靶向表皮生长因子受体的肿瘤生物治疗方法研究进展

中国肿瘤生物治疗杂志 http：／／www．biother．org Chin J Cancer Biother，Feb．2009，Vo1．16，No．1 · 97· DOI：10．3872／j．issn．1007-385X·2009·01·022 靶向皮生长因子受体的肿瘤生物治疗方法研究进展 Epidermal growth factor receptor-targeted tumor biotherapies：an advance 廖 刚 综述，王子卫 审阅(重庆医科大学 附属第一医院 胃肠外科，重庆 400016) · 综 述 · [摘 要] 肿瘤生物治疗(cancer biotherapy)已经成为继手术、放疗和化疗三大经典肿瘤治疗模式后的第四模式。在肿瘤生 物治疗中，表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)靶点扮演着重要角色。EGFR为一种相对分子质量为 170 000的酪氨酸蛋 白激酶型受体，在多种恶性肿瘤存在过表达 ，在肿瘤发生 、发展中起着重要作用。靶向 EGFR的肿瘤生物 治疗方法主要包括 ：基因沉默治疗 、显性负性治疗、单克隆抗体(monoclonal antibody，McAb)治疗、生物“导弹”治疗、EGFR酪氨 酸激酶抑制剂(EGFR tyrosine kinase inhibitor，EGFR TKI)治疗、双特异性抗体(bispecific antibody，BsAb)治疗方法等。目前靶 向EGFR的肿瘤生物治疗研究已经取得较大进展，随着研究的进一步深入，肿瘤的治疗必将跨入一个全新的时代。 [关键词] 表皮生长因子受体；肿瘤生物治疗；显性负性突变体；酪氨酸激酶抑制剂；单克隆抗体 [中图分类号] R730．5 [文献标志码] A [文章编号] 1007—385X(2009)0l-097-04 近年来肿瘤的治疗 已经取得长足进步，手术 、放疗 和化疗构成肿瘤治疗的三大经典模式。然而经典模式 主要着眼于直接杀伤肿瘤细胞，这不仅难以彻底消灭 肿瘤细胞 ，而且容易损伤正常细胞。在分子生物学和 基因技术飞跃发展的推动下，以免疫治疗为基础 发展而来的肿瘤生物治疗 日益受到重视，显示出良好 的应用前景，成为肿瘤治疗的第四模式。肿瘤生物治 疗是指通过肿瘤宿主防御机制或生物制剂的作用以调 节机体 自身的生物学反应 ，从而抑制或消除肿瘤生长 的治疗方法。在肿瘤生物治疗 中，表皮生长因子受体 (epidermal growth factor receptor，EGFR)靶点扮演着重 要角色，成为国内外研究的热点。目前靶向 EGFR肿 瘤生物治疗的方法主要包括：基因沉默治疗方法 、显性 负性治疗方法、McAb治疗方法、生物“导 弹”治疗 方 法、EGFR酪氨酸激酶抑制剂(EGFR tyrosine kinase in— hibitor，EGFR TKI)治疗方法、双特异性抗体(bispecific antibody，BsAb)治疗方法等。 1 EGFR的结构与功能 人 EGFR基因定位于 7 p13一q22区，全长 200 kb， 由28个外显子组成，编码的蛋白质为含 l 210个氨基 酸残基的 EGFR前体；其 中24个氨基酸为信号肽段 ， 在翻译后加工时被酶解 ，形成含有 1 186个氨基酸残 基的成熟 EGFR。EGFR为一种相对分子质量为 170 000的酪氨酸蛋白激酶型受体，由三部分组成：(1)胞 外区，由氨基端的621个氨基酸残基构成，是配体结合 区；(2)跨膜区，为 23个氨基酸残基构成螺旋状结构的 疏水区，其将受体固定于细胞膜上；(3)胞内区，由 542个氨基酸残基构成，进一步分 3个亚区：近膜亚区、 酪氨酸激酶亚区、羧基端亚区。