食道癌的基因研究

http://www.paper.edu.cn - 1 - 中国科技论文在线 食管癌细胞中 fascin 基因核心启动子区关 键顺式作用元件的鉴定# 吴健谊1，陆晓峰2，杜则澎2，李恩民1，许丽艳2** 基金项目：教育部博士点基金博导类（20094402110005） 作者简介：吴健谊（1959 年-），女，实验师，肿瘤分子生物学 通信联系人：许丽艳（1964 年-），女，研究员，肿瘤分子病理学. E-mail: liyanxu1130@yahoo.com.cn （1. 汕头大学医学院生物化学与分子生物学教研室，广东 汕头 515041； 2. 汕头大学医学院肿瘤病理研究室，广东 汕头 515041） 摘要：目的：鉴定食管癌细胞中 fascin 基因核心启动子区的关键顺式作用元件。方法：以 人食管癌细胞为研究对象，综合运用生物信息学、嵌套缺失、定点突变和双荧光素酶报 告基因分析等实验技术手段。结果：在管癌细胞系 KYSE150、EC171 和 EC109 中，1）当 5' 端转录调控区从-2900 逐渐截短到-74 时，fascin 基因启动子的转录活性在三个食管癌细胞 系中的变化规律并不一致，在 KYSE150 中，总的趋势是启动子的转录活性逐渐降低，至-74 时大约降低了 50%；而在 EC171 和 EC109 中，随着序列被逐渐截短，启动子的转录活性不但 没有降低，反而还明显升高；2）5'端转录调控区从-74 截短到-41 时，fascin 基因启动子 在上述 3 种食管癌细胞中的转录活性几乎完全丧失；3）与转染含野生型 GCbox 位点的 pBF-255 和 pBF-74 相比，转染含 GC box 完全突变（-70/-60 位点）的基因质粒将导致 荧光素酶活性丧失约 80%，而转染含 GCbox 部分突变的报告基因质粒，也可以使报告基因荧 光素酶的活性显著下降。结论：在食管癌细胞中，fascin 基因的核心启动子区位于-74/-41 区段，而位于-70/-60 的 GC box 是调控 fascin 基因转录激活的关键顺式作用元件。 关键词：fascin 基因；顺式作用元件；转录调控；食管癌细胞 中图分类号：Q784；R735.1 Identification of a key cis-acting element in the core promoter of fascin in the esophageal carcinoma cells Wu Jianyi1, Lu Xiaofeng2, Du Zepeng2, Li Enmin1, Xu Liyan2 (1. Department of Biochemistry and Molecular Biology,Medical College of Shantou University, GuangDong ShanTou 515041; 2. Institute of Oncologic Pathology, Medical College of Shantou University, GuangDong ShanTou 515041) Abstract: OBJECTIVE: To identify a key cis-acting element in the core promoter of fascin in the esophageal cancer cells. METHODS: The potential transcription factor binding sites were analyzed and predicted using transcription factor database. Reporters of fascin promoter were constructed by PCR, nested deletion and site-directed mutagenesis. The activity of fascin promoter was determined by using dual-luciferase reporter assay system. RESULTS: When deletion of 5'flanking region of fascin from -2900nt to -74nt, the luciferase activity of the promoter was different in the various esophageal cancer cells, such as KYSE150, EC171 and EC109 cells. In KYSE150 cells, the activity was decreased with deletion of the sequences and the pBF-74 construct