大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞的原代培养和鉴定

468 临床肺科杂志2010年4月第15卷第4期 大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞的原代培养和鉴定 段超陈鑫邱志兵许欢 【摘要】．目的探讨大鼠胸主动脉『f}L管平滑肌细胞的原代培养方法，了解生长特性，为血管增生性疾病的治疗研究提供试 验材料。方法采用组织贴块法培养大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞，用倒置相差显微镜观察其生长情况，用免疫组化染色做鉴 定，台盼蓝染色进行活力检测，结果85％的组织块接种存活，原代培养后2周左右即可传代，至少可以传8代以上，并且细胞 形态、生长特点不发生明显的改变，6代的血管平滑肌细胞纯度达97％以t。台盼蓝染色约有94％以上的细胞为活细胞。镜下 培养的血管平滑肌细胞望典型的“谷峰状”牛长，免疫组化染色显示胞浆内口平滑肌肌动蛋白阳性达。结论正确地利用组 织贴块法·玎以偷单、经济、高效地培养出JI}L管甲．滑肌细胞，为血管增生性疾病的治疗研究提供了理想的细胞模型。 【关键词】 人鼠；血管平滑肌细胞；原代培养；组织贴块法 PrimarycultureandidentificationofratthoracicaortavascularsmoothmusclecellsDUANCtuw．CHENXin． QIU幼i—bing，XUHuan．DepartmentofCardiothoracicSurgery，Na彬ngFirstHospitalAffiliatedtoNanjingMedicalU- niversity．Nan筇ng2100嘶，C矗ina 【Abstract]Objective7foinvestigatetheprimaryculturemethodofratthoracicaortavascularsmoothmusclecells。(VSMCs)，to analyzecellgrowthandbiologicalcharacteristicsandtoprovidetestmaterialfortheresearchofthepreliferationofthevasculardiseases． MethodsThecultureofratthoracicaortavascularsmoothmuclecellswasdonebytissue—pieceinoculation．Theculturedcellswereoh- servedandidentifie_lbymorphologyandimmunehistochemistrywithphasecontrastmicroscopeandimmunohisumhemicalstainingrespec- tively．TheeellviabilitywasdeterminedwithTypanblue．Results85％inoculatedtissuepiecessurvived．Primaryculturedcellscouldbe subcuhuredafter2weeksandsuccessfullypassagedformorethan8 times，withoutnoticeablechangesinmorphologyandgrowthcharacter- isties．7I'hepurityofthesixthpassageVSMCsw∞morethan97％．ThecellviabilityWaSmorethan94％bytrypanblue．Thecultured VSMCsshewedthetypical“peakandvalley”morphologicalappearanceundermicroscope．Immunohistechemicalstainingwithantibodya— gainstSM—d—aciindemonstratedthesecellswerepositive．ConclusionThemethodoftissue—pieceinoculationcultureofVSMCsissimple． economicandefficient．Itprovidesanidealcellmodelfortheresearchoftheproliferationofvasculardiseases． 【Keywords】rat；vascularsmoothmusclecell；primaryculture；tissue—pieceinoculation 血管平滑肌细胞(vascularsmoothmusclecells，VSMCs)的 增殖和迁移是fIf【管增殖性疾病发病的核心环节，其病理学分 子机制是近年来脏管增殖性疾病的研究热点，也是n前防治 的难点⋯。