PCR反应体系中各种成分的作用

PCR反应体系中各种成分的作用 不同模板浓度的实验结果 用相同的引物、两种不同的模板,对 6 种不同模板量进行ＰＣＲ 扩增,发现在模板量<25ｎｇ的条件下,扩增产物强度相应减弱,大约 到 2ｎｇ左右时无扩增产物;当模板量在 25ｎｇ～200ｎｇ之间时,扩 增产物基本稳定,条带清晰、稳定,分辨率高;当模板量>200ｎｇ时, 会出现大片段扩增产物的缺失或无扩增产物,且点样孔至泳道会出现 相应增强的弥散背景。综合考虑,在 25μ ｌ的ＰＣＲ反应体系中,模 板ＤＮＡ以 25～100ｎｇ为最适用量。同时模板ＤＮＡ在 200ｎｇ以 下不影响扩增结果,但为降低ＴＥ缓冲液中ＥＤＴＡ对反应体系中Ｍ ｇ2+的不良影响程度,应该尽量降低ＤＮＡ模板用量。 不同Ｍｇ2+浓度时实验结果 设置不同Ｍｇ2+浓度,当Ｍｇ2+浓度为 1 0ｍＭ时,无ＰＣＲ扩增 产物;Ｍｇ2+浓度为 1 5～2 5ｍＭ时,随着Ｍｇ2+浓度的增加,ＰＣＲ 扩增产物带型基本一致,但以 2 0ｍＭ的扩增效果最好 不同引物浓度对ＰＣＲ结果的影响 设置 5 种不同浓度的引物进行ＰＣＲ扩增,当引物浓度在 0 1～0 2μ Ｍ时,扩增结果基本一致;但随着引物浓度的逐渐增加,开始出现 弥散背景增强的趋势,并且有些扩增带发生减弱或缺失。为了保证反 应结果的稳定性和特异性,引物浓度以 0 .2μ Ｍ左右为宜。 不同ｄＮＴＰ浓度对ＰＣＲ结果的影响 采用 2 种引物(ＯＰＢ17、ＯＰＡ16),分别以 4 种不同的ｄＮＴ Ｐ浓度进行ＰＣＲ反应,发现ｄＮＴＰ浓度在 100μ Ｍ、150μ Ｍ、200 μ Ｍ、300μ Ｍ时,随着浓度的减小,扩增带明显减少或扩增强度减弱, 当ｄＮＴＰ浓度<200μ Ｍ时,扩增产物丰富、清晰、带浓,扩增片段产 率与ｄＮＴＰ浓度呈正相关。综合考虑,以 100～200μ Ｍ的ｄＮＴＰ 浓度为佳。 ＴａｑＤＮＡ聚合酶对扩增结果的影响 设置 5 个梯度的ＴａｑＤＮＡ聚合酶浓度,结果表明随着Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶浓度的增高,扩增产物量呈增多趋势。在 0 5ｕ～2 5ｕ 浓度间均有扩增产物,但随着ＴａｑＤＮＡ聚合酶浓度增加的同时, 弥散背景也相应增强。综合考虑,ＴａｑＤＮＡ聚合酶浓度以 1 0～1 5ｕ结果较好 不同退火温度下的扩增效果 引物用ＯＰＤ16和ＯＰＡ01,按照优化的ＰＣＲ反应体系将退火 温度分别设置为 33℃、36℃、39℃、42℃。结果表明随着退火温度 降低,非特异性产物增加,有弥散背景;退火温度升高,特异性相对增 加。 Ｍｇｃｌ2 与ｄＮＴＰ互相作用及对ＰＣＲ反应的影响 用 同一引物ＯＰＤ07、相同模板ＤＮＡ比较 3 种Ｍｇ Ｃｌ2 浓度与 3 种ｄＮＴＰ浓度完全随机相结合的 9 个处理的ＰＣＲ结果,研究了Ｍ ｇｃｌ2 与ｄＮＴＰ的相互作用。结果表明,Ｍｇｃｌ2 在低浓度时, 过量的ｄＮＴＰ对Ｍｇ2+的螯合作用明显,表现为降低Ｍｇ2+的酶催 作用,ＰＣＲ扩增产物减少或无,而低量的ｄＮＴＰ对Ｍｇ2+酶催的 抑制作用减少,ＰＣＲ扩增产物增多。在高浓度Ｍｇｃｌ2 浓度下,ｄ ＮＴＰ无抑制作用。在相同Ｍｇ2+离子浓度和足量ｄＮＴＰ时,扩增 产物相似。1-9 泳道分别代表Ｍｇｃｌ2(ｍＭ)/ｄＮＴＰ(μ Ｍ)的浓 度(1/100、1/200、1/300、2/100、2/200、2/300、3/100、3/200、 3/300)。 PCR反应体系与反应条件 标准的 PCR 反应体系： 10×扩增缓冲液 10ul 4种 dNTP 混合物 各 200umol/L 引物 各 10～100pmol 模板 DNA 0.1～2ug Taq DNA 聚合酶 2.5u Mg2+ 1.5mmol/L 加双或三蒸水至 100ul PCR反应五要素： 参加 PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、 模板和 Mg2+ 引物： 引物是 PCR 特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决 于引物与模板 DNA 互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板 DNA 序列，就能按其互补的寡核苷酸链做引物，利用 PCR就可将模板 DNA在体外大量扩增。 设计引物应遵循以下： ①引物长度： 15-30bp，常用为 20bp左右。 ②引物扩增跨度： 以 200-500bp 为宜，特定条件下可扩增长至 10kb 的片段。 ③引物碱基：G+C 含量以 40-60%为宜，G+C 太少扩增效果不佳， G+C过多易出现非特异条带。ATGC 最好随机分布，避免 5个以上的嘌 呤或嘧啶核苷酸的成串排列。 ④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3’ 端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。 ⑤引物 3’端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要 求配对，以避免因末端碱基不配对而导致 PCR失败。 ⑥引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适 宜的酶切位点，这对酶切或分子克隆很有好处。 ⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同 源性。 引物量： 每条引物的浓度 0.1～1umol或 10～100pmol，以最低 引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性 扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。 酶及其浓度 目前有两种 Taq DNA 聚合酶供应， 一种是从栖热 水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化 一典型的 PCR 反应约需酶量 2.5U(指总反应体积为 100ul 时)，浓度 过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。 dNTP 的质量与浓度 dNTP的质量与浓度和 PCR 扩增效率有密切 关系，dNTP 粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP 溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以 1M NaOH 或 1M Tris。HCL 的缓冲液将其 PH 调节到 7.0～7.5，小量分装， -20℃冰冻保存。多 次冻融会使 dNTP 降解。在 PCR 反应中，dNTP 应为 50～200umol/L， 尤其是注意 4种 dNTP 的浓度要相等( 等摩尔配制)，如其中任何一种 浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。浓度过低又会 降低 PCR产物的产量。dNTP能与 Mg2+结合，使游离的 Mg2+浓度降低。 模板(靶基因)核酸 模板核酸的量与纯化程度，是 PCR 成败与否 的关键环节之一，传统的 DNA纯化通常采用 SDS 和蛋白酶 K来消 化处理标本。SDS 的主要功能是： 溶解细胞膜上的脂类与蛋白质， 因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS 还能与 蛋白质结合而沉淀；蛋白酶 K能水解消化蛋白质，特别是与 DNA结合 的组蛋白，再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用 乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作为模板用于 PCR 反应。一 般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消 化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于 PCR扩增。RNA模板 提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶 K法，要防止 RNase 降解 RNA。 Mg2+浓度 Mg2+对 PCR 扩增的特异性和产量有显著的影响，在一 般的 PCR反应中，各种 dNTP 浓度为 200umol/L 时，Mg2+浓度为 1.5～ 2.0mmol/L为宜。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增， 浓度过低会降低 Taq DNA 聚合酶的活性，使反应产物减少。 