A novel nickel-containing suporoxide disanutase from Streptomyces spp．【J】．Biochem J， 1996．318：889—896． 【4】 Sen Hcinin J L'Holaday S et a1．Increased resistance to oxidative Stress intransgenicplantthat0vt腿 prcsscdchloroplastic Cu／Zn superoxide dismutase【J】．Proc Natl Acad Sci USA,l993， 90：1629-1633． 【5】BadawiG H'Yamauchi Y，ShimadaE，etaLEnhancedtoleranceto salt SU~SS andwater deficit by ovemxpressing superoxide dismu- tase in tobacco(N／cot／,ma tabacum)chloroplasts【J】．Plant Sci， 2004．166：9l9—92 8． 【6】 Sakmnoto Ohsuga H'Tanakak Nucleotide s~ ences oftwo cDNA clones encoding different Cu／Zn-superoxide disanutases expressedin developing rice 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