而要获得试验研究所需的血管平滑肌细胞就必 须掌握一种简单、经济、高效的IlIL管平滑肌细胞培养方法。本 文作者运用组织贴块法进行大鼠胸丰动脉fl}L管半滑肌细胞的 原代培养和鉴定，并应用多种方法对传代细胞进行纯化，成功 地获得了大量纯度较高、生长状态良好的血管平滑肌细胞。 材料与方法 一、材料 150～250g雄性sD大鼠，购自南京医科大学试验动物中 心。PBS缓冲液(凯基生物)，胎牛血清(海克隆牛物)，DMEM 培养液／高糖(赛默飞世尔生物)，青链霉素混合液(凯基生 物)，胰蛋白酶一EDTA消化液(凯基生物)，兔抗鼠平滑肌(It肌 动蛋白单克隆抗体(北京博奥森生物)，SP免疫组化试剂盒 (福州迈新牛物)，DAB显色试剂盒(凯基生物)。 二、细胞培养 大鼠2—3只，颈椎脱臼致死，75％乙醇浸泡消毒3rain。 固定后依次剪开胸腹部皮肤，肌肉及胸骨，暴露胸腔，紧靠脊 柱右前方，从主动脉弓至膈面处剪下胸主动脉，并放入盛有 作者单位：210006江苏南京，南京医科大学附属南京第一医院心胸 外科 PBS缓冲液的细胞培养皿中，迅速转入细胞培养室的超净工 作台。眼科直镊和弯镊去除血凝块和血管外膜层，然后转移 入另一盛有PBS缓冲液的细胞培养皿中，剪去血管外的小分 支。再转移入含20％胎牛血清和DMEM混合液的细胞培养 皿中，眼科直剪剪开血管腔，内膜面向上，以眼科弯镊或手术 刀片轻轻擦拭内膜层，以去除内皮细胞。最后转移入另一含 20％胎牛血清和DMEM混合液的细胞培养皿中，用眼科剪将 血管段剪成lmill×l肼n大小的组织块，用吸管把组织块转 入25111l细胞培养瓶中，并均匀贴壁于培养瓶底面，组织块的 问距为0．5cm。盖好瓶盖，轻轻翻转培养瓶，让瓶底朝上，并 向瓶内注入适量20％胎牛血清和DMEM混合液以及相应比 例的青链霉素混合液，置于37。C，5％CO：培养箱内放置3—5 h，使得组织块干涸，并与瓶底贴附，将培养瓶慢慢翻转平放， 使组织块完伞浸入培养液中，继续静置3天，切勿移动，4—5 天会有细胞从组织块周围游离出(见图1)，即町换液。 7天左右大部分组织块长出细胞晕，并与相邻细胞晕相 接触，2周左右组织块周围长出的细胞相互汇合(见图2，3)， 逐渐铺满整个瓶底时，就可以进行首次传代：弃去瓶中原有培 养液，用PBS缓冲液清洗细胞表面2次，弃去PBS缓冲液，加 入胰蛋白酶．EDTA消化液4—6滴，使消化液铺满瓶底。入 37℃，5％CO，培养箱中消化2～3rain左右，倒置相差显微镜 下见细胞收缩变圆、细胞间隙增大(见图4，5，6)时，立即弃去 胰酶消化液，用PBS缓冲液清洗1次，弃去PBS缓冲液，加入 万方数据 临床肺科杂志2010年4月第15卷第4期 20％胎牛血清和DMEM混合液，用吸管反复抽吸吹打瓶底， 使细胞脱壁悬浮(见图7)，成为细胞悬液。按1：2接种培养 瓶(消化后脱落的组织块可一并传入新培养瓶中)，静置于 37℃，5％C02培养箱中。24h后可见重新贴肇生长的细胞 以及未贴壁的悬浮细胞(见图8)，此时可以换液清除未贴壁 的悬浮细胞，换液后未贴壁的悬浮细胞会被有效清除，镜下只 见贴壁细胞(见图9A，B)。以后约3天换液1次旧。，1周左右 后细胞再次长成致密单层铺满瓶底时即可再次传代，未消失 的组织块会随细胞换液、传代而除去。待细胞传代至3—7 代，即可用于实验。 图l原代培养第4天。有血管平滑肌细胞从组织块周围游离出(× 200l 图2原代培养第2周，组织块周围长出的细胞相互汇合 l X100)图3原代培养第2周，组织块周围长出的细胞相互汇 合(×200)图4传代时。胰酶消化液消化后吸管吹打前，细胞收 缩变圆、细胞间隙增大(x40) 图5传代时，胰酶消化液消化后吸管吹打前，细胞收缩变圆、细胞间 隙增大(×100)图6传代时，胰酶消化液消化后吸管吹打前，细 胞收缩变圆、细胞间隙增大(X200)图7传代时，胰酶消化液消 化后吸管吹打后．细胞脱壁悬浮(X100) 图8传代24h后，可 见重新贴壁生长的细胞以及未贴壁的悬浮细胞(×100) 讨 论 血管平滑肌细胞是构成血管壁组织结构及维持血管张力 图12B培养第6代的大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞平行排列成束， 部分重叠(X2()0)图13A培养的大鼠胸主动脉血管平滑肌细 胞d肌动蛋白免疫细胞染色(SP，×40)图13B培养的大鼠胸 主动脉血管平滑肌细胞n肌动蛋白免疫细胞染色(SP，×100)图 13C培养的大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞理肌动蛋白免疫细胞染 色(SP，×200) 的丰要细胞成分，其结构和功能的改变是导致高IIIL压、动脉粥 样硬化和血管成形术后再狭窄等多种心血管病的细胞病理学 基础。