重组腺病毒A d2 p 16 的扩增及病毒滴度检测

　第 14 卷　第 1 期 医 学 研 究 生 学 报 V o l. 14　N o. 1 　2001 年 2 月 Jou rna l of M edica l Po stgraduate Feb. 2001 重组腺病毒A d2p 16 的扩增及病毒滴度检测 周文泉1, 　闵志廉1, 　李　莉2, 　张玲珍2 (第二军医大学长征医院, 上海 200003　1. 泌尿外科; 　2. 实验科) 摘要: 　目的: 探讨高效扩增腺病毒载体的。　方法: 用人胚胎肾 293 细胞株扩增重组腺病毒, 并测定病毒滴 度。　结果: 扩增得到腺病毒的滴度约为 5×108 PFU öm l。　结论: 用人胚胎肾 293 细胞株扩增重组腺病毒, 在不进 行任何浓缩时可达较高病毒滴度, 为腺病毒介导的基因转移方法提供了理论基础。 关键词: 　人胚胎肾 293 细胞; 　腺病毒 中图分类号: 　R 373　　　文献标识码: 　A 　　　文章编号: 　100828199 (2001) 0120044202 Genera tion of recom binan t adenov irus vector con ta in ing human p16 (Ad-p16) and titer detection of the adenov irus ZHOU W en2quan1,M IN Zh i2lian1,L I li2, ZHAN G L ing2zhen2 (1. D ep a rtm en t of U rology ; 　2. D ep a rm en t of L abora tory S cience, Chang z heng H osp i2 ta l, the S econd M ilita ry M ed ica l U n iversity , S hang ha i 200003, Ch ina) Abstract: 　O bj ectives: To invest iga te the m ethod of genera t ing recom b inan t adenoviru s 　收稿日期: 　2000206224 作者简介: 　周文泉 (1963- ) , 男, 山东昌邑人, 主治医师, 在读医学硕士研究生, 从事泌尿外科专业。现在南京军区南京总医院泌尿外科工 作。 改变, 包括 LDL 2C、apoB 和 L p (a) 增高, HDL 2C、 apoA 1 降低。以上的结果明, CET P 过度表达、血 清的CET P 活性或浓度增高, 加速CE 从HDL 至含 apoB 脂蛋白之间的交换, 使胆固醇逆向转运过程受 阻, 成为A S 形成和发展的重要成因。近年来, 国内 外发现的各种 CET P 基因缺陷患者 CET P 活性有 显著的降低, 因而 CET P 活性在脂蛋白代谢和A S 研究中成为一个十分有价值的指标。 参考文献: 1 　Zhong S, Sharp D S, Grove JS, et a l. Increased co ronary heart disease in Japaneses2Am erican m en w ith m utation in the cho lesteryl ester transfer p ro tein gene desp ite increased HDL levels[J . J C lin Invest, 1996, 97: 291722923. 2 　Bhatnagar D , D urrington PN , Channon KM , et a l. M I: In2 creased transfer of cho lestero l ester from h igh density lipop ro2teins to low density lipop ro teins and very low density lipop ro2teins in patien ts w ith angiograph ic evidence of co ronary arterydisease[J . A rterio sclero sis, 1993, 98: 25232.3 　JEM Groener, R Pelton, GM Ko stner. Imp roved estim ation ofcho lesteryl ester transferöexchange activity in serum o r p las2m a[J . C lin Chem , 1986, 32: 2832286.4 　Federico T aro, Glo ria L ena V ega, A lam R T all, et a l. Relationbetw een cho lestero l ester transfer p ro tein activity and lipop ro2tein cho lestero l in patien ts w ith hypercho lestero lem ia andcom bind hyperlip idem ia [J . A rterio sclero sis, T h rom bo sis, andV ascu lar B io logy, 1995, 15: 1122120.5 　Q uinet E, T all A , Ram ak rishnan R , et a l. P lasm a lip id transferp ro tein as a determ inat of the atherogenicity of monkey p lasm alipop ro teins[J . J C lin Invest, 1991, 87: 155921566.