迄今发现，EGFR共有 6种配体，表皮生长 因子 (epidermal growth factor， EGF)、转 化生长 因子 仅(transforming growth factor仅， TGFc~)、双调蛋 白(amphireguin，AR)、B-细胞素(beta- celluin，BTC)、肝素结合的表皮生长因子(heparin—bind． ing EGF，HBEGF)、表皮素(epiregulin，EPR)等，其中最 重要的是 EGF和TGFc~⋯。EGFR与其配体的结合具 有高亲和性 、可饱和性和特异性的特性。 EGFR与其配体结合后，相互之间形成同源二聚 体 ，也可与其他酪氨酸激酶受体形成异源二聚体 ，导致 胞内酪氨酸激酶 区的激活 ，彼此可将对方酪氨酸残基 磷酸化，启动一系列级联反应 ，将信号传到细胞核内， 最终引起一系列相关基因活化 ，导致肿瘤细胞增殖 、凋 亡抑制，促使肿瘤细胞转移并导致放、化疗耐受，在肿 瘤发生发展过程中扮演着重要角色。文献报道，EGFR 在胃癌 、胰腺癌 、卵巢癌 、结直肠癌 、非小细 胞肺癌(non—small cell lung cancer，NSCLC) 、头颈部 鳞癌(squamous—cell carcinoma of the head and neck，SC． CHN) 13 1以及恶性胶质瘤 “ 等恶性肿瘤存在过表达， 并在其发生、发展中起着重要作用，为肿瘤生物治疗的 重要靶点。 2 EGFR基因沉默治疗肿瘤 基因沉默技术(gene silencing technology)主要包括 反义技术(antisense technology)和 RNA干扰 (RNA in— terferenee，RNAi)。反义技术是通 过阻抑从 DNA至 mRNA的转录过程或从 mRNA至蛋 白质的翻译过程， 导致细胞中基因表达下调的一种手段 。可以利用 3 种人工合成的物质实现对特定基因表达的抑制：反义 [作者简介] 廖 刚(1980一)，男，四川省成都市人，博士研究生，主 要从事胃肠外科方面的研究 通讯作者(Corresponding author)．E—mail：wangziwei57 1@sina．tom · 98· 中国肿瘤生物治疗杂志，2009年2月，16(1) RNA、反义 DNA和核酶 (ribozyme)。用 EGFR反义 RNA转染人恶性胶质瘤细胞株 U87MG后，EGFR水平 下降，并导致 U87MG细胞的致瘤性受到抑制 。 目 前还没有靶向 EGFR的反义技术治疗制剂进入临床应 用，但反义技术有可能成为肿瘤生物治疗的新途径。 RNAi属 于转 录后 基 因沉 默 (post—transcriptonal gene silencing，PTGS)，在((Science>>杂志评出的2002年 度全球十大科技突破中排第一位 16 3。RNAi技术指利 用小分子干扰 RNA(small interfering RNA，siRNA)在细 胞内诱导同源 RNA降解的特性，根据特定 RNA序列 人工合成 siRNA，并将 siRNA导入靶细胞，从而抑制细 胞内特定基因表达的技术，已经成为肿瘤生物治疗研 究的热点。Kang等 分别构建靶 向人 EGFR胞外区 和催化区序列的两种 siRNA表达质粒，并在脂质体介 导下分别转染人恶性胶质瘤细胞株 TJ905，免疫荧光测 定和 Western blotting测得 EGFR水平分别下调 90％和 92％，通过流式细胞术 、Transwell小室模型和 M3q"测 定发现转染细胞 s期细胞比例降低、细胞侵袭能力降 低 、细胞增殖能力受到抑制。与单一靶点 RNAi相 比， 双靶点联合 RNAi能够取得更好的效果。