近年来，随着分子生物学和细胞生物学研究的进展，人 类对血管平滑肌细胞表型的可塑性、增殖、迁移、分化、凋亡和 细胞外基质的合成和分泌等方面的认识不断深化po。 常用的细胞原代培养方法有酶消化法和组织贴块法冲，： 酶消化法培养周期短，但酶作用时问不易掌握，且消化酶本身 对细胞有毒性作用，可致培养失败；组织贴块法虽培养周期相 对较长，fU．操作简便，污染机会小，培养效率高。本研究中由 于SD大鼠胸主动脉细小，可供培养的组织量少，于是采用了 组织贴块培养法。组织贴块法培养大鼠flIL管平滑肌细胞方法 简单，生长状态良好，经几次传代可获得较多的细胞数量，为 下一步进行基因干扰对血管平滑肌细胞增殖和迁移影响的实 验研究、探明基冈干扰治疗心血管病的物质基础和作用机理、 进一步开发基因治疗新药提供r可靠的实验材料。 试验中需要汴意的方面主要有：详细，做好培养前准 备。严格无菌操作，包括实验环境与操作台面的消毒、试剂消 毒以及洗手、关门、换鞋换农等细节；处死动物后应该用75％ 酒精浸泡3min。真菌污染时，肉眼可见淡黄色或白色的漂浮 物，镜下显示纵横交错的丝管状菌丝。有报告称：用双层 0．22斗m混合纤维素酉匕滤膜过滤可有效去除污染的真菌H1。 支原体污染时培养液未浑浊，但镜F可见圆形或梨形的微小 颗粒，细胞变粗糙，胞浆内有较多的颗粒状物质，细胞停止增 殖。支原体的检测方法有多种，巢式PCR法为不错的选择， 该法快速、简便、灵敏度高一J。细胞传代时，酶消化时间不应 固定或硬搬他人经验，应在镜下观察至细胞收缩变圆，细胞间 隙增大时及时终止消化。大鼠胸主动脉较细，操作时动作一 定要轻柔，避免对血管的过度损伤。一般受牵托少，剪切时边 缘褴齐网滑的组织块长出细胞的概率较大。不同种类的培养 基、血清的质量和浓度、特殊成分的添加与否都对细胞的生长 万方数据 470 临床肺科杂志2010年4月第15卷第4期 纤维支气管镜定位和引导下国产支架 介入治疗严重气道狭窄18例分析 班健 【摘要】 目的探讨纤维支气管镜(纤支镜)定位和引导下国产支架介入治疗严重气道狭窄的应用价值。方法18例气 道狭窄患者均采用常规咽喉部局麻和／或环甲膜注射利多卡困后经纤支镜定位和引导放置国产镍钛记忆合金支架(NT支架)。 结果18例均一次性放置成功，呼吸困难症状迅速缓解。结论经纤支镜定位和引导下放置国产NT支架是治疗严重气道狭窄 既经济又有效的方法。 【关键词】气管狭窄；介入疗法；国产；支架；纤维支气管镜；定位和引导 StudyofBForo—entatedandguidedplacementofdomesticmadestentsinthetreatmentof18easeswithseweI屯 trachealstenosisBANJian． QinzhouHospitalofTraditionalChineseMedicineBanjian535000，China 【Abstract】ObjectiveToevaluatetheefficacyofBForientatedandguidedplacementofdomestic—madestentsinthetreatmentof scveretrachealstenosis．MethodsDomestic．made’NTatentswerepJacedin18casesofseveretrachealstenosisorientatedandguidedby BF．ResultsTheorientationandplacementofNTstentguidedbyBFwasperformedsuccessfullyinallcases．Afterfinishedwithstents． dyspneaw∞relievedimmediatelyalongwiththepulmonaryfunctioninpmwed．ConclusionThemethodofBF—guideddomestic—lll“eis asafeandcost—effectiveoperationintreating∞veretrachealbronchialstenosiscases． 【Keywords】trachealstenosis；interwentionaltreatment；domestic·made；stents；BF；orientatedandguidance 气管及支气管狭窄是临床的一种危霞症，处理较为棘手。 气道狭窄的病因主要是良恶性肿瘤本身引起的气道狭窄阻 塞，或累及的淋巴结造成气道外压性狭窄，气道内膜结核，瘢 痕狭窄等，明显影响患者的生活质萤，使病人出现气促缺氧情 况，重者导致窒息死亡。随着镍钛(NT)记忆合金支架研究成 功，在纤支镜直视下置入NT合金支架已经成为治疗气道狭 窄的重要手段⋯。