新疆罗布诺尔地区铜器时代古代居民mtDNA多态性分析

© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net 　　[文章编号 ]　16712587Ò (2004) 0420650203 [收稿日期 ] 　2004201208 [基金项目 ] 　教育部科学技术重大项目 (00207) ; 国家文物局边疆考古专项基金资助 (2001) [作者简介 ] 　崔银秋 (1972- ) , 女, 辽宁省抚顺市人, 讲师, 理学博士, 主要从事分子进化研究。3 　通讯作者 (T el: 043128498031; E2m ail: zhouhu i@m ail1jlu1edu1cn) 新疆罗布诺尔地区铜器时代古代 居民m tD NA 多态性 崔银秋1, 2, 许　月2, 杨亦代2, 谢承志2, 朱　泓1, 周　慧1, 23 (1. 吉林大学边疆考古中心考古DNA 实验室, 吉林 长春 130012; 2. 吉林大学生命科学学院大分子实验室, 吉林 长春 130023) [摘　要 ] 　目的: 通过新疆罗布诺尔地区铜器时代古代居民m tDNA 多态性分析, 探讨新疆境内古代欧洲人种成 分的来源。方法: 从孔雀河古墓沟墓地古代居民人骨中提取出古DNA。用 4 对套叠引物对线粒体基因组的调控区 (363 bp ) 进行扩增、测序。结果: 10 个个体中具有 10 个DNA 序列, 系统发育分析明罗布诺尔古代居民的核酸 多样性及平均配对差异均与欧洲群体接近。结论: 早在 3800 年前的铜器时代, 罗布诺尔地区已有单一的欧洲人种 构成的人群存在。 [关键词 ] 　DNA , 线粒体; 序列分析, DNA ; 多态现象 (遗传学) ; [中图分类号 ] 　Q 983　　 [文献标识码 ] 　A M itochondr ia l D NA polym orph ism analysis of d istr ict of L ubunour at the Bronze Age in X in j iang CU I Y in2qiu1, 2, XU Yue2, YAN G Y i2dai2, X IE Cheng2zh i2, ZHU Hong2, ZHOU H ui1, 23 (1. D epartm ent of A ncien t DNA L abo rato ry, Cen ter of Bo rder A rchaeo logy, J ilin U niversity, Changchun 130012, Ch ina; 2. D epartm ent of M acromo lecu lar L abo rato ry, Co llege of L ife Science, J ilin U niversity, Changchun 130023, Ch ina) Abstract: O b je c tive　To analyze m itochondria l DNA po lymo rph ism of district of L ubunour at the B ronze A ge in X in jiang. M e thods　M tDNA w as ex tracted from 10 ancien t individual bones at the tom bs of L ubunour. T h rough four overlapp ing p rim ers, m tDNA HV S21 w as amp lified and sequenced. Re sults　10 nucleo tide sequences of 363 bp length w ere ob tained. Phylogenetic analysis indicated that the nucleo tide diversity and m ean pairw ise differences of ancien t peop le in L ubunour w as clo se to European populat ion. C onc lus ion　A n ancien t European populat ion had ex isted p rio r to 3800 years ago. Key words: DNA , m itochondria l; sequence analysis, DNA ; po lymo rph ism (genetics) 　　目前, 线粒体DNA 已广泛应用于现代群体的 遗传研究, 同时对人类的起源、迁徙的研究有重要 作用[1 ]。