腺病毒纯化

两次氯化铯密度梯度离心纯化重组腺病毒 录入时间:2009-8-17 11:49:24 来源：青岛海博   腺病毒纯化包括3步： 1． 不连续氯化铯密度梯度离心去除主要的细胞污染物和缺陷性病毒颗粒。 2． 连续氯化铯密度梯度离心将感染性病毒颗粒和缺陷性病毒颗粒分开。 3． 透析去除氯化铯（去盐）。 连续密度梯度需要过夜离心。为保证时间安排，建议从早上开始第1步，这样大约在午后就可开始过夜离心。按照此时间安排，完整的一个纯化过程包括去盐在内大约需2天时间。 下面所有操作均以SW28转子30ml离心管为例。理论上讲，溶液体积调整后也可用其它大小的离心管，切记在离心后收集病毒带。由于有些污染物和成熟的病毒颗粒密度相近，因此这二条带之间的距离很小。在大直径的离心管中，病毒带更细，离原始位置更远，这样，病毒带在30ml离心管中比在12ml的管中更易分辨。 5.5.7 不连续密度梯度离心 注意：为确保氯化铯密度梯度后较易分辨病毒带，扩增病毒至少需要3×108细胞。 1． 预冷离心转子至4℃。 2． 在离心管中缓慢加入8ml 1.4g/ml氯化铯（53g+87ml 10mM Trz-HCL，PH 7.9），再非常轻缓地加入6ml 1.2g/ml氯化铯26.8+92ml10mM Tris-HCL，PH 7.9）。病毒最终的纯度有赖于密度梯度的质量。 3． 超净台中在不连续梯度顶部加入20ml DMEM5%病毒保存液，病毒量必须少于109细胞中所得的，否则将超过密度梯度负荷量。如果保存液的体积少于20ml，用PH 7.9 10mM Tris-HCL调至20ml。  4． 平衡离心管，100000×g（SW28转子上为23000rpw）4℃离心90分钟。 5． 超净台中取出离心管，用夹子直立固定离心管。 6． 用10ml移液器从梯度顶部吸去大部分杂质。 7． 在离心管外壁的穿刺点上贴上胶带，以防止在穿刺过程中有液体泄露。 8． 用带18G针头的5ml注射器从离心管外壁稍低于病毒带（最下的一条带）的位置进行穿刺。 注意：感染性和缺陷性病毒颗粒之间的区域通常较浑浊，切勿吸取这一浑浊区。 9． 小心抽吸病毒带，避免吸到其它带和杂质，拔出针头。  10． 取出针头，将含病毒的溶液转移至无菌15ml离心管。 11． 加入1倍体积1×TE，这一步对于把溶液密度降低至1.2以下是必须的，病毒带的密度大约为1.345。 5.7.2 连续密度梯度离心 1． 使用连续密度发生器将12ml 1.4g/ml和14ml 1.2g/ml氯化铯连续密度梯度加入离心管中。 2． 非常缓慢地在密度梯度顶部加入8-10ml 5.7.1第11步中稀释的病毒悬液。 3． 100000×g 4℃离心16-20小时。 4． 超速离心后，连续梯度溶液和不连续梯度溶液同样分层，但底部没有沉淀，因此通过底部穿刺即可获得感染性病毒带。溶液上部（含细胞成分）通常更为干净，大部分细胞碎片已通过第一步不连续梯度离心被去除了。 5． 用10ml移液器从离心管顶部吸去大部分梯度溶液和杂质，避免吸到底部含病毒的蓝白色条带。这有助于在收集病毒时降低溶液流出速度。 6． 用20 G针头从底部穿刺收集底部蓝白色病毒带。 7． 让底部梯度溶液流入烧杯，当接近病毒带时再转入50ml离心管中收集。 8． 蓝白色病毒带收集完后再将剩余的梯度溶液转入烧杯。 说明：当然，病毒带也可以象不连续梯度时一样从侧壁穿刺收集。 5.7.3 病毒溶液去盐和浓缩 氯化铯是通过透析去除的，这一步至关重要，因为高浓度氯化铯可能会影响病毒对细胞或组织的感染。透析液的选择取决于病毒的最终用途。如果用于动物，则应避免使用甘油，因为含有甘油的溶液极难注射；如果要使病毒滴度达到5×1011vp/ml，则应避免PBS-5%蔗糖缓冲液，因其不能提供良好的病毒稳定性，由于溶液PH的关系，病毒将会沉淀下来。含10mM Tris（PH8.0），2mM Mgcl2，5%蔗糖的病毒缓冲液可允许病毒浓缩至1013vp/ml，并且具有良好的稳定性。（Nyberg-Hoffman等，1999）。 将病毒带在分子筛为25000道尔顿的纤维素酯膜中进行4℃透析，去除氯化铯盐。由于病毒分子量较大，大小约90nm，因此不能穿过透析膜。缓冲液的体积应为病毒溶液的200倍，每次透析一小时，然后更换缓冲液，3次更换缓冲液后应已无痕量氯化铯。透析后的病毒溶液可在-80℃中长期保存，-20℃中则可保存较短时间。需要注意的是腺病毒在反复冻融后感染力将减弱，因此可将病毒分装成小份，一部分进行滴度测定（5.8：病毒滴度测定），剩下的用于以后的实验。如果透析后病毒溶液太稀，Millipore公司的超纯浓集柱可将病毒浓度提高10倍。这个过程中所丢失的病毒量小于10%。纯化柱在使用前必须用70%乙醇消毒，然后在加入病毒前再去除痕量乙醇（比如用病毒缓冲液）。