retained approximately ~50% luciferase activity, while the activity was increased with deletion of sequences to -74nt in EC171 and EC109 cells. The region from nt−74 to −41 seemed the most critical, since deletion of this sequence led to nearly complete loss of the activity in three esophageal cancer cells. Compared with the pBF-255 and pBF-74 constructs containing a GC box (from nt−70 to −60), the constructs, in which GC box was mutated, the luciferase activity was significantly decreased and only ~20% was preserved. CONCLUSION: the segment between −74 and −41 seems to be critically important to the fascin promoter activity and the GC box (−70/−60) functioned as an essential element of the promoter in esophageal cancer cells. Keywords:fascin; cis-acting element; transcriptional regulation; esophageal cancer cells http://www.paper.edu.cn - 2 - 中国科技论文在线 0 引言 fascin 基因编码蛋白产物是一种进化上高度保守的球形的肌动蛋白结合蛋白，在细胞内 主要与丝状肌动蛋白（filament actin，F-actin）结合，并使 F-actin 平行聚合形成肌动蛋白束， 参与以肌动蛋白为骨架的亚细胞成分的构成。这些亚细胞成分主要包括使细胞处于运动状态 的细胞皮质突起和细胞质内的微丝束。细胞皮质突起，例如细胞膜表面的丝状伪足 （filopodia）、微棘（microspikes）、层形足板（lamellipodia）、微绒毛（microvilli）、细 胞树突和细胞质中的张力纤维等结构，参与细胞迁移、细胞与细胞外基质之间粘附，以及细 胞间的相互作用等生物学过程[1,2]。 以往有研究发现，fascin 基因在许多上皮来源的肿瘤细胞系，如宫颈癌 HeLa、胃癌 AGS、 大肠癌 LIM1215 和 SW480、胰腺癌 BxPC3 和 T3H4 等中显著上调表达[3-5]。而在临床组织 标本中，与正常上皮组织相比，fascin 基因在胰腺导管癌、大肠腺癌和雌激素受体阴性的乳 腺癌等肿瘤组织中也均上调表达[3-5]。目前的研究结果提示，fascin 基因对于某些恶性肿瘤来 讲，可能会发展成为一个潜在的治疗靶点[6-8]，而检测 fascin 基因表达也可能会作为某些恶 性肿瘤判断预后或预警的分子标志。 有关食管癌中 fascin 基因的表达特征及其功能意义，近些年来陆续有研究报道[8]。我们 以往的研究发现，在永生化食管上皮细胞 SHEE 向食管癌细胞 SHEEmt 的恶性转化中，以及 在食管癌组织中，fascin 基因呈现明显上调或过表达[9]；并且与癌细胞的侵袭移动密切相关 [10,11]。然而，迄今为止，关于 fascin 基因在食管癌等恶性肿瘤中转录调控的分子依然不 甚清楚。本研究拟在以往研究基础上，进一步通过综合运用嵌套缺失、定点突变，结合报告 基因检测和生物信息学分析等方法手段，鉴定出调控食管癌细胞 fascin 基因转录的关键顺式 作用元件，为进一步阐明食管癌细胞中 fascin 基因表达调控的分子机制提供基本实验数据。 1 材料与方法 1.1 质粒 pGL3-Basic(pGLB)和 pRL-TK 购自 Promega 公司(Madison,WI, USA)。pBF-2900、pBF- 1848、pBF-1435、pBF-825、pBF-436 等 fascin 基因 5'端转录调控区不同长度片段萤火虫荧 光素酶报告基因质粒由汕头大学医学院生物化学与分子生物学教研室构建[12]。 1.2 嵌套缺失实验 以实验室保存的插有 fascin 基因 5'端转录调控区的质粒 pBF-1435 为模板进行嵌套缺失 实验，pGL3-Basic 上有 Kpn I和 Mlu I限制性酶切位点，Mlu I限制性内切酶可使 DNA 形成 5'突出末端，可进一步被外切核酸酶 ExoIII降解；而 Kpn I限制性内切酶可使 DNA 形成 3'突 出末端，不能被 ExoIII降解。