自2002年5月一2008年11月，我们应用 纤支镜定位和引导放置国产镍钛记忆合金支架治疗严重气道 狭窄18例获得成功。现报道如下。 作者单位：535000广西钦州，钦州市中医院 临床 一、本文18例中，男性15例，女性3例，年龄45—63岁， 平均56岁。主要症状：18例均有极度吸气性呼吸困难和刺 激性咳嗽，其中9例有窒息感，2例有咯血。美国胸科协会将 气促症状分为0—4级拉j：0级正常，1级快步走气促，2级平 常速度气促，3级平均速度步行因气促停止，4级轻微活动就 气促。本组气促3级9例，4级9例。患者术前均经胸片， CT，纤支镜及病理确诊。病变情况：中央型肺癌12例，支气 管内膜结核致狭窄3例，胸腺瘤压迫致气管狭窄2例，食管癌 放疗后致严重气管瘢痕性狭窄1例，根据气道狭窄部位分类： 气管上段3例，中下段5例，右主支气管5例，左主支气管3 、pq妒p、妒、妒upq≯、pq，^、p、一、≯≯ppp、≯q≯·妒p、妒、p、一、pppq产p、妒≯pppp、妒、ppp、pqppppp、妒 有较大影响，因此应根据既有资料和实际需要进行全面评价 和选择旧J。原代培养初期，当部分组织块漂浮未贴壁，可将 其重新摆放至瓶底，翻转千涸2～3h后，再浸没于培养液中， 使其重新贴壁，该法不会影响同瓶中其它已萌出的细胞的生 长。 正常动脉m管分为3层：内膜由单层内皮细胞、少量平滑 肌细胞及胞外基质构成，中膜层唯一的细胞成分是平滑肌细 胞，外膜有成纤维细胞和平滑肌细胞¨⋯。本研究综合运用了 3种方法纯化细胞，效果良好，最终6代左右平滑肌细胞的纯 度达97％以上。总之，本实验方法操作简单、经济、高效，为 研究心血管疾病的发病机理提供了理想的血管平滑肌细胞模 型。 参考文献 [1]MarksAR．Rapamycin：signalinginvascularsmoothmuscle．Tmns- plantPrac，2003，35(3Suppl)：231—233． [2]司徒镇强，吴军正．细胞培养．西安：世界图书出版西安公司， 2004：72—73． [3]李悦梅，冯大明。万载阳。等．组织块法培养大鼠肠系膜小动脉 的平滑肌细胞．南华大学学报·医学版，2003，31(3)：25． [4】 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cell populations cultured from pig coronary artery.Arterioscler Thromb Vasc Biol,2002,22(7):1093-1099. 7.邵荣标,钱虎,吴巨飞,等.细胞培养法真菌污染控制初探.南通医学院学报,2002,22(3):278. 8.张曦,腾峥.应用巢式PCR检测细胞培养物中的支原体污染.中国生物制品学杂志,2001,14(2):12. 9.弗雷谢尼.章静波,徐存拴(译).动物细胞培养-基本技术指南.第4版.北京:科学出版社,2004:116. 10.陈在嘉,高润霖.冠心病.北京:人民卫生出版社,2002:4. 相似文献(5条) 1.学位 郭晓珍 罗格列酮对AngⅡ诱导大鼠血管平滑肌细胞AT<,1>R、AT<,2>R表达的影响 2006 目的：探讨罗格列酮对血管紧张素Ⅱ(Ang Ⅱ)诱导大鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)血管紧张素Ⅱ1型受体(AT<,1>R)和血管紧张素Ⅱ2型受体(AT<,2>R)表 达的影响，为过氧化酶增殖体活化受体γ(PPARγ)激动剂抗炎、抗动脉粥样硬化(AS)作用提供实验依据。 方法：取一月龄雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠的胸主动脉平滑肌细胞(SMCs)，采用组织贴块法进行培养。选6～10代处于对数生长期的大鼠VSMCs进 行后续实验。首先用终浓度为1μmol·1<'-1>AngⅡ诱导2h后，然后随机分成A、B、c组，分别加入终浓度为20、30、50)50μmol·1<'-1>罗格列酮培养 12h；另外，取预先用终浓度为lμmol·1<'-1>AngⅡ诱导6h的大鼠VSMCs，随机分为D、E、F组，加入终浓度为30μmol·1<'-1>的罗格列酮分别再培养 6h、12h、24 h。采用半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PeR)和免疫组织化学方法观察罗格列酮不同浓度及同一浓度不同的干预时间对大鼠VSMCs AT<,1>R和AT<,2>R mRNA及蛋白表达水平的影响。 结果： 1、基础状态下，体外培养的大鼠VSMCs AT-R和ATzR均有少量的表达。AngⅡ显著上调AT<,1>R mRNA和蛋白表达，下调AT<,2>R mRNA和蛋白表达。 2、罗格列酮干预后，A、B、C组ATIR mRNA和蛋白的表达均显著下降，C组下降最大，与干预前相比均有统计学差异。