由于新疆地区在历史上经历了无数次的迁 徙、混合和战争, 仅从现代新疆地区居民的遗传结 构来推测古代新疆地区各民族的起源和迁徙等历史 过程, 必然会受到时间等的影响, 而研究这一地区 古代人群m tDNA 则有助于解决这一问[2 ]。 古墓沟墓地位于罗布诺尔地区孔雀河下游北岸 第二台地的沙丘上, 是目前在新疆境内发现的唯一 的铜器时代墓地, 也是迄今所知分布欧亚大陆时代 最早、分布位置最东的古欧洲人种类型[3 ]。本研究通 过对该墓地个体m tDNA 分析, 结合人类学数据, 探 —056— 第 30 卷　第 4 期 2004 年 7 月 吉 林 大 学 学 报 ( 医 学 版 ) Journal of J ilin U niversity (M edicine Edit ion) V o l. 30 N o. 4　 Ju ly 2004 © 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net 讨新疆境内古代欧洲人种成分的来源。 1　与方法 111　样品采集　样本取自罗布诺尔地区孔雀河下 游古墓沟墓地发掘的古代人骨, 属于青铜器时代墓 葬。根据对墓内棺木、毛布等物的14C 测定年代数据 和文化内涵分析, 估计这批墓葬的年代大概距今 3 800 年左右[4 ]。 112　样品处理　样本在实验前进行处理以去除骨 样的外源DNA 污染。样本处理过程在无菌超净台 中进行, 操作者先去除骨样表面污垢, 然后将骨样 暴露在紫外光线下 30 m in, 最后用无菌手术刀刮去 骨样表面 2～ 3 mm。这样可将骨样表面沾染的同年 代微生物DNA 及挖掘过程中现代人类DNA 污染 除 去。将处理过的骨 样 放 在 W aring B lando r (W A R IN G, U SA ) 中制成骨粉。将骨粉分装于灭菌 Eppendo rf 管中, - 20℃贮存。 113　DNA 提取、扩增及测序　使用GEN ECL EAN fo r A ncien t DNA 试剂盒 (B IO 101, U SA ) 进行DNA 提取, 然后利用 4 对套叠性引物对线粒DNA 上长 度为 363 bp 的片段进行 PCR 扩增。使用Q IA EXÊ GEL Ex tract ion K it (Q IA Gen, Germ any ) 纯化 PCR 产物, 使用 DNA 自动测序仪 (A pp lied B io system s Inc1M odel 377A , PE 公司) 对 PCR 产 物进行双链DNA 直接测序。对每个 PCR 产物分别 测序 2 次, 凡是 2 次测序结果或序列重叠区核酸序 列不一致的, 将从最终数据分析中去除, 以保证结 果的真实性。 2　结　果 从孔雀河古墓沟墓地的10 个样本中共得到 10 个长度为 363 bp 的不同线粒体序列, 共有 14 个 核酸变异位点, 其中第 9 号 (79LQ 2M 30: B ) 样本 的序列与A nderson 等发表的参考序列相同。2 个以 上个体共有的变异位点有 16 111、16 189、16 249 和 16 317。所有观察到的多态性位点均为核酸取代, 无 插入和缺失现象。这些取代中 13 个是转换, 1 个是 颠换。11 个嘧啶碱之间的转换 (C2T ) , 2 个嘌呤碱 之间的转换 (A 2G)。详细的位点变异情况见表 1。 使用A rlequ in 210 软件包计算了孔雀河古墓沟 墓地的古代人群m tDNA 的核酸多样性和碱基平均 配对差异值, 并将其与东亚和欧洲人群进行比 较[7, 8 ] , 发现孔雀河古墓沟墓地古代人群的核酸多样 性 为 010103, 远 远 小 于 东 亚 人 群 (010187～ 010274) , 而与欧洲人群的值相似 ( 010082～ 010193)。在配对差异分析中, 孔雀河古墓沟墓地的 古代人群碱基平均配对差异值为 31527 2, 低于东亚 人 群 (614533～ 618273) , 属于欧洲群体范围内 (216833～ 410728)。 