将质粒 pBF-1435 经 Kpn I/Mlu I双酶切后，再经 ExoIII酶切。 取不同反应时间的酶切后产物，用 S1 核酸酶切除单链 DNA，Klenow 补平末端后，T4DNA 连接酶使片段自连，连接产物转化大肠杆菌 JM109，提取质粒，用 pGL3-Basic 载体引物 Rvprimer3 和 FasnR（序列见表 1）进行 PCR，选取阳性克隆进行测序验证（上海基康生物 技术有限公司）。 1.3 fascin 基因 5'端转录调控区缺失载体的 PCR 法构建 通过生物信息学方法预测-387 到+1 区段内可能存在转录调控元件，为此设计了 5 条 5' 端引物：F255，F168，F88，F74 及 F40（引物序列见表 1），以 pBF-387 为模板，并以 3' http://www.paper.edu.cn - 3 - 中国科技论文在线 端引物 FasnR 为共用引物进行 PCR 扩增，回收所扩增的目的片段，Mlu I/Hind III双酶切后， 连接到 pGL3-Basic 载体的 Mlu I/Hind III中，以各自引物进行 PCR 筛选阳性克隆，并进行测 序鉴定。 表 1 构建 fascin 启动子区 5'缺失子引物序列 Tab. 1 Primers for preparing the 5'-deletion constructs of the fascin promoter region Primers Sequences Cutting site Position(EU486847) Length (bp) F-255 5'-ACGCGTCGGGGGGGTTAGGTGGCTGG-3' Mlu I -255~-226 377 F-168 5'-ACGCGTACCGGTGGGGTGAGAGCACCGG-3' Mlu I -168~-147 290 F-88 5'-ACGCGTGAGCCAGGGGCGGGACAGG-3 Mlu I -88~-70 211 F-74 5'-ACGCGTACAGGGGGGCGTGGCCTGG-3' Mlu I -74~-55 196 F-40 5'-ACGCGTCTCGCCTATAAAATGTCCGG-3' Mlu I -40~-21 162 R-Fasn 5'-AAGCTTGGTGGCAGTAGACGAGAGGCCGCTG-3 Hind III +122~+97 1.4 fascin 基因 5'端转录调控区定点突变载体的构建 针对-74/-41区段序列设计 5'端定点突变引物，引物序列见表 2，分别就-74/-69、-70/-60、 -68/-63 及-66/-57 区段相应位置的核苷酸进行置换突变。以野生型 pBF-74（-74/ +122）为 模板，分别以上述 5'定点突变引物及 3'端共用引物进行 PCR 扩增，回收所扩增的目的片段， 连接至中间载体 pMD18-Tvector（TaKaRa 公司）中，经测序鉴定目的序列确已发生突变后， 对此中间重组子进行 Mlu I/ Hind III限制性双酶切，回收含突变序列的目的片段，并亚克隆 至 pGL3-basic 载体相应的酶切位点上。 表 2 以 pBF-74 为模板构建突变子引物序列 Tab. 2 Primers for preparing site-directed mutations using pBF-74 construct as amplified template Primers Sequences Cutting site Position 5'-ACAGGGGGGCGTGGCCTGGTGGCGCTGACGTCAC-3' -74~-41 F-74/-69s 5'-ACGCGTGTCGACGGGCGTGGCCTGGTGGCGCTGACGTCAC-3' Mlu I -74~-41 F-70/-60s 5'-ACGCGTACAGTATCTATGTTACTGGTGGCGCTGACGTCAC-3' Mlu I -74~-41 F-68/-63s 5'-ACGCGTACAGGGGTCGACGGCCTGGTGGCGCTGACGT CAC-3' Mlu I -74~-41 F-66/-57s 5'-ACGCGTACAGGGGGTATGTTAAGTGTGGCGCTGACGTCAC-3' Mlu I -74~-41 F-62/-57s 5'-ACGCGTACAGGGGGGCGTGAATTCGTGGCGCTGACGTCAC-3' Mlu I -74~-41 R-Fasn 5'-AAGCTTGGTGGCAGTAGACGAGAGGCCGCTG-3 Hind III +122~+97 1.5 细胞与细胞培养 食管癌细胞系 KYSE150、EC171 和 EC109，在含 10%小牛血清的 199 培养基或 DMEM （Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)培养基中贴壁生长，5% CO2，37℃，湿度 95%．