D、E、F组AngⅡ诱导的大鼠 VSMCs AT<,1>R mRNA和蛋白的高表达均有不同程度的下调，F组的下调程度最明显。 3、罗格列酮明显上调AT<,2>R mRNA和蛋白的表达，在C组达到最大；D、E、F组则不同程度的上调Ang Ⅱ诱导的大鼠VSMCs AT<,2>R mRNA和蛋白的表 达，与D、E组比较，F组的上调程度最明显。 结论： 1、基础状态下，体外培养的大鼠VSMCs内AT-R和AT<,2>R均有少量的表达。Ang Ⅱ显著上调AT<,1>RmRNA和蛋白表达，下调AT<,2>R mRNA和蛋白表达 ； 2、一定浓度范围内，罗格列酮可呈浓度依赖和时间依赖性地下调AngⅡ诱导的大鼠VSMCsAT<,1>R mRN和蛋白的表达： 3、一定浓度范围内，罗格列酮可呈浓度依赖和时间依赖性地上调AngⅡ诱导的人鼠VSMCsAT<，2>R mRNA和蛋白的表达，这可能是PPAR γ激动剂具有 抗炎、抗AS作用的重要机制之一。 2.期刊论文 谭玉萍.王朝晖.蒙定水.姚平.钟小宁.黄修解.黄金龙 银杏叶提取物可抑制慢性阻塞性肺疾病大鼠气道 及肺血管重塑 -中国呼吸与危重监护杂志2008,7(4) 目的 探讨银杏叶提取物(GBE)对COPD大鼠气道及肺血管重塑的干预作用.方法 Wistar人鼠40只,随机分为止常对照组(A组)、造模不T预组(B组)、造 模GBE早期干预组(C组)和造模GBE后期干预组(D组).B、C和D三组采用慢性烟熏+脂多糖气管内注射建立COPD模型,C和D组分别在1～14 d和29～42 d腹腔内 注射GBE(0.40 mL/kg),43 d后对各组大鼠肺脏行病理学检测.结果 B、C和D三组均有COPD特征性改变,但程度不同.A、B、C和D各组间肺泡平均面积、 肺泡数比较均有显著差异(P均＜0.01).C和D组管壁结构轻度改变,支气管平滑肌厚度/支气管肇厚度比值、支气管壁面积/支气管面积比值与A、B两组比较 均有显著差异(P均＜0.01).C和D组血管平滑肌细胞轻度增生,管壁轻度增厚,血管平滑肌细胞厚度/血管壁厚度比值、血管壁面积/血管面积比值与A、B两 组比较均有显著差异(P均＜0.01).结论 GBE对COPD大鼠模型气道重塑及肺血管重塑有抑制作用. 3.学位论文 杜滂 高胆固醇对兔SO细胞BK通道的betal亚基蛋白表达的影响及BK通道alpha亚基cDNA序列克隆、分析 2006 背景和目的：WHO资料显示，在发达国家，高胆固醇对人类健康的威胁已上升到第四位，其中因胆固醇代谢紊乱而致胆囊结石的发病率高达7％以上 ，因胆囊结石切除胆囊者约占腹部外科手术的25％左右。在我国由于饮食结构的变化，因胆固醇代谢紊乱而致胆囊结石的发病率逐年提高，目前已经接 近于发达国家水平。但是对于高胆固醇条件下胆囊成石环境是如何形成的并不清楚。根据胆管内胆汁的流体力学分析，肝脏分泌胆汁是肝外胆管系统内 产生静水压并保持正向压力梯度的主要脏器，但在不同的生理状态下提供排胆动力的主要是胆囊及Oddi括约肌(sphincterofOddi，SO)。胆管SO是胆汁排 出的唯一通道，它的功能状态是决定胆囊胆汁储存或者排空的关键因素之一。在某些致病因素作用下，损害了胆管SO的舒、缩功能(即SO功能紊乱)，必 然提高了排胆阻力，其直接后果就是导致胆囊淤胆，即是在具备成石物质的基础上，为成石物质结晶的析出提供了合适的环境。有关临床资料和研究证 实，胆固醇代谢紊乱可能是诱发胆管括约肌紊乱的因素之一。我们的研究结果证实，胆固醇喂养兔胆囊成石前胆囊已处于淤胆状态。胆固醇代谢紊乱不 仅提供了胆囊成石的物质基础，而且很有可能是在成石物质结晶析出前高胆固醇首先损害了胆管SO舒、缩功能，即发生了由高胆固醇诱发的胆管SO功能 紊乱导致胆囊淤胆，继而为胆囊内过饱和的胆固醇结晶的析出提供了适宜的环境。 研究证实在平滑肌细胞舒缩功能调节与细胞内[Ca2+]i浓度的变化有密切的关系。SO功能紊乱的发生机制尚不清楚，但是胆管SO功能紊乱是因括约肌 舒缩功能障碍导致的一种疾病已经成为共识。我们的研究发现，高胆固醇所致的SO功能紊乱动物模型SO细胞[Ca2+]i存在过载现象[1]，电镜观察证实 SO内细肌丝三维结构排列紊乱，处于挛缩状态。上述结果显示细胞[Ca2+]i过载可能是SO功能紊乱发生的分子机制之一。 已有研究结果证实，调节平滑肌细胞舒缩功能的关键离子—钙离子的代谢主要通过胞膜L-型电压依赖型钙通道完成，我们实验结果显示实验组胆管 SO细胞[Ca2+]i过载并非系高胆固醇损害了L-型电压依赖性钙通道的活性所致[2]。已经证实，具有舒、缩运动功能的肌细胞膜电位调节的离子通道是钙 离子敏感性钾离子通道(Kca通道)。当细胞[Ca2+]i上升到一定的阈值，细胞内即启动了抑制Ca2+进入和肌浆网钙库释放Ca2+的调节路径，其关键作用点 就是激活细胞质膜Kca通道。