GB 19915.9-2005-T 猪链球菌2型溶血素基因PCR检测方法

ICS 07.100.30 C 53 荡黔 中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准 GB/T 19915.9-2005 猪链球菌2型溶血素基因PCR 检 测 方 法 Detection method of the Streptococcus suis hemolysin gene for type 2 by PCR 2005-09-27发布 2005-11-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中 国 国 家 标 准 化 管 理 委 员 会 发 布 GB/T 19915.9-2005 前 言 猪链球菌2型是链球菌属的成员，其致病菌株可致猪链球菌病，引起猪败血症、脑膜炎等 近年来， 随着我国养猪业的发展，该病流行日趋严重，给养猪业带来巨大损失。人可通过伤口感染该菌，并导致 死亡。溶血素是猪链球菌2型一种重要毒力因子。通过检测猪及其产品中分离菌株是否含有猪链球菌 2型溶血素基因，可以作为区分猪链球菌2型无毒菌株与致病菌株的一个指标，特制定本。 本标准的附录A为性附录。 本标准由国家标准化管理委员会提出。 本标准由全国动物防疫标准化技术委员会归口。 本标准主要起草单位:中华人民共和国江苏出人境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院。 本标准主要起草人:陈国强、唐泰山、张敬友、姜众、王凯民、张常印、林祥梅、吴绍强、刘建、韩雪清、 贾广乐 、梅琳 。 GB/T 19915.9-2005 猪链球菌2型溶血素基因PCR 检 测 方 法 范 围 本标准规定了猪链球菌2型溶血素基因PCR检测的操作方法。 本标准适用于猪及其产品中分离菌株的猪链球菌2型溶血素基因的检测。 规范性 引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有 的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB/T 6682-1992 分析实验室用水规格和试验方法 术语和定 义 下列术语和定义适用于本标准。 3. 1 猪链球菌2型 Streptococcus suis type 2 猪链球菌是属于链球菌属的一种细菌，根据其英膜多糖抗原的差异，可分为1-34及1/2共35个 血清型。猪链球菌2型是猪链球菌的一个血清型，不仅对猪致病性很强，而且可以感染特定的人群，是 一种重要 的人 畜共患病病原菌 。 缩略语 PCR DNA dNTP by polymerase chain reaction,聚合酶链式反应 deoxyribonucleic acid，脱氧核糖核酸 deoxyribonucleoside triphosphate，脱氧核昔酸三磷酸 base pair，碱基对 测定方法 5.1 方法提要 以可疑细菌培养物提取的核酸，作为DNA进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，与 标准分子量标记比较，来确定扩增产物的大小。 5.2 试荆和材料 除另有规定，所用试剂均为分析纯，水为符合GB/T 6682-1992的灭菌双蒸水。 5.2.1 猪链球菌 2型溶血素基因PCR反应混合物:10 X PCR缓冲液 2. 5 tiL, 25 mmol/L MgCl, 2. 0 pL,2. 5 mmol/L dNTP 2 pL、上下游引物各1 pL，用双蒸水补至20 IL。引物序列如下，其目的片 段长度为495 6p, sly1:5'000,AAG,TTC,AAG,CCG,CAT,TTA 3'(1542) sIy2:5'GAA,GAT,TGC,GAG,CAT,TTC,CTG 3'(2036) 5.2.2 Taq DNA聚合酶。 GB/T 19915.9- 2005 5.2.3 琼脂糖:电泳级。 5.2.4 澳化乙锭 5.2.5 酚:Tris饱和。 5.2.6 三氯甲烷。 5.2.7 异戊 醇。 5.2 8 异 丙醇。 5.2.9 70%乙醇。 5.2. 10 分子量标记 :DL 2000 5.2. 1l 十六烷基三甲基嗅化按(CTAB)提取液:0. 1 mmol/L Tris-HC1(pH 7.5),10 mmol/L EDTA (pH 7.5),2% CTAB,0.7 mmol/L NaCl, I%日一琉基乙醇。 