用含 0.25%胰蛋白酶和 0.02%EDTA 的消化液消化，进行细胞传代。对于需转染的细胞，将细胞 接种于 96 孔细胞培养板或 6 孔细胞培养板中，当细胞汇合率为 50%～80%时，可用于质粒 瞬时转染实验。 1.6 瞬时转染与双荧光素酶活性检测 接种于 96 孔培养板中的食管癌细胞用于双荧光素酶活性检测。提取质粒并测定其含量。 用缓冲液 EB(QIAGEN 公司质粒提取试剂盒中提供)将 pGLB 以及含 fascin 基因 5'端转录调 控区序列的重组 pGLB 质粒稀释至 100ng/μl，内参照质粒 pRL-TK 稀释至 20ng/μl，然后将 http://www.paper.edu.cn - 4 - 中国科技论文在线 pGLB 和重组 pGLB 质粒分别与 pRL-TK 按 50∶1 混合，即 1μg∶0.02μg。质粒瞬时转染步 骤参照 Superfect 转染试剂(QIAGEN, Mainz, Germany)#说明#进行。转染后继续培养 48h， 收获细胞。每组实验样品 3 个平行实验孔，并至少进行 3 次独立重复实验。 双荧光素酶活性检测参照双荧光素酶报告基因分析系统（Promega 公司）操作手册，在 TD20/20 型照度计上进行。根据 TD20/20 型照度计配置的软件包计算出各组转染细胞的相对 荧光素酶活性(萤火虫荧光素酶/海肾荧光素酶)，以此代表重组 pGLB 质粒报告基因启动子的 转录活性。 1.7 统计学分析 各组启动子转录活性实验数据均计算平均值与偏差( ±s)，应用 SPSS13.0 软件 (SPSS, Chicago, IL,USA)对各组实验数据之间是否有显著性差别进行方差分析，P< 0.05 表 示有统计学意义。 2 结果 2.1 fascin 基因 5′端转录调控区不同长度的报告基因表达质粒的构建 以 pBF-1435 为模板，通过嵌套缺失实验，构建 fascin 基因 5′端转录调控区不同长度的 萤火虫荧光素酶报告基因表达质粒。采用 PCR 方法，结合 1%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，实 验结果见图 1。从图 1 可见，与 pBF-1435 质粒所插入的外源片段相比，来源于各嵌套缺失 子质粒中的外源片段的大小依次被截短，表明成功构建了以 pBF-1435 为模板，所插入的外 源片段依次被截短的系列嵌套缺失质粒。而进一步的测序结果显示，已获得一系列 fascin 基 因 5'端转录调控区逐渐被缩短的萤火虫荧光素酶报告基因表达质粒 pBF-1148（-1148/+122）、 pBF-808（-808/+122）、pBF-610（-610/+122）、pBF-508（-508/+122）、pBF-387（-387/+122）、 pBF-316（-316/+122）、pBF+19（+19/+122）和 pBF+82（+82/+122）。 2.2 fascin 基因 5′端转录调控区缺失不同转录调控元件的报告基因表达质粒的 构建 以质粒 pBF-387 为模板，用 PCR 法扩增 fascin 基因 5′端转录调控区缺失不同转录调控 元件的片段，插入 pGL3-Basic 载体中，进一步获得 fascin 基因 5′端转录调控区缺失不同转 录调控元件的萤火虫荧光素酶报告基因表达质粒。PCR 产物经 1.5%琼脂糖凝胶电泳进行鉴 定，实验结果见图 2。从图 2 可见，所获得 PCR 产物的大小与设计的长度一致。而进一步 的测序分析也验证了序列的正确性。这表明已成功获得 fascin 基因 5′端转录调控区缺失不同 转录调控元件的报告基因表达质粒，包括 pBF-255（-255/+122）、pBF-168（-168/+122）、 pBF-88（-88/+122）、pBF-74（-74/+122）和 pBF-40（-40/+122）。 M -1435 -1148 -808 -610 -508 -387 -316 +19 +82 1000bp → M -1435 -1148 -808 -610 -508 -387 -316 +19 +82 1000bp → 图 1 fascin 基因 5′端转录调控区不同长度报告基因表达质粒的 PCR 鉴定结果 Fig. 1 Identification of PCR product from different length reporters of 5'regulation region of fascin M：200bp DNA Marker http://www.paper.edu.cn - 5 - 中国科技论文在线 500bp → M -255 -168 -88 -74 -40 500bp → M -255 -168 -88 -74 -40 图 2 fascin 基因 5′端转录调控区缺失不同转录调控元件的报告基因表达质粒的 PCR 鉴定结果 Fig. 2 Identification of PCR product from the reporters with deleted cis-acting elements of 5'regulation region of fascin M, 100bp DNA Marker 2.3 fascin 基因 5′端转录调控区定点突变子的鉴定 以野生型 pBF-74 为模板，以 5′端引物为定点突变引物，以 3′端引物为共用引物，进行 PCR 扩增，各 PCR 产物，包括-74/-69s、-70/-60s、-68/-63s、-66/-57s 和-62/-57s 等，经 琼脂糖凝胶电泳进行初步鉴定，鉴定实验结果见图 3a。然后，将各 PCR 产物分别克隆至中 间载体 pMD18-T vector 中，构建中间重组子，进行测序鉴定，详见图 4。从图 4 可见，与野 生型（-74/-41w）相比，所设计的相应位置的核苷酸的确发生了置换突变。在此基础上，对 这些中间重组子进行 Mlu I/ Hind III双酶切，回收目的片段，定向亚克隆到 pGL3-Basic 载体 的 Mlu I/Hind III位点，双酶切鉴定亚克隆重组子的琼脂糖凝胶电泳实验结果见图 3b。从图 3b 可见，所构建的重组表达载体 pBF-74/-69s、pBF-70/-60s、pBF-68/-63s、pBF-66/-57s 和 pBF-62/-57s 切出的目的片段大小与原 PCR 片段大小一致(图 3a)，表明已经成功获得核 苷酸定位置换突变的重组报告基因质粒。 (b) pB F-7 4/- 69 s pB F- 70 /-6 0s pB F- 68 /-6 3s pB F-6 6/- 57 s pB F-6 2/- 57 s M (a) -74 /-6 9s -70 /-6 0s -68 /-6 3s -66 /-5 7s -62 /-5 7s M 500bp → 500bp → (b) pB F-7 4/- 69 s pB F- 70 /-6 0s pB F- 68 /-6 3s pB F-6 6/- 57 s pB F-6 2/- 57 s M (a) -74 /-6 9s -70 /-6 0s -68 /-6 3s -66 /-5 7s -62 /-5 7s M 500bp → 500bp → 图 3 fascin 基因 5′端转录调控区突变子的鉴定 (a) fascin基因 5′端转录调控区定点突变 PCR 产物的鉴定 (b) 重组 fascin基因 5′端转录调控区定点突变子质 粒 Mlu I 和 Hind III 双酶切鉴定 Fig. 3 Identification of mutant constructs of. 5'regulation region of fascin (a) Identification of PCR product with site-directed mutagenesis of. 5'regulation region of fascin (b) Identification of recombinant site-directed mutants of 5‘regulation region of fascin by digested with Mlu Iand Hind III. M, 100bp DNA Marker http://www.paper.edu.cn - 6 - 中国科技论文在线 -74/-69s -70/-60s -68/-63s -66/-57s -66/-57s -74/-41w -74/-69s -70/-60s -68/-63s -66/-57s -66/-57s -74/-41w 图 4 fascin 基因 5′端转录调控区定点突变质粒测序结果 Fig. 4 The sequencing of site-directed mutants of 5‘regulation region of fascin -74/-41w 为野生型 pBF-74 质粒；-74/-69s, -70/-60s, -68/-63s , -66/-57s 和-62/-57s 为 GC box 位点突变质粒 -74/-41w means pBF-74; -74/-69s, -70/-60s, -68/-63s , -66/-57s and -62/-57s means mutated GC box site. 2.4 fascin 基因核心启动子区的鉴定 将携有 fascin 基因 5′端转录调控区不同长度的 DNA 序列片段的报告基因载体，包括 pBF-2900、pBF-1848、pBF-1435、pBF-1148，pBF-825、pBF-808，pBF-610，pBF-508， pBF-436、pBF-387，pBF-316，pBF-255、pBF-168、pBF-88、pBF-74、pBF-40、pBF+19 和 pBF+82，分别与内参照质粒 pRL-TK 共转染食管癌细胞系 KYSE150、EC171 和 EC109， 检测相对荧光素酶活性，检测结果见图 5。