显然，高胆固醇引发的胆管SO功能紊乱是否因高胆固醇改变了细胞膜Kca通道活性而导致细胞[Ca2+]i过载就成为研究热点。 有关高胆固醇或脂类物质是否会影响平滑肌细胞质膜Kca通道的活性已有报道。Amberg[3]的研究结果提示，遗传性高血压患者大电导的钙离子敏感 性钾离子通道(Kca)beta亚基低表达降低了该通道对Ca2+生理性变化的敏感性而使Kca通道活性降低，这说明Kca通道的分子结构的变化是血管平滑肌功能 紊乱的基础。最近对高胆固醇影响Kca通道基因表达和功能的研究显示：高胆固醇血症大鼠主动脉血管平滑肌细胞膜上Kir6.2mRNA表达明显升高，而 Kir3.1mRNA表达却显著降低，充分证明了高胆固醇可以调节细胞膜钾通道mRNA表达水平[4]。尽管对高胆固醇具体从何种途径影响血管平滑肌细胞膜钾通 道基因转录水平，以及是否影响Oddi氏括约肌钾通道mRNA表达的表达尚不清楚，但是XiQ，等的研究[5]却明确指出，高胆固醇血症就是通过影响Kca通道 的功能，导致血管NO依赖性和非NO依赖性扩张功能减弱。上述研究提示：在某些外界致病因子(包括高胆固醇)作用下有可能导致发生基因功能损害，并 因此而诱发疾病。但是外源性致病因子是否可导致调控胆管SO运动功能的基因表达异常，进而成为胆囊成石环境形成的启动因素则未见报告。 回顾文献及我们的研究结果可归纳如下几点：①胆囊成石物质代谢紊乱首先导致胆管SO功能紊乱，并因此使胆囊处于淤胆状态，为成石物质结晶析 出提供了适宜的内在环境；②高胆固醇诱发胆管SO功能紊乱的分子机制是细胞内[Ca2+]i过载所致；③胆管SO细胞内[Ca2+]i过载与细胞质膜BKca通道的 beta亚基活性降低密切相关；④后天致病因素(如高胆固醇、脂肪酸等)可能导致血管平滑肌BKca通道beta亚基基因功能的降低或封闭，改变了BKca通道 的活性，进而改变了平滑肌的张力。 我们前期的研究成果显示SO平滑肌细胞BKca通道alpha和beta亚基mRNA表达在胆固醇组和对照组间比较没有统计学差异，但是两者的比值在两组间有 明显的统计学差异。为了揭示高胆固醇血症条件下Kca通道beta亚基蛋白表达水平是否发生了变化，本课题应用多抗制备及免疫组织化学的方法探讨高胆 固醇血症下Kca通道beta亚基蛋白表达水平的改变。由于Genebank中没有SO细胞BKCa通道的基因序列，我们用RT-PCR方法测定了BKCa通道alpha亚基的 cDNA序列。为了进一步证实，SO平滑肌细胞BKca通道alpha和beta亚基mRNA的比值变化会影响BKCa通道的功能，我们构建了pcDNA3.1-alpha,pcDNA3.1- beta两个质粒，准备下一步转染到HEK293细胞进而测定结构变化对通道功能的影响。 实验方法和主要结果： 一、高胆固醇兔SO细胞Kca通道beta1亚基蛋白表达水平的研究 1.鼠抗兔SO细胞Kca通道beta1亚基多克隆血清的制备扩增编码兔Kca通道beta1亚基胞内段基因，在E.coliJM109菌中表达His6-beta1亚基融合蛋白 ，利用Invitrogen的Ni-NTA纯化试剂盒纯化融合蛋白并免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗血清，成功地获得小鼠抗兔Kca通道beta1亚基的高滴度抗血清，抗 血清最高滴度达1∶64000。 2.兔SO细胞Kca通道betal亚基免疫组织化学染色免疫组织化学染色显示BK通道beta1亚基染色于平滑肌细胞膜上，高胆固醇组BK通道beta1亚基表达 较对照组降低。半定量分析显示对照组灰度值为156.4±8.5，高胆固醇组灰度值为207.1±10.2，t检验显示两组间存在统计学差异(p＜0.05)。 二、兔SO细胞Kca通道alpha亚基cDNA序列测定及生物信息学分析采用RT-PCR的方法成功得到兔SO细胞Kca通道alpha亚基cDNA序列，并克隆到pMD18- T载体，获得质粒pMD18-T-alpha。序列测定证实其中CDS区包括3342bp，编码1114个氨基酸。利用生物信息技术对该序列进行了分析，用NTI6.0分析了该 序列的同源性与基因库中存在的人、鼠和兔骨骼肌的BKca通道alpha亚基cDNA序列，结果显示同源性为99％，98％，99％。用 PSIPREDHFORMAT(PSIPREDV2.3byDavidJones)软件对蛋白的二级结构进行了预测，结果显示该段氨基酸序列有10个跨膜区。用Swiss-modle对该蛋白的三 级结构进行了预测，结果显示与蛋白库中的BKca通道alpha亚基蛋白结构基本相似。 三、构建真核表达载体pCDNA3.1-alpha和pCDNA3.1-beta利用RT-PCR技术得到兔SO细胞Kca通道beta亚基编码区cDNA序列，共576bp，克隆到pMD18- T载体，获得质粒pMD18-T-beta。