(本文责任编辑　陈根达) ·44· vecto r con ta in ing hum an p 16 (A d2p 16) efficien t ly. 　M ethods: R ecom b inan t adenoviru s vecto r w as genera ted w ith H EK 293 cells, and the t iter of the adenoviru s w as detected. 　Resu lts: T he t iter of genera ted adenoviru s is abou t 5×108 PFU öm l. 　Conclus ions: R ecom b inan t adenoviru s vecto r w as genera ted w ith H EK 293 cells w ith h igh t iter. T h is set the foundat ion of adenoviru s m edia ted gene2t ran sfer. Key words: 　H EK 293 cell; 　A denoviru s 0　引　　言 基因转染的生物学方法主要是指病毒介导基因 转移。用腺病毒作载体可高效地将目的基因直接导 入实验动物的细胞或组织中, 而且具有感染宿主范 围广、可感染非分裂相细胞、易于制备及纯化等优 点。本实验拟将含 p 16 基因的重组腺病毒载体A d2 p 16 导入人胚胎肾 293 细胞中进行扩增, 并以微量 全细胞病变法测定腺病毒滴度。 1　材料与方法 111　实验材料 11111　实验细胞　人胚胎肾 293 细胞株, 由中科院 上海生物化学研究所李林教授惠赠。 11112　重组腺病毒载体　外源性人 p 16 基因重组 腺病毒载体A d2p 16 由第二军医大学免疫学教研室 曹雪涛教授惠赠。腺病毒滴度为 1. 0×109 PFU öm l。 11113　主要试剂　DM EM (G IBCO 公司) , FBS (H yclone 公司) , 胰蛋白酶, ED TA , DM SO , H epes, L 2谷氨酰胺。 11114　实验器材　超净工作台, CO 2 培养箱, 倒置 相差显微镜, 低温高速离心机, 96 孔板, 细胞培养瓶 及 10 m l 离心管 (H yclone 公司)。 112　实验方法 11211　配制DM EM 培养基　DM EM 13. 4 göL , L 2谷氨酰胺 292 m göL , H epes 4. 77 göL , N aHCO 3 2 göL , 用双蒸水定容至 1 000 m l。加青霉素钠 100 单 位öm l, 链霉素 100 Λgöm l, 用 CO 2 气体调定 pH 至 7. 2～ 7. 4。用 0. 22 Λm 微孔滤膜过滤除菌, - 20℃ 保存备用。使用前加入经 56℃、30 m in 灭活的 FBS 至 10% , 即成为DM EM 完全培养基。 11212　293 细胞培养　293 细胞用DM EM 完全培 养基 (含 10% FBS)培养。加液前培养基在 37℃水浴 中预热, 用 1 m o löL HC l 调定培养基pH 值为 7. 0～ 7. 2。细胞在 37℃、含 5%CO 2 的孵箱中培养。传代 时, 用 0. 02% ED TA 及 0. 05% 胰酶顺次消化。冻存 液以 90% 灭活小牛血清+ 10% DM SO 配制。 11213　扩增重组腺病毒　以相同密度同时接种 4 瓶 (25 cm 2) 293 细胞, 生长至密度约为瓶底的 60% 时, 半量更换DM EM 完全培养基 (含 10% FBS)。4 h 后, 其中 3 瓶按M O I (M u lt ip licity of infect ion ) 100 加入A d2p 16 (1. 0×109 PFU öm l) , 另 1 瓶作细 胞计数。 细胞计数: 消化液完全消化瓶底细胞, 用无血清 DM EM 培养基 2 m l 吹打细胞, 制成单细胞悬液。微 量加于血细胞计数板, 显微镜下计数四角大方格中 的细胞数之和, 代入下式得细胞密度: 细胞数öm l= (4 大格细胞之和ö4)×104 每瓶细胞数约为 2. 5×106。每瓶内加入A d2p 16 250Λl, 轻振摇, 置 37℃、5% CO 2 条件下继续培养。上述 病毒加液量由① (美国Bax ter 公司张维维博士 提供)计算而得。 公式①:M O I= PFU öm l×V (加入的病毒体积)接种细胞数 24 h 后低倍镜观察 293 细胞已出现CPE 现象。 细胞呈局灶性融合, 部分细胞肿胀变圆。接种后 72 h 观察, 见超过 90% 的细胞变圆, 其中约 60% 的细 胞已浮起。