从图 5可见，1）在本文的实验条件下，-74/+122 是 fascin 基因表现其启动子转录活性的最短片段；2）从-2900 逐渐截短到-74 时，fascin 基 因启动子的转录活性在三个食管癌细胞系中的变化规律并不一致，在 KYSE150 中，总的趋势 是启动子的转录活性逐渐降低，至-74 时大约降低了 50%；而在 EC171 和 EC109 中，随着 序列被逐渐截短，启动子的转录活性不但没有降低，反而还明显升高；3）从-74 截短到-41 时，fascin 基因启动子在上述 3种食管癌细胞中的转录活性几乎完全丧失。上述实验结果说 明，在管癌细胞系 KYSE150、EC171 和 EC109 中，fascin 基因的-74/-41 区段是该基因启动 子的核心区序列。 http://www.paper.edu.cn - 7 - 中国科技论文在线 Luc +1 -2900 Luc +1 -1848 Luc +1 -1435 Luc +1 -1148 Luc +1 -825 +1 Luc -808 Luc +1 -610 Luc +1 -508 +1 Luc -436 Luc +1 -387 -316 Luc +1 -255 Luc +1 -85 Luc +1 -74 +1 Luc +1 -40 Luc Luc +19 Luc +82 Luc +1 -168 Luc 0 100 200 300 400 500 vector +82 +19 -40 -74 -85 -168 -255 -316 -387 -436 -508 -610 -808 -825 -1148 -1435 -1848 -2900 KYSE150 EC109 EC171 相对荧光素酶活性(%) ** **** Luc +1 -2900 Luc +1 -1848 Luc +1 -1435 Luc +1 -1148 Luc +1 -825 +1 Luc -808 Luc +1 -610 Luc +1 -508 +1 Luc -436 Luc +1 -387 -316 Luc +1 -255 Luc +1 -85 Luc +1 -74 +1 Luc +1 -40 Luc Luc +19 Luc +82 Luc +1 -168 Luc Luc +1 -2900 Luc +1 -2900 Luc +1 -1848 Luc +1 -1848 Luc +1 -1435 Luc +1 -1435 Luc +1 -1148 Luc +1 -1148 Luc +1 -825 Luc +1 -825 +1 Luc -808 +1 Luc -808 Luc +1 -610 Luc +1 -610 Luc +1 -508 Luc +1 -508 +1 Luc -436 Luc +1 -387 +1 Luc -436 Luc +1 -387 Luc +1 -387 -316 Luc +1 -316 Luc +1 -255 Luc +1 -255 Luc +1 -85 Luc +1 -85 Luc +1 -74 +1 Luc -74 +1 Luc +1 -40 Luc +1 -40 Luc Luc +19 Luc +19 Luc +82 Luc +82 Luc Luc +1 -168 Luc +1 -168 Luc 0 100 200 300 400 500 vector +82 +19 -40 -74 -85 -168 -255 -316 -387 -436 -508 -610 -808 -825 -1148 -1435 -1848 -2900 KYSE150 EC109 EC171 相对荧光素酶活性(%) ** **** ** **** 图5 fascin基因启动子区转录调控元件定位分析 Fig. 5 Localization analysis of the transcriptional regulatory element in fascin promoter by using dual-luciferase reporter assay system 以pBF-2900质粒报告基因荧光素酶的活性作为100%，以pGL3-Basic vector 作为空白对照。每个质粒均进行 3次独立的实验，而每次实验均设3个平行样，计算平均值与标准差。