单独应用 pU6-EGFR—shRNA-1和 pU6一EGFR—shRNA一2表达 质粒 转染人结肠癌细胞株 LoVo对mRNA水平抑制率分别 为(80．22±3．42)％、(81．30±2．83)％，蛋白水平抑制 率分别为(74．11±4．02)％、(73．39 4-2．30)％，细胞凋 亡率分别为(10．43±0．49)％、(10．13 4-0．39)％；联合 应用两表达质粒则可将 mRNA水平抑制率 、蛋白水平 抑制率和细胞 凋亡率分别进一步提高到 (90．58± 2．76)％、(90．39±3．34)％ 、(14．17±0．53)％，取得 更好的效果 。 3 显性负性 EGFR治疗肿瘤 显性负性治疗方法是指利用基因工程技术获得特 定受体的显性负性突变体(dominant negative mutant)， 使其高表达，通过高表达突变体的显性负性作用而产 生负 性调节效应。外源性 显性负性 EGFR(EGFR． DNR)能够与EGFR竞争结合EGFR配体，由于EGFR． DNR缺失胞内区，没有信号转导功能，从而达到抑制 EGFR功能的作用。EGFR—DNR能够抑制胰腺癌细胞 的生长，并增加胰腺癌细胞对顺铂的敏感性。Chan 等 构建表达EGFR DNR的逆转录病毒载体，转染大 鼠低分化卵巢上皮癌 NuTu-19细胞株，发现 EGFR— DNR的表达使NuTu一19细胞的非停泊性生长能力受到 明显抑制，失去了在具有免疫能力的大鼠模型中的致 瘤潜能；同时用 NuTu．19细胞株建立对顺铂耐药的耐 药细胞株，在转染表达 EGFR．DNR的逆转录病毒载体 后，其耐药性被部分逆转。由此表明EGFR—DNR能够 抑制肿瘤细胞生长，逆转肿瘤的化疗耐药，为肿瘤生物 治疗开辟了新的途径。 4 EGFR的McAb和 BsAb的抗肿瘤方法 杂交瘤技术问世以来，McAb的制备及其在肿瘤生 物治疗中的应用取得了极大的进展。抗 EGFR的 McAb 作用的机制主要是通过封闭肿瘤细胞表面的 EGFR，以 阻断EGFR依赖的细胞内信号转导通路，从而阻断配体 与EGFR结合后对肿瘤细胞增殖的促进作用，抑制肿瘤 细胞生长。主要代表药物为西妥昔单抗(cetuximab)，由 德国Merck公司研发，为第一个获准上市的靶向 EGFR 的人鼠嵌合性IgG1McAb，与EGFR有高度的亲和力，半 衰期较长。西妥昔单抗，无论单药治疗还是联合放、化 疗，在EGFR阳性的恶性肿瘤中均能发挥出色的抗肿瘤 活性，显著增强放、化疗的疗效。西妥昔单抗治疗结直 肠癌的效果已经得到广泛的认可，对于伊立替康耐药的 结直肠癌患者，西妥昔单抗单药或联合伊立替康应用均 能取得较好疗效 。FDA于2004年2月批准西妥昔单 抗联合伊立替康用于EGFR阳性、伊立替康治疗失败或 耐药复发或转移性的结直肠癌，或伊立替康不能耐受化 疗者。对于Ⅳ期 NSCLC，西妥昔单抗与紫杉醇和卡铂的 化疗方案联合治疗的反应率达到26％左右，明显优于以 往没有联合西妥昔单抗化疗方案的疗效 j。此外进展 期 SCCHN也是常见的 EGFR阳性的恶性肿瘤，西妥昔 单抗在其治疗中也表现出较佳的抗肿瘤作用 。西妥 昔单抗耐受性 良好，不良反应大多可以耐受，主要有痤 疮样皮疹，通常中断治疗后皮疹可以自行消退，并无后 遗症，并且在一些研究中观察到皮疹的严重程度与肿瘤 缓解率有关。BsAb具有两个 Fab段，一个 Fab段结合肿 瘤细胞EGFR胞外段，阻断配体与受体的结合；同时另 一 个 Fab段能够结合免疫效应细胞，引导免疫效应细胞 在肿瘤部位的聚集，从而杀灭肿瘤细胞。BsAb代表药 物MDX-447，美国Medarax公司开发，已经进入Ⅱ期临床 试验。MDX-447能同时结合表达 Fc~,RI受体的人免疫 效应细胞和表达EGFR的肿瘤细胞 。 