PCR 扩增时建议在混合物上面铺一层石蜡油，减少 PCR 过程中尤 其是变性时液体蒸发所造成的产物的丢失。研究表明，应用石蜡油可 使扩增产量增加 5 倍，可能与石蜡油维持热恒定和整个反应体系中盐 浓度有关。 尿嘧啶－DNA－糖基酶（UDG） 就是在 pre-PCR阶段用 dUTP替代 dTTP，UDG存在于反应混合液中， 其它所有反应成分保持不变。PCR 反应的 DNA 链延长过程中 DNA聚合 酶用 dU 代替了 dT，因而产物 DNA 序列中含有 dU而不是 dT，在新样 品进行反应前，它们首先面临的是 UDG。含有 U的 DNA链一旦遇上 UDG， 这些 U 就会被切除而使该链具有缺刻。在接下来的 PCR 加热过程中， 有碱基缺失的 DNA 链分开后不能够被扩增。因此，UDG 的使用赋予热 启动一个额外的优点就是它能降解第一轮完整的循环之前形成的所 有 PCR 产物。 TaqDNA聚合酶 Taq DNA聚合酶是从一种水生栖热菌(Thermusaquaticus)yT1株分 离提取的.yT 是 一种嗜热真菌，能在 70～75℃生长.该菌是 1969 年 从美国黄石国家森林公园火山温泉中分离的。该酶基因全长 2496 个 碱基，编码 832 个氨基酸，酶蛋白分子为 94KDa.其比活性为 200000 单位/mg.75～80℃时每个酶分子每秒钟可延伸约 150 个核苷 酸，70℃ 延伸率大于 60 个核苷酸/秒，55℃时为 24 个核苷酸/秒.温度过高(90℃ 以上) 或过低(22℃)都可影响 Taq DNA 聚合酶的活性，该酶虽然在 90℃以上几乎无 DNA合成， 但确有良好的热稳定性，在 PCR 循环的 高温条件下仍能保持较高的活性.在 92.5℃、95℃ 、97.5℃时，PCR 混合物中的 Taq DNA 聚合酶分别经 130min，40min 和 5～6min后，仍 可 保持 50%的活性，实验表明.PCR反应时变性温度为 95℃～20sec， 50 个循环后，Taq DNA聚合酶仍有 65%的活性.Taq DNA 聚合酶的热稳 定性是该酶用于 PCR反应的前提条 件，也是 PCR反应能迅速发展和 广泛应用的原因.Taq DNA聚合酶还具有逆转录活性， 其作用于类似 逆转录酶.此活性温度一般为 65～68℃，有 Mn2+存在时，其逆转录活 性 更高. TaqDNA 聚合酶是 Mg2+依赖性酶，该酶的催化活性对 Mg2+浓度非 常敏感.以活性程度 很低的鲑鱼精子 DNA 为模板，dNTP 的浓度为 0.7～0.8mmol/L 时，用不同浓度 Mg2+进行 PCR反应 10min，测定结 果为 Mgcl2 浓度在 2.0mmol/L 时该酶催化活性最高，此浓度能最 大 限度地激活 TaqDNA聚合酶的活性，Mg2+过高就抑制酶活性，当 Mgcl2 浓度在 10mmol/L时可抑制 40～50%的酶活性.由于 Mg2+能与 dNTP结 合而影响 PCR 反应液中游离 的 Mg2+浓度，因而 Mgcl2 的浓度在不同 的反应体系中应适当调整，优化浓度.一般反应 中 Mg2+浓度至少应 比 dNTP 总浓度高 0.5～1.0mmol/L.适当浓度的 KCL 能使 Taq DNA 聚 合 酶的催化活性提高 50～60%，其最适浓度为 50mmol/L，高于 75mmol/L 时明显抑制该酶 的活性. 1,引物和 dNTP 100ul的反应体系中通常PRIMERS的浓度为0.3uM-3uM之间.dNTPs 在 37uM-1.5uM.引物为 15-25bp.过长或过短非特异性提高. 2,模板 DNA 通常 PRIMERS 是 10 倍于 DNA模板.如果引物对模板 DNA 的比例太 高,非特异产物会提高,PCR 效率降低.传统的 PCR 模板为 50ngDNA. 3,退火温度 退火温度和引物结合模板的能力.结合力强温度高,反之,温度低. 4,延伸温度和时间 延伸温度通常为 70-75C,时间取决于 PCR 产物的长度,一般 100bp/Sec.1KB 片段一般 1 分钟即可. 5.dNTPS 该成分为酸性,使用前应该调pH为7.0-7.5,浓度一般为 20-200uM. 量高,加快反应但降低精确度. 6.TAQ 酶一般为 0.5-5U,依片段长度和复杂性(G/C)不同区别. Mg2+是 Taq DNA聚合酶活性所必需的,Mg2+浓度除影响酶活性与忠 实性外,•也影响引物的退火, 模板与 PCR 产物的解链温度,产物的特 异性引物二聚体的形成等。