土壤蛋白酶测定

土壤蛋白酶测定（加勒斯江法） 1. 分析意义 蛋白酶参与土壤中存在的氨基酸、蛋白质以及其他含蛋白质氮的有机化合物的转化。它们的水解产物是高等植物的氮源之一。土壤蛋白酶在剖面中的分布与蔗糖酶相似，酶活性随剖面深度而减弱。并与土壤有机质含量、氮素及其他土壤性质有关。 2. 试验原理 蛋白酶能酶促蛋白物质水解成肽，肽进一步水解成氨基酸。 测定土壤蛋白酶常用的方法是比色法，根据蛋白酶酶促蛋白质产物－氨基酸与某些物质（如铜盐蓝色络合物或茚三酮等）生成带颜色络合物。依溶液颜色深浅程度与氨基酸含量的关系，求出氨基酸量，以示蛋白酶活性。 3. 试验步骤 取2g过1mm筛的风干土置于50mL容量瓶中，加入10mL 1％用pH7.4磷酸盐缓冲溶液配制的白明胶溶液和0.5mL甲苯（作为抑菌剂抑制微生物活动）；在30℃恒温箱中培养24h；培养结束后，将瓶中内容物过滤；取5mL滤液置于试管中，加入0.5mL 0.1N硫酸和3mL 20％硫酸钠以沉淀蛋白质，然后滤入50mL容量瓶，并加入1mL 2％茚三酮溶液；将混合物仔细摇荡，并在煮沸的水浴中加热10min；将获得的着色溶液用蒸馏水稀释定容至刻度线；最后在560nm处进行比色。 用干热灭菌的土壤和不含土壤的基质（如石英砂）作对照，方法如前所述，以除掉土壤原有的氨基酸引起的误差。换算成甘氨酸的量，根据用甘氨酸标液制取的曲线查知。 4. 试剂配制 a. 1%白明胶溶液（用pH7.4的磷酸盐缓冲液配制）； b. 甲苯； c. 磷酸盐缓冲液（pH7.4）； d. 0.1N H2SO4; e. 20％ Na2SO4； f. 2％茚三酮溶液：将2g茚三酮溶于100mL丙酮，然后将95mL该溶液与1mL CH3COOH和4mL水混合制成工作液（该工作液不稳定，只能在使用前配制）； g. 甘氨酸标准液：浓度为1mL含100μg甘氨酸的水溶液：0.1g甘氨酸溶解于1L蒸馏水中。再将该标液稀释10倍得10μg甘氨酸•1mL-1溶液的甘氨酸工作液。 标准曲线绘制：分别吸取0、1、3、5、7、9、11mL该工作液于50mL容量瓶中即获得甘氨酸浓度分别为0、0.2、0.6、1.0、1.4、1.8、2.2μg•mL-1的标准溶液梯度，然后加入1mL 2％茚三酮溶液。冲洗瓶颈后将混合物仔细摇荡，并在煮沸的水浴中加热10min。将获得的着色溶液用蒸馏水稀释至刻度。在560nm处进行比色，最后绘制标准曲线。 5. 结果计算： 土壤蛋白酶的活性，以24h后1g土壤中甘氨酸的微克数表示。 甘氨酸（μg•g-1）－24小时后1g土壤中甘氨酸的微克数； c－标准曲线上查得的甘氨酸浓度，μg•mL-1； 50－显色液体积，mL； ts－分取倍数（这里是2＝10/5）； m－土壤质量，g。 方法来源：曹承绵, 张志明, 周礼恺. 几种土壤蛋白酶活性测定方法的比较. 土壤通报, 1982, 13(2): 39-40.