5 靶向EGFR生物“导弹”治疗肿瘤 肿瘤的生物“导弹”治疗，是借助高度特异性的亲 肿瘤细胞的物质作为靶向性载体，以细胞毒作用物质 作为“弹头”，依靠靶向性载体对肿瘤细胞的特异性亲 和力，将“弹头”物质尽量集中于肿瘤细胞释放，发挥 稳定的杀伤作用，而对正常细胞损伤较小的治疗方法。 “弹头”主要包括放射性核素、化疗药物、毒素、酶，靶 向性载体主要包括 MeAb和配体。 尽管 EGFR的 McAb本身也是一种生物治疗制 剂，但在生物“导弹”治疗中主要是作为靶向性载体运 廖 刚，等．靶向表皮生长因子受体的肿瘤生物治疗方法研究进展 ·99· 送细胞毒物质，并以后者杀伤肿瘤细胞。放射性核素 与 McAb偶联在McAb介导生物“导弹”治疗中应用最 多 ，常用的放射性核素有” I、 Y．32P、 “IN，McAb与放 射性核素偶联可将放射性核素有效地导向肿瘤组织局 部，不仅可破坏与 McAb结合的肿瘤细胞，还可以杀伤 周围未与 McAb结合的肿瘤细胞。肿瘤化疗药物同样 也可以通过 McAb进行靶向性运输。何颖等 ’。 采用改 进后的戊二醛方法将多柔 比星(doxorubicin)与 EGFR 的McAb(EQ75)偶联，成功制备抗体偶联物(EQ75一 ADR)，发现 EQ75一ADR具有选择性杀伤作用，在体外 和裸鼠体内对人表皮癌均有显著抑制作用 ，并且毒性 作用小，在肿瘤生物治疗中具有潜在的应用价值。 在生物“导弹”治疗 中，EGFR的配体 同样也可作 为运送细胞毒物质的靶向性载体。Liu等 合成配体 EGF与白喉毒素的融合蛋白DAB389EGF，利用EGF能 与 EGFR特异性结合的特性 ，通过 EGF向过表达 EG- FR的恶性胶质瘤细胞株运送白喉毒素，发现肿瘤细胞 对 DAB389EGF的敏感性与 EGFR的密度正相关，为 DAB389EGF进一步在肿瘤生物治疗中应用提供实验 基础。通过基因工程技术利用大肠杆菌合成 EGF和 人胰腺的核糖核酸酶 hRNasel融合蛋 白 RNase-EGF， 在 RNase-EGF处理过表达 EGFR的肿瘤细胞后 ，共聚 焦荧光显微镜证实 RNase—EGF被细胞摄取 ，MTI'测定 发现 RNase—EGF对 肿瘤 细胞 的生长产 生 了抑制 作 用 。IJi等 在噬菌体展示肽库筛选出一种编码氨 基酸序列 YHWYGYTPQNVI(GEl 1)的浓缩的噬菌体 克隆，竞争性结合测定和 Scatchard分析揭示 GEl 1作 为一种新型配体对 EGFR有特异性结合力，解离常数 大约为22 nmo~L，然而与配体EGF比较，GEl1具有更 低的有丝分裂促进活性 ；GEl 1能被高表达 EGFR的肿 瘤细胞优先摄取，并且通过尾静脉注射进入大鼠肝癌 细胞株 SMMC一7721皮下移植瘤的裸小鼠体内后，发现 其蓄积在过表达 EGFR的移植瘤 中，说明 GEl1作为 EGFR靶向性细胞毒物质运输载体的潜力巨大。 6 EGFR TKI治疗肿瘤 EGFR TKI为抑制 EGFR胞 内区酪氨酸激酶 的小 分子化合物，竞争性结合于 EGFR胞内的酪氨酸激酶 催化区域 Mg—ATP结合位点 ，通过抑制下游蛋 白的磷 酸化来阻断信号转导 。主要代表药物为吉非替尼 (gefitinib)和埃罗替尼(erlotinib)，两者都是特异性 EGFR TKI。吉非替尼由英国 AstraZeneca公司开发 ，是 一 种合成的苯胺喹唑啉化合物，是强有力的人 EGFR TKI，已在 日本、美国、韩国、澳大利亚、中国等国批准上 市。研究显示吉非替尼对 NSCLC、乳腺癌、SCCHN等 有效，但目前主要用于NSCLC的治疗。两项多中心的 随机临床Ⅱ期试验(IDEAL 1，IDEAL 1)结果表明，对 于曾经使用过化疗方案的进展期 NSCLC，吉非替尼 250 mg／d组治疗应答率分别为 18．