Mg2+浓度过低时,酶活力明显降低;过高时, 酶可催化非特异性扩增。PCR 中 Mg2+浓度在 0.5～2.5mmol/L 之间。 如果溶液中存在 EDTA,或在引物贮备液中有其他螯合物或者 DNA模板, 会干扰 Mg2+的浓度。因此,要适当调整 Mg2+的用量。 Mg2+浓度优化法:首先须知模板 DNA量,引物和 dNTP的浓度和设定 的 PCR 循环参数。反应中的 PCR 缓冲液中不加 Mg2+。Mg2+是从 10mmol/L MgCl2 贮存液中逐一加入反应管中。开始以 0.5mmol/L 递 增(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5～5.0mmol/L),在确定了 Mg2+的适宜浓 度以后,再以 0.2mmol/L 递增和递减 n 个浓度,来确定 Mg2+的最适浓 度。 dNTP 溶于 pH 为 7.0 的 NaOH 贮存液中，最初的贮存液可稀释到 10mol/L，分装后存放在-20℃冰箱中。dNTP 使用浓度在 20～200 μ mol/L 之间。4 种 dNTP•必须等浓度配合以减少错配误差。 在 PCR 反应中,使用低 dNTP浓度,•可减少非靶位置启动和延 伸时的核苷酸错误掺入。一般可根据靶序列的长度和组成来决定最低 dNTP 浓度。例如在 100μ l•的反应体系中,4 种 dNTP 的浓度为 20μ mol/L,可基本满足合成 2.6μ g DNA 或•10pmol/L•的 400bp 序列。使 用低 dNTP 浓度(每种 dNTP 浓度为 2μ mol/L),能够高度灵敏地 (1/107)•扩增 ras 基因点突变的等位基因。 (一)引物设计的原则 1.一般原则 (1)引物长度应在 15～30bp。其 Tm=（G+C）×4+（A+T）×2， 引物的有效长度 Ln=2(G+C)+(A+T)； Ln<38，因为>38时,最适延伸温 度会超过 Taq DNA 聚合酶的最适温度 74℃,不能保证引物的特异性。 (2)引物中碱基的分布应当是随机的,避免一连串相同的碱基。 3，端不应超过 3•个连续的 G或 C,因这样会使引物在 G+C富集序列区 错误引发。 (3)G+C 含量在 40％～60％。 (4)两个引物在 3，端绝对不能出现同源性,否则会形成二聚 体。两引物之间不应有互补性,引物间连续的互补碱基必须少于 4 个。 2.引物的 3，端 引物的延伸是从 3，端开始的,因此,引物 3， 端的末位碱基在很大程度上影响 Taq DNA 聚合酶的延伸效率,不能进 行任何修饰。•实验表明,不同碱基的引发效率在引物 3，端末位碱基 处有错配时,有很大的不同。同等条件下,引物 3，端第 2位或 3、4• 位的错配对扩增量影响不大,但易出现非特异扩增和引物二聚体。所 以在设计引物时,应注意引物 3，端尽量不用 T,尤其应避免连续 2 个 或 2 个以上的 T。 3.引物的 5，端 引物的 5，端对扩增特异性影响不大。因此 可以被修饰而不影响扩增的特异性。如增加酶切位点、引入突变位点、 标记生物素等。 4.密码子的简并,如扩增 3，端区域,引物 3，端不要终止于密码子 的第 3 位,因密码子的第 3位易发生简并,影响扩增特异性与效率。 (二)引物的浓度 为使 PCR 效率达到最高，必须保证反应混合物中有足够的引 物和 dNTP。一般 PCR 反应中,引物的终浓度为 0.2～1μ mol/L。在此 范围内，PCR•产物的量基本相同；但引物低于 0.2μ mol/L 时，产物 量降低。引物浓度过高则会促进非特异产物合成，还会增加引物二聚 体的形成。非特异产物和引物二聚体又可作为 PCR 反应的底物,与靶 序列竞争 DNA 聚合酶和 dNTP 底物,从而使靶序列的扩增量降低。 几乎所有形式的 DNA 和 RNA 都是 PCR 反应的合适底物，包括基因 组 DNA、质粒 DNA、噬菌体 DNA、预先扩增的 DNA、cDNA 和 mRNA。大 多数 PCR 操作中,对 DNA 模板的要求都不高,纯度要求亦不严,用量很 低。理论上,单拷贝基因都可以扩增,但从高度复杂的 DNA样品中进行 扩增,可能比从质粒、噬菌体中进行扩增要困难些，如在 PCR 反应前 用机械剪切或稀有限制酶消化基因组 DNA 可提高产量。 核酸标本来源广泛,可以从纯培养的细胞或微生物中提取,也 可以从临床标本(血、尿、粪便、体腔积液、嗽口水等)及其他标本(血 斑、毛发、•精斑等)中直接提取。