将细胞及其上清收集至 10 m l 塑料离心 管中, 密封后至液氮中 10 s, 取出在室温下缓慢解 冻, 如此反复 5 次。镜下观察细胞全部裂解。置 4℃、 5 000 röm in 离心 20 m in。收集上清, 0. 22 Λm 微孔 滤膜过滤除菌, 按 10% 比例加入灭菌甘油, - 20℃ 保存。 11214　检测重组腺病毒滴度　采用微量全细胞病 变法检测病毒滴度 (参考复旦大学遗传学研究所方 法) , 取 96 孔板 1 块, 每孔加入 293 细胞 104 个, 加 液量 200 Λl, 置孵箱培养 24 h。待测病毒用DM EM 全培养基稀释至 10- 2、10- 3、10- 4、10- 5、10- 6、10- 7 等稀释度。吸去上清后, 分别加入每个稀释度的病毒 液体, 每孔 200 Λl, 每种样本均作复孔, 同时设培养 基对照 (不含腺病毒)。再置于 37℃、5% CO 2 条件下 继续培养 36～ 48 h。镜检观察CPE 现象, 按公式② (美国Bax ter 公司张维维博士提供) 计算病毒滴度。 公式②: PFU öm l= 接种细胞数×稀释度×10A döcellV (加入的病毒体积) ·54·　第 1 期　　周文泉, 等　重组腺病毒A d2p 16 的扩增及病毒滴度检测 2　结　　果 按M O I 100 接种腺病毒后 72 h, 40 倍光镜下 观察, 293 细胞出现完全 CPE 现象: 95%～ 100% 的 细胞变圆, 其中约 60% 脱落浮起, 未浮起者有聚集 融合现象。收集并裂解细胞获得待测腺病毒。 用微量全细胞病变法检测腺病毒滴度。按 104ö 孔 293 细胞接种腺病毒后 36～ 48 h, 观察到在 10- 2、10- 3稀释度的样本中 293 细胞出现完全 CPE 现象: 90% 细胞变圆, 10% 细胞浮起。按公式②计算 扩增所得腺病毒的滴度约为 5×108 PFU öm l。 3　讨　　论 293 细胞是复制缺陷性腺病毒载体的包装细 胞。将含有 E1 区的A d5 左侧约 14% 的DNA 整合 进入 293 细胞中, 可持久分泌产生腺病毒 E1 蛋白, 作为反式因子提供给复制缺陷性腺病毒的增殖 1 。 293 细胞的体外培养条件与一般细胞有所不 同, 其培养多以胎牛血清作为补充培养基 2, 3 。细胞 培养经典的pH 值范围是 7. 2～ 7. 4, 可略微偏酸, 不 能低于 6. 8 4, 5 。本实验发现, 293 细胞明显适应酸性 环境, 在 pH 6. 3～ 6. 7 环境中仍能生长和繁殖, 尤 其是在细胞复苏时。若pH 值超过 7. 4 时, 则细胞难 于贴壁, pH 7. 0～ 7. 2 较适合 293 细胞生长。 腺病毒基因转移载体系统包括重组载体和提供 重组病毒反式因子的细胞。目前, 大多以 2 型 (A d2) 和 5 型 (A d5) 腺病毒为基础, 采用外源基因替代腺 病毒基因中的一些反式功能基因的方式构建, 被替 代的主要是 E1 和 E3 区。E1 区为腺病毒复制所必 需, 其缺陷将导致产生复制缺陷型病毒。 本实验所用腺病毒载体为A d5。将含启动子的 外源性目的基因人全长 p 16 cDNA 或L acZ cDNA 插入A d5 的 E1 区, 成为携带p 16 和L acZ 基因的重 组腺病毒载体。这种用于基因治疗的重组腺病毒载 体缺失整个 E1a 和部分 E1b。由于 E1a 是腺病毒复 制所必需的, E1 缺陷型腺病毒载体需生长在含有 A d5 的 E1 区的 293 细胞中, 才能复制和产生感染 性病毒后代。所产生的病毒能感染许多类型的细胞, 并能表达所插入的外源基因, 但却不能在不表达 E1 区功能的细胞中复制 6 。 由于腺病毒宿主范围广, 可感染分裂和非分裂 终末分化细胞如神经元等, 且易于纯化和浓缩。病毒 滴度在不进行任何浓缩时可达 109～ 1010 PFU ö m l7 , 感染率高, 其DNA 不整合受体细胞基因组, 不使抑癌基因失活和原癌基因激活 8 。在基因治疗 特别是肿瘤基因研究中, 越来越多地应用腺病毒进 行基因转移, 如 Fu jiw ara 等 9 在原位用A d2p 53 感 染人肺癌细胞, 使其对化疗敏感性增加; Feng 等 10 采用A d 介导的抗R as 的核酶基因治疗取得了明显 疗效。在以 p 16 为靶基因的的抗肿瘤基因治疗研究 中, 腺病毒载体也被广泛应用, 如 Ch in ta la 等 11 用 重组 p 16 腺病毒载体转染脑胶质瘤, 使肿瘤细胞的 侵袭性受到明显抑制; Sanding 等 12 将 p 53 和 p 16 基因以腺病毒载体方式联合转染治疗肿瘤, 能 更显著地抑制肿瘤生长。 参考文献: 1 　唐镇生主编 1 分子外科与基因治疗[M . 上海: 上海医科大学 出版社, 1999. 26227. 2 　李红霞, 黎　健, 夏永静, 等 1Rb 基因导入对膀胱癌细胞生长 的抑制作用[J . 中国肿瘤生物治疗杂志, 1998, 5: 20223. 3 　H am a S, H eike Y, N aruse I, et a l. 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