星号 (**)代表与pBF-74组数据比较， 报告基因荧光素酶活性的差异有统计学意义， P < 0.01. The pBF-2900 construct was set as 100% .pGL3-Basic vector (vector) was served as a blank control. The data are representative of at least 3 independent experiments. Transfections were carried out in triplicate for each experiment. The asterisks (**) indicate P < 0.01, compared with the group transfected with the pBF-74 construct. 2.5 fascin 基因启动子核心区关键顺式作用元件的鉴定 利用转录因子预测程序http://www.generegulation.com/pub/programs/alibaba2对 fascin 基 因启动子的-74/-1 区段，包括核心区段(-74/-41)，进行转录因子结合位点预测，结果发现， 这一区域存在两个潜在的转录因子结合位点，其中-70/-60(GGGGGCGTGGC)为 GC box， -50/-41(CTGACGTCAC)为转录因子 CRE/AP-1 的经典结合位点，-34/-28(TATAAAA)为一 个经典的 TATA box，详见图 6。在以往的研究中我们曾发现，在食管癌细胞 EC109 中，当 缺失 CRE/AP-1 位点或同时缺失 CRE/AP-1 位点和 TATA box 时，fascin 基因的转录活性， 相对于野生型-387/+122，下降得并不明显；而当缺失 GC box 时，fascin 基因的转录活性明 显下降[13]，这提示 GC box(-70/-60)可能是启动子核心区段的关键顺式作用元件。为了进一 步证明这一点，将含有 GC box 元件的野生型质粒 pBF-255 和 pBF-74，以及该 GC box 元件 位点完全突变质粒 pBF-70/-60s、部分位点突变质粒 pBF-74/-69s、pBF-68/-63s、pBF-66/-57s 和pBF-62/-57s分别与内参照质粒PRL-TK共转染至食管癌细胞KYSE150、EC171和EC109， 检测相对荧光素酶活性，检测结果见图 7。从图 7可见，在上述 3 种食管癌细胞中，与转染 含野生型 GC box 位点的 pBF-255 和 pBF-74 相比，转染含 GC box 完全突变（-70/-60 位点） 的报告基因质粒将导致荧光素酶活性丧失约 80%，而转染含 GC box 部分突变的报告基因质 http://www.paper.edu.cn - 8 - 中国科技论文在线 粒，也可以使报告基因荧光素酶的活性显著下降。这表明 fascin 基因启动子区-70/-60 区段 的 GC box 元件，可能是食管癌细胞中调控 fascin 基因转录的关键顺式作用元件。 -74ACAGGGGGGCGTGGCCTGGTGGCGCTGACGTCACCTC GCCTATAAAATGTCCGGGGCGCCGCTAGCTGGGCTTT-1 GC box CRE/AP1 TATA box -74ACAGGGGGGCGTGGCCTGGTGGCGCTGACGTCACCTC GCCTATAAAATGTCCGGGGCGCCGCTAGCTGGGCTTT-1 GC box CRE/AP1 TATA box 图 6 fascin 基因启动子-74/-1 区段转录因子结合位点预测结果 Fig. 6 Prediction of transcription factor binding sites in the segment from −74 to +1 of fascin promoter GC box(−70/−60)、CREB/AP-1 结合位点(−50/−41)和 TATA box (−34/−28)用下划线表示 The GC box (−70/−60), CREB/AP-1 binding site (−50/−41) and TATA box (−34/−28) were showed by underline. 3 讨论 基因在转录水平上的调控是基因表达调控的最关键环节，主要涉及顺式作用元件和反式 作用因子两个方面。有关 fascin 基因转录调控分子机制方面的研究，近年曾有人报道。2003 年，Bros 等人在研究树突状细胞成熟分子机制中发现，fascin 基因的启动子位于该基因 5' 端 3kb 区域内。该基因的上调表达由这一区段中的某种或某些顺式作用元件控制。而在距起 始密码子约 200bp 内鉴定出一个核心启动子区域，含有一个典型的 GCbox，一个 cAMP 反 应元件/AP-1 结合位点的复合序列和一个 TATA box[14]。