无论标本来源如何•,•待扩增核酸 都需部分纯化以去除核酸标本中的 DNA 聚合酶抑制物。以 RNA 作为模 板进行扩增时,需要逆转录成 cDNA•后才能进行正常的 PCR循环。PCR 反应中的模板加入量一般为 102～105 个拷贝靶序列。人基因组 DNA 1 μ g•相当于 3×105 个单拷贝靶分子;大肠杆菌 DNA 1μ g 相当于 3× 105 个靶分子。对于细菌基因组 DNA 或质粒 DNA，每次反应所需量仅 为 pg到 ng 级。 扩增靶序列的长度根据不同的要求而不同，目的物一般在 500bp 以内,以 100～300bp 为佳。对扩增较长的 PCR 片段,模板的质 量最为重要,在抽提纯化 DNA 的过程中,•应最大限度地避免其损伤。 操作时尽可能减少反复吹打,可选用大孔径吸头,以避免对 DNA 的随 机剪切。 PCR缓冲液（PCr Buffer） 用于 PCR的标准缓冲液见 PCR操作范例。于 72℃时，反应体系的 pH 值将下降 1个单位，接近于 7.2。二价阳离子的存在至关重要，影 响 PCR的特异性和产量。实验表明，Mg2+优于 Mn2+，而 Ca2+无任何 作用。 1．Mg2+浓度 Mg2+的最佳浓度为 1.5mmol/L(当各种 dNTP浓度 为 200mmol/L 时)，但并非对任何一种模板与引物的结合都是最佳的。 首次使用靶序列和引物结合时，都要把 Mg2+浓度调到最佳，其浓度 变化范围为 1～10mmol/L。Mg2+过量易生成非特异性扩增产物，Mg2+ 不足易使产量降低。 样品中存在的较高浓度的螯合剂如 EDTA 或高浓度带负电荷 的离子基团如磷酸根，会与 Mg2+结合而降低 Mg2+有效浓度。因此， 用作模板的 DNA 应溶于 10mmol/l Tris-HCl(pH7.6)0.1mmol/L EDTA 中。 dNTP 含有磷酸根，其浓度变化将影响 Mg2+的有效浓度。标准 反应体系中 4×dTNPs的总浓度为 0.8mmol/L，低于 1.5mmol/L的 Mg2+ 浓度。因此，在高浓度 DNA及 dNTP 条件时，必须相应调整 Mg2+的浓 度。 2．Tris -HCl缓冲液在 PCR 中使用 10～50mmol/L 的 Tris – HCl缓冲液，很少使用其他类型的缓冲液。Tris 缓冲液是一种双极化 的离子缓冲液，pKa为 8.3(20℃),△pKa 为 0.021/℃。因此，20mmol/l Tris pH8.3(20℃)时，在典型的热循环条件下，真正的 pH 值在 7.8～ 6.8之间。 3．KCl 浓度 K+浓度在 50mmol/L 时能促进引物退火。但现在 的研究表明，NaCl 浓度在 50mmol/L 时，KCl 浓度高于 50mmol/L将会 抑制 Taq酶的活性，少加或不加 KCl对 PCR 结果没有太大影响。 4．明胶明胶和 BSA 或非离子型去垢剂具有稳定酶的作用。一 般用量为 100μ g/ml，但现在的研究表明，加或不加都能得到良好和 PCR结果，影响不大。 5．二甲基亚砜（DMSO） 在使用 Klenow片段进行 PCR 时 DMSO是有用的；加入10%DM－SO有利于减少DNA的二级结构，使（G+C）% 含量高的模板易于完全变性，在反应体系中加入 DMSO 使 PCR 产物直 接测序更易进行，但超过 10%时会抑制 Taq DNA 聚合酶的活性，因此， 大多数并不使用 DMSO。 模板 单、双链 DNA 或 RNA 都可以作为 PCR 的样品。若起始是 RNA，须先通过逆转录得到第一条 cDNA。虽然 PCR可以仅用极微量的 样品，甚至是来自单一细胞的 DNA，但为了保证反应的特异性，还应 用 ng级的克隆 DNA，μ g 水平的单拷贝染色体 DNA或 104拷贝的待扩 增片段作为起始材料，模板可以是粗品，但不能混有任何蛋白酶、核 酸酶、Taq DNA 聚合酶抑制剂以及能结合 DNA 的蛋白。 DNA 的大小并不是关键的因素，但当使用极高分子量的 DNA （如基因组的 DNA时），如用超声处理或用切点罕见的限制酶（如 Sal1 和 Not1）先行消化，则扩增效果更好。闭环靶序列 DNA 的扩增效率 略低于线状 DNA，因此，用质粒作反应模板时最好先将其线状化。 模板靶序列的浓度因情况而异，往往非实验人员所控制，实 验可按已知靶序列量逆减的方式（1ng,0.1ng,0.001ng 等），设置一 组对照反应，以检测扩增反应的灵敏度是否符合要求。