质粒pMD18-T-alpha和载体pCDNA3.1+分别以HindⅢ和BamHⅠ进行双酶切，将pMD18-T-betaHindⅢ和BamHⅠ和载体 pCDNA3.1+以HindⅢ和XhoI分别进行双酶切，10g/L琼脂糖凝胶电泳回收目的片段及载体片段，目的片断和载体片断用T4DNA连接酶4℃连接过夜，将重组 表达载体转化感受态大肠杆菌DH5α，挑取单克隆菌落扩大培养，小量提取质粒进行酶切鉴定并测序。测序结果显示成功构建真核表达载体pCDNA3.1- alpha和pCDNA3.1-beta，为下一步转染HEK293细胞做好了物质准备。 小结： 1.我们制备了鼠抗兔SO细胞Kca通道beta1亚基多克隆血清，并进行了免疫组织化学染色，结果显示高胆固醇组兔SO细胞Kca通道beta1亚基蛋白表达 下降。 2.我们采用RT-PCR的方法成功得到兔SO细胞Kca通道alpha亚基cDNA序列，其中CDS区包括3342bp，编码1114个氨基酸。并利用生物信息技术对该序列 的同源性、二级结构及三级结构进行了分析。 3.我们采用RT-PCR的方法成功得到兔SO细胞Kca通道beta亚基开放读框区cDNA序列，成功构建了真核表达载体pCDNA3.1-alpha和pCDNA3.1-beta，为 下一步转染HEK293细胞做好了物质准备。 4.期刊论文 王洋.司忠义.Wang Yang.Si Zhong-yi 大鼠胸主动脉损伤后基质金属蛋白酶组织抑制因子1,2的表达与 血管内膜增生 -中国组织工程研究与临床康复2009,13(22) 背景:已有研究发现,基质金属蛋白酶及其组织特异性抑制因子通过影响血管平滑肌细胞迁移以及细胞外基质的代谢参与再狭窄过程.目的:观察基质 金属蛋白酶组织抑制因子1,2在大鼠胸主动脉损伤后不同时间的表达情况.设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2008-07在辽宁医学院动物实验中心完 成.材料:选用SD雄性大鼠60只,按随机数字表法分为2组,单纯球囊损伤组及对照组各30只.方法:单纯球囊损伤组大鼠采用2F Fogarty导管损伤胸主动脉 ;对照组行左颈总动脉结扎术,不插入2F Fogarty导管.主要观察指标:2组十术后第1,3,7,10,14,28天分别处死5只大鼠,取完整的血管内膜,应用蛋白印迹 法检测动脉损伤后不同时间点基质金属蛋白酶组织抑制因子1,2表达水平,并进行比较.结果:基质金属蛋白酶组织抑制因子1于人鼠动脉损伤后第1人开始 表达增加,第7天达到高峰,第28天几乎无表达.基质金属蛋白酶组织抑制因子2于大鼠动脉损伤后第1,3天仪有较弱的表达,第7,10天表达明显增加,第14天 达到高峰,第28天仍有较强表达.对照组中各时间点基质金属蛋白晦组织抑制凶子1,2的表达均无明显变化(P＞0.01).术后各时间点基质金属蛋白酶组织抑 制因子1,2的表达水平单纯球囊损伤组均显著高于对照组(P＜0.01).结论:大鼠胸主动脉球囊损伤后基质金属蛋白酶组织抑制因子1,2的表达均明显增加. 5.学位论文 杨晓丽 血管紧张素ⅡAT1受体自身抗体在子痫前期患者血清中的分布及其对血管活动的影响 2008 子痫前期(Preeclampsia，PE)是妊娠期特发的全身性疾病，多在妊娠20周以后发病。临床表现以高血压、蛋白尿为特征，并伴有全身多脏器的损害 ，其基本病理生理改变是全身小动脉的痉挛性收缩。流行病学调查结果显示，予痫前期的发病率为5-10％，是母婴发病率及死亡率较高的主要原因。子 痫前期对孕产妇的影响主要表现为胎盘早剥、肺水肿、凝血功能障碍、产后出血及产后血循环衰竭等并发症，严重者可致死亡；对胎儿多是由于胎盘供 血不足，胎盘功能减退导致胎儿窘破、胎儿发育迟缓、死胎、死产或新生儿死亡。目前，对子痫前期普遍认同的病因学说主要有免疫学说、子宫-胎盘缺 血学说、血管调节物质异常、遗传学说等，但是相关治疗措施虽能改善病人急性和慢性期的症状，但不能从根本上逆转疾病的进展和最终防止子痫前期 的发生，提示在子痫前期发生发展过程中可能还有其它未知因素的参与。 20世纪90年代早期，Hanssens和Haller等先后发现并证实，子痫前期患者血液中存在一种作用类似血管紧张素Ⅱ(AngiotensinⅠ，Ang-Ⅱ)的循环因 子，使血管紧张素Ⅱ-1型受体(AngiotensinⅡType1Receptor，AT1R)功能增强。1999年，Wallukat等证实这种类Ang-Ⅱ因子是抗AT1R自身抗体 (AngiotensinⅡtype1ReceptorAutoantibodies，AT1-AA)。随后的研究也相继证实AT1-AA存在于子痫前期患者的血清中，但是，研究的标本数较少，此 外，没有该抗体存在与子痫前期体征关系的分析，即缺乏AT1-AA是否与子痫前期有关的分析资料，而这一问题的解决是研究AT1-AA在子痫前期发病中作 用的前提。 