2005 年，Francesca M 等人研究发现， 在神经元前体细胞 NT2 中，通过 RNA 干扰实验技术，沉默 CREB 元件结合蛋白 CBP，可 使 fascin 基因的表达明显下降，表明 CREB 结合蛋白 CBP 可能参与了神经元中 fascin 基因 的转录调控[15]。2007 年，Vignjevic D 等人研究报道，在人结直肠癌细胞中，β-catenin-TCF 信号通路参与了 fascin 基因的转录调控[16]。2009 年，Hashimoto 等人研究发现，在乳腺癌、 结肠癌和真皮成纤维细胞等多个 fascin 表达的细胞系中，-219/+114 是调控 fascin 基因转录 的核心启动子区；而在结肠癌细胞系中研究发现，在该区域中发挥关键转录调控作用的是 CREB 元件和 AhR 结合基序[17]。上述这些研究结果提示，fascin 基因的转录调控具有细胞和 组织特异性。 http://www.paper.edu.cn - 9 - 中国科技论文在线 0 20 40 60 80 100 120 vector -40 -62/-57s -66/-57s -68/-63s -70/-60s -74/-69s -74 -255 KYSE150 EC171 EC109 相对荧光素酶活性(%) ** ** ** 0 20 40 60 80 100 120 vector -40 -62/-57s -66/-57s -68/-63s -70/-60s -74/-69s -74 -255 KYSE150 EC171 EC109 相对荧光素酶活性(%) ** ** ** 图 7 GC box(-70/-60)是 fascin 基因启动子区关键顺式作用元件鉴定结果 Fig. 7 Identification of GC box (-70/-60) as the key element for the fascin promoter 以 pBF-74 质粒报告基因荧光素酶的活性作为 100%，以 pGL3-Basic vector 作为空白对照。每个质粒均进行 3 次独立的实验，而每次实验均设 3 个平行样，计算平均值与标准差。星号 (**)代表与 pBF-74 组数据比较， 报告基因荧光素酶活性的差异有统计学意义, P < 0.01。 The pBF-74 construct was set as 100% .pGL3-Basic vector (vector) was served as a blank control. The data are representative of at least 3 independent experiments. Transfections were carried out in triplicate for each experiment. The asterisks (**) indicate P < 0.01, compared with the group transfected with the pBF-74 construct. 我们实验室以往研究发现，在食管癌细胞中，fascin 基因的核心启动子区位于转录起始 位点上游-436bp 内[13]。在本文中，我们通过联合运用嵌套缺失、特异 PCR 法扩增、定点突 变和双荧光素酶报告基因检测分析等实验手段，鉴定出食管癌细胞中 fascin 基因的核心启动 子区为-74/-41 区段，并进一步锁定其中的 GC box(-70/-60)是调控 fascin 基因转录激活的最 关键顺式作用元件。而该区段中的复合元件，cAMP 反应元件/AP-1 结合位点，在食管癌 fascin 基因转录激活中不发挥作用。有研究报道，GC box 存在于多种基因的启动子区，可以与 Sp1 等多种转录因子特异性结合[18]。而我们最近的研究结果表明，在食管癌组织细胞中，转录 因子 Sp1 可能正是结合 fascin 基因启动子区 GCbox 元件，激活其转录的核蛋白因子（另文 发表）。 4 结论 本文研究证明，在食管癌细胞中，fascin 基因的核心启动子区位于-74/-41 区段，调控 fascin 基因转录激活的关键顺式作用元件为位于-70/-60 的 GCbox。这将十分有助于进一步深 入揭示食管癌等恶性肿瘤中 fascin 基因转录调控的分子机制。 [参考文献] (References) [1] KUREISHY N, SAPOUNTZI V, PRAG S, et al. Fascins, and their roles in cell structure and function [J]. Bioessays, 2002, 24(4): 350~361. [2] ADAMS J C. Roles of fascin in cell adhesion and motility [J]. 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