T ab11　V ariab le sites of m tDNA contro l region segm ent sequences of L ubunour N ucleo tide m utation in HV S21 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 1 1 1 1 1 1 2 2 2 2 3 3 3 3 1 6 6 8 8 8 1 4 7 7 0 1 2 2 1 4 7 3 6 9 7 9 0 8 4 7 5 7 D ivision type Genetic type [6 ] A nth ropo logy type [3 ] CRS c a c a c t t t c c t a t c 1 79LQ 2M 1 . . . . . . . . . t . . . . E E 2 79LQ 2M 3 . . . . . . . . . . . g c . E E 3 79LQ 2M 9 . . . . . c . c . . . . . . E E 4 79LQ 2M 20 . g . c t . . . . . . . . . E ? 5 79LQ 2M 21 . . . . . c . . t . . . . . E ? 6 79LQ 2M 22 t . . . . . . . . . c . . . E ? 7 79LQ 2M 29 t . . . . c . . . . . . . . E E 8 79LQ 2M 30: A . . t . . . c . . . . g . . X ? 9 79LQ 2M 30: B . . . . . . . . . . . . . . E E 10 79LQ 2M 39 . . . . . . . c . . . . . t E ? 　　N o te: 1. CRS m eans the Cam bridge Reference Sequence, w h ich w as pub lished by A nderson [5 ]; A do t indicates iden tity w ith the reference sequence. 2. T he defin it ion of Genetic type takes the articles of To rron iA , and R ichardsM as references. 3. E indicates European, and X indicates that the hap logroup can′t be judged, "?" indicates that w e haven′t go tten the an th ropo logic data —156— 崔银秋, 等 1　新疆罗布诺尔地区铜器时代古代居民m tDNA 多态性分析 © 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net 3　讨　论 古DNA 研究的一个主要障碍是古DNA 污染 问题。由于样品经历了漫长年代, 极有可能被大量 外源性DNA (如土壤中的细菌、真菌等微生物) 所 污染, 而发掘者的现代DNA 也会对样本产生污染。 对于前者, 本文作者主要通过对样品进行处理将之 清除; 实验室污染可以通过设立抽提和扩增对照组 来排除, 同时保证实验用品及试剂无核酸污染 (用 品为一次性, 试剂分装)。另外, 对相同个体在不同 时间和地点进行两次独立重复试验, 检验结果的可 重复性是鉴别古DNA 是否被污染的重要手段。 韩康信[3 ]通过对孔雀河古墓沟墓地头骨的人类 学研究, 认为该处的人类头骨属于人类种族中的欧 洲人种 (即高加索人种)。这组头骨的主要特点是宽 而低的面, 眉弓和眉间突度强烈, 鼻突起明显, 长2中颅型, 颅高较高, 额较倾斜, 低眶。测量特征的 比较说明, 这些颅骨与南西伯利亚、哈萨克斯坦、伏 尔加河草原和咸海沿岸地带分布的青铜时代居民的 颅骨特征比较相近, 同属原始欧洲人种的古欧洲人 类型, 而与南帕米尔塞人头骨 (印度2阿富汗类型) 的 差异明显。 对于孔雀河古墓沟墓地居民, 本研究测得一组 完全由欧洲谱系组成的序列, 与韩康信的研究结论 一致, 而且从核酸多样性、平均配对差异上看, 这 个古代群体均与欧洲群体接近, 这表明早在 3800 年 前的铜器时代, 罗布诺尔地区已有单一的欧洲人种 构成的人群存在。对于该地区古代居民属于何种种 系来源, 与新疆境内其他的古代欧洲人种成分的关 系问题, 还需要进行更深入研究。 [致谢: 本研究工作得到了新疆考古所的大力支 持, 实验中的样本和相关背景由新疆考古所的张玉 忠、王炳华老师提供, 在此一并表示谢忱 ] [参考文献 ] [ 1 ] Com as D , Calafell F, M ateu E, et al, M itochondrialDNA varia2 t ion and the o rig in of the Europeans [J ]. H um Genet, 1997, 99: 4432449. [ 2 ] Paβaβbo S, H iguch i R , W ilson A. A ncien t DNA and the po lym erase chain reaction [J ]. B io Chem , 1989, 264: 970929712. [ 3 ] 韩康信 1 新疆古代居民种族人类学的初步研究 [J ] 1 新疆社会 科学, 1985 (2) : 612711 [4 ] 王炳华 1 孔雀河古墓沟发掘及其初步研究 [J ] 1 新疆社会科学, 1983 (1) : 11721271 [ 5 ] A nderson S, Bank ier A T , Barrell BG, et al. Sequence and o rgan ization of the hum an m itochondrial genom e [J ]. N atu re, 1981, 290: 4572465. [ 6 ] To rron iA , R ichardsM , M acau lay V , et al. m tDNA hap logroup and frequency patterns in Europe [J ]. Am J H um Genet, 2000, 66 (3) : 117321177. [7 ] 崔银秋, 段然慧 1 新疆古代居民的遗传结构分析 [J ] 1 高等学 校化学学报, 2002, 23 (12) : 227822281 [ 8 ] Ho rai S, M urayam a K, H ayasaka K, et al. m tDNA po lymo2 rph ism in east asian popu lations, w ith special reference to the peop ling of Japan [J ]. Am J H um Genet, 1996, 59: 5792590. 表现为荨麻疹反复发作结肠癌 1 例报告 吉林大学朝阳校区医院　赵　羽 1　临床资料　 患者, 男性, 70 岁, 教师。无明显诱因反复出现皮肤风团、瘙痒 2 年余。发病时皮肤突然风团发生, 成批出现, 有时1 d 反复出现数次, 呈浅黄白色或淡红色。风块大小不等, 大者约 2 cm , 邻近部位风团互相融合。风团剧烈瘙痒且越挠越多。患 者曾用扑尔敏、赛庚啶、息斯敏、地塞米松、中药及脱敏治疗, 皮疹消退且不留痕迹, 但反复发作。患者因出现腹胀、腹泻、 排大便不规律就诊。腹部B 超检查, 肝、胆、脾、双肾未见异常, 但发现肠腔积液, 诊断为肠梗阻。门诊以肠梗阻收入外科 住院治疗。入院时查体: 全身皮肤泛发淡红色风团, 以躯干为重。全身浅表淋巴结无肿大。无贫血貌。双肺、心脏听诊无异 常改变。腹软, 肝、脾未触及, 腹部未触及包块。实验室检查: 血、尿常规正常。肝功能、肾功能正常。便潜血阳性。空腹 血糖 516 mmo l·L - 1。胸正位片: 双肺、心脏未见异常。纤维结肠镜检查: 乙状结肠、降结肠见多处充血、糜烂; 横结肠可 见多处息肉, 表面光滑。进镜至肝曲处, 肠腔狭窄, 内镜不能通过。钡剂灌肠显示回盲部升结肠肠腔内有约蛋黄大小充盈缺 损, 外缘不规则, 诊断为结肠占位病变, 不除外结肠癌。行右半结肠切除术。术中见腹腔清洁, 局部淋巴结无肿大。术后病 理报告: 结肠黏液腺癌, 侵及浆膜, 两断端未见癌侵及, 阑尾可见癌侵及。2 个淋巴结未见癌侵及。患者住院 8 d, 痊愈出院。 术后荨麻疹消退, 随访 1 年, 荨麻疹、肿瘤无复发。随访 3 年荨麻疹无复发。 2　讨　论　 该患者反复出现荨麻疹 2 年余, 诊断结肠癌并手术切除治疗后荨麻疹消退。1998 年杨唯曾报道 1 例子宫肌瘤并发荨麻疹 患者, 子宫肌瘤切除后荨麻疹消退, 随访 10 年未复发。表明荨麻疹反复发作可能与肿瘤有关。有些肿瘤可能产生组胺样物 质, 作为过敏介质引起皮肤症状。 (吉林 长春 130021) —256— 吉林大学学报 (医学版) 　第 30 卷　第 4 期　2004 年 7 月