随后的研究表明，这种自身抗体通过专一识别AT1R的细胞外第二环功能表位肽段 (thesecond.extracellularloopoftheangiotensinⅡtype1receptor，AT1R-ECⅡ，人鼠同源性为99％)促进血管平滑肌细胞增殖、NADPH氧化酶活化、 ROS生成、细胞浆内Ca2+浓度增加和激活纤溶酶原激活物抑制因子1。这些研究结果均提示，AT1-AA的过度活动与许多重要的病理生理改变有关，可能在 子痫前期的发病中起着重要作用。由于子痫前期危害性极大而病因又极其诡异，因而这一成果的重要性和亟待被深入研究的必要性被国内的学者迅速而 敏锐地捕捉到，并对此展开了广泛的研究。其中尤以廖玉华实验室的研究最为深入，他们的研究证实，AT1-AA通过激活AT1受体诱导大鼠肾脏和心肌组织 的免疫损伤并促进大鼠血管平滑肌细胞增殖。我实验室的前期研究也发现，抗AT1R-ECⅡ抗体通过作用AT1R增强离体灌流心脏的心功能、升高心肌细胞内 游离钙含量、增加心肌细胞Ica-L电流、激动INa/Ca电流和减小Ik1电流等。这些结果进一步提示，AT1-AA具有AT1受体类激动剂样效应。 虽然AT1R广泛分布于人体各组织器官，介导了目前已知Ang-Ⅱ的所有作用(如收缩血管、促进醛固酮分泌、刺激血管平滑肌细胞增殖和水钠潴留等 )，但AT1R对脉管系统的作用尤为突出。因此我们推测，具有AT1受体激动剂样效应的AT1-AA是否也具有同样的血管效应呢?如果是，那么AT1-AA是否象 AT1受体激动剂那样，也具有致血管病变的病理意义呢?但是到目前为止，已有的研究报道(包括我们的前期工作)仅局限于通过急性实验来探讨AT1-AA作 用的微观机制，但缺乏AT1-AA对各类血管(尤其是阻力血管)作用的直接证据，而对这一问题的阐明是认识AT1-AA在子痫前期发生发展中作用和研究AT1- AA作用机制的关键。 如前所述，AT1R广泛分布于人体各组织器官。在血管系统，AT1R除分布在血管平滑肌外，还广泛分布在血管内皮细胞，后者在调节血管收缩舒张功 能中具有重要的作用。如果存在于血液中的AT1-AA随血液循环在血管内流动时，由于其具有类AT1受体类激动剂样效应，那么AT1-AA应该可以和血管内皮 细胞上的AT1R结合。但是，这一推测需要实验来证实。众所周知，在体情况下血管内皮损伤后，会导致流经损伤部位的血液中诸多血管活性物质的聚集 (如血小板、凝血因子等)并引发随后的释放反应，这些病理过程都有利于动脉粥样硬化斑块的形成。在子痫前期患者发病过程中，一个典型的病理改变 是子宫螺旋小动脉存在“类粥样硬化样”改变，因此导致胎盘血流量下降，直接危害到胎儿的健康：此外，另一个典型病理改变是肾小球血管内皮下大 量纤维样物质沉积，进而造成血管管腔狭窄、肾脏血液灌注减少和肾小球滤过率下降等后果。但是，多年以来，导致这种血管内皮细胞病理改变的机制 一直不清。因此，如果能够通过直接的实验证据说明AT1-AA是导致“类粥样硬化样”病变的原因将有助于认识子痫前期血管病变的机制。 综上所述，作者设计了本研究课题：(1)通过临床流行病学调查，追踪子痫前期患者血清AT1-AA的变化，观察该抗体水平和病情相关性，明确该抗体 的临床意义。(2)在此基础上开展实验室研究，首先以人工合成的AT1R-ECⅡ主动免疫大鼠制备抗AT1R-ECⅡ抗体，然后通过离体大血管和微血管环技术明 确该抗体对大鼠胸主动脉、主要脏器的小动脉(包括冠状动脉、大脑中动脉和肾动脉)、主要阻力血管(肠系膜动脉)和反应子宫-胎盘血流量的血管(子宫 动脉)等不同类型小动脉的直接作用。(3)以血管内皮的结构和功能为切入点，通过离体细胞培养技术研究抗AT1R-ECⅡ抗体对内皮细胞的损伤效应和形式 ；并将抗AT1R-ECⅡ抗体转移进入正常大鼠体内建立大鼠被动免疫模型，然后通过检测血清中内皮素的含量来观察抗AT1R-ECⅡ抗体对在体血管内皮的损 伤作用；通过大血管和微血管环技术明确该抗体在在体情况对血管活动的影响。以期阐明AT1-AA致血管类动脉粥样硬化改变的可能性及其防治的意义。 本课题拟验证的假说：子痫前期患者血清中存在的AT1-AA，有可能通过影响血管结构和功能而与子痫前期发生发展相关。(1)在子痫前期患者血清中 的AT1-AA与该病的某些特殊指征呈一定的相关性；(2)AT1-AA对大血管具有直接的收缩效应，但对不同小动脉可能表现各不相同；(3)AT1-AA通过作用于 AT1R细胞外第二环，引起血管内皮细胞损伤，或许可以进而诱发血管“类动脉粥样硬化”改变。所有这些结构和功能变化可能与子痫前期患者所表现的 血压升高、组织器官血流量下降以及和其它病理学改变密切相关。 本文链接：http://d.g.wanfangdata.com.cn/Periodical_lcfkzz201004010.aspx 下载时间：2010年5月18日