4％和 12％，吉非替 尼 500 mg／d组治疗应答率分别为 19．0％ 和9％，两组 治疗应答率之间的差异并无统计学意义 ，确立了其作 为 NSCLC二线和三线治疗药物的地位 。在应用吉 非替尼治疗肿瘤过程中，对其敏感性高与低取决于 EGFR基因激酶区突变与否。Lynch等 在 NSCLC研 究中发现，9例吉非替尼敏感的患者中就有 8例存在 EGFR基因酪氨酸激酶区突变，而7例无效者未检测出 突变，推测突变增强了对其竞争性抑制剂吉非替尼的 敏感性；因此 ，有变异的患者表现出对吉非替尼更好的 治疗反应。然而 Mimori等 对 5种胃癌细胞株和 39 例原发性胃癌组织标本 EGFR基因第 18-21位外显子 编码的Mg—ATP结合位点突变情况进行研究，发现在 全部细胞株和组织标本中，酪氨酸激酶区高度保守，不 推荐吉非替尼用于胃癌的治疗。 埃罗替尼由 Roche公司、Genentech公司以及 OSI Pharmaceuticals公司联合开发，为喹唑啉类化合物， 2004年 11月美 国 FDA批准埃 罗替尼作 为进展期 NSCLC的二线或三线治疗药物。Shepherd等 将731 例 NSCLC患者按照2：1的比例随机接受埃罗替尼和 安慰剂作为二线或三线治疗 ，埃罗替尼组的中位生存 期为 6．7个月 ，而安慰剂组只有 4．7个月。 然 而，与 西妥 昔单 抗不 同的是 ，临床试 验 IN— TACT1 、INTACT 2 、TALENT和 TRIBUTE 结果 表明，吉非替尼和埃罗替尼均无化疗的协同作用。 7 其他方法 Fattah等 合成一种五聚体蛋白 peptabody—EGF， 其含有5个能与EGFR胞外段特异结合的EGF配体区 域；与McAb比较，peptabody—EGF不仅有对EGFR更高 的结合力，结合后对过表达 EGFR的不同肿瘤细胞都 具有抗增殖作用，而且其作用较 McAb更强，肿瘤细胞 在处理后 30 min后就可以表现出典型的凋亡特征 ，说 明peptabody—EGF在靶向 EGFR的肿瘤生物治疗 中极 具发展潜力。 8 结 语 靶向EGFR的生物治疗比较适合于肿瘤负荷较小 的肿瘤细胞微转移的治疗，而在肿瘤负荷较大的肿瘤 患者中疗效较差，因此靶向EGFR的生物治疗与手术 、 放疗、化疗三大经典模式联合应用的多学科综合治疗 (multidisciplinary cancer management)将是肿瘤治疗的 发展趋势；美国临床肿瘤学会(American Society of Clin— ical Oncology，ASCO)正在全球极力推广多学科综合治 中国肿瘤生物治疗杂志，2009年 2月，16(1) 疗的理念和方法，期望借此能提高治疗效果。同时靶 向EGFR的生物治疗作用有限，联合应用多种靶 向治 疗生物制剂及研制新的靶向治疗生物制剂也是未来肿 瘤治疗研究的新思路。然而合理的联合方案 、最适的 给药时机和最佳的给药顺序有待进一步临床研究。 在分子生物学和基因工程技术的支持下 ，在循证 医学(Evidence—based Medicine，EBM)原则的指导下 ， 随着对靶向 EGFR肿瘤生物治疗研究的进一步深入 ， 肿瘤的治疗必将跨人一个全新的时代。 [参 考 文 献] [1] Yarden Y．The EGFR family and its ligands in human cancer．sig- nailing mechanisms and therapeutic opportunities[J]．Eur J Cancer，2001，37(Suppl 4)：S3一S8． [2] Mimofi K，Nagahara H，Sudo T，et 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