5.2.12 TE缓冲液:10 mmol/L Tris-HCI(pH 8.0),1 mmol/I. EDTA(pH 8.0). 5.2.13 10 X PCR缓冲液:100 mmol/L KCI, 160 mmol/L (NH4 )2S0?20 mmol/L MgS0<, 200 mmol/L Tris-HCI(pH 8.8),1%TritonX-100,1 mg/ mL BSA. 5.2. 14 电泳缓冲液:242g Tris,57. 1 ml一冰乙酸，100 ml- 0. 5 mol/L EDTA(pH8. 0)，加蒸馏水至 1 000 ml -;使用时10倍稀释 5.2. 15 加样缓冲液:0. 25%澳酚蓝，40%蔗糖。 5.3 仪器和设备 5. 3. 1 离心机 。 5.3.2 DNA热循环仪。 5.3.3 核酸电泳仪。 5.3.4 p H计。 5.3.5 移液器:10 pL,20 VI-,100 pL,1 000 IrLa 5.3.6 紫外线透射仪或凝胶成像系统。 5.3.7 恒温水浴锅 5.4 操作步骤 5.4.1 样品处理和基 因组 DNA的提取 取可疑细菌的培养物1.0 ml,, 10 000 r/min离心1 min，沉淀用560 pL TE缓冲液悬浮，或挑取可 疑细菌菌落，用560川一TE缓冲液悬浮，加人30川 10%十二烷基硫酸钠((SDS)和3 pL 20 g/L蛋白酶 K,370C水浴60 min后，再加人100 pL 5 mol/L NaCl和80 pL CTAB/NaCl,650C水浴10 min，加人体 积比为25，24，1的酚+三氯甲烷+异戊醇混合液770 pL,混匀，40C 12 000 r/min离心 5 min，取 400川上清液;加人体积比24 : 1的三氯甲烷+异戊醇混合液400 VL,混匀，40C 12 000 r/min离心 5 min，取200 ul上清液加人等体积的异丙醇沉淀;40C 12 000 r/min离心15 min，弃上清;70%乙醇洗 涤一次，晾干;加人50 pL双蒸水溶解沉淀。 也可用等效的DNA提取试剂盒提取DNA模板。 5. 4. 2 PCR扩增 取比待检菌株数多两只的猪链球菌2型溶血素基因PCR反应混合物的PCR管，2 000 r/ min离心 10 s后各加人Tay酶(2. 5U/pL) 0. 3川，分别加人待检菌株DNA提取物和阴性、阳性核酸对照5. 0 VL 到PCR管中，2 000 r/min离心10 s，立即进行PCR扩增 扩增条件为:95℃预变性5 min;940C 1 min, 56 0C 1 min,720C 1 min,35个循环;720C延伸10 min,40C保存。 5. 4. 3 PCR扩增产物电泳检测 取1. 5 g琼脂糖，于100 mL电泳缓冲液中加热，充分溶化，制胶。在电泳槽中加人电泳缓冲液，使 液面刚刚没过凝胶。取20川 PCR扩增产物分别和适量加样缓冲液混合后加样，进行电泳。电压大小 根据电泳槽长度来确定，一般控制在3 V/cm-5 V/cm，电泳时间为30 min-35 min。将电泳好的凝胶 2 GB/T 19915.9-2005 放人终浓度为1 kg/mL的澳化乙锭染色缓冲液中染色15 min-20 min，在紫外线透射仪或凝胶成像系 统上观察结果，并做好试验记录和样品位置。 6 结果及判断 6. 1 试验结果成立条件 阳性对照的PCR产物电泳后在495 by的位置上出现一条特异性条带，阴性对照PCR产物电泳后 没有条带，试验结果成立;否则，结果不成立 6.2 结果判断 6.2.1 在试验结果成立的前提下，如果样品中PCR产物电泳后在495 by的位置上出现一条特异性条 带，判为该菌株含有猪链球菌2型溶血素基因 6.2.2 在试验结果成立的前提下，如果样品中PCR产物电泳后在495 by的位置上未出现一条特异性 条带，判为该菌株不含有猪链球菌2型溶血素基因。 7 废弃物处理和防止污染的措施 检测过程中的废弃物，应收集后高压灭菌处理。 检测过程中防止交叉污染的措施见附录A, GB/T 19915. 9-2005 附 录 A (规范性附录) 检测过程中防止交叉污染的措施 A. 1 抽样和制样过程 抽样和制样工具，应清洗干净，1210C,15 min-20 min灭菌，一套清洁工具限于一个样品使用。存 放样品的容器应该经过清洗、灭菌，或为一次性灭菌容器。 A. 2 检测过程 A. 2. 1 PCR实验室应分为样品制备区、前PCR区、PCR区、后PCR区。将模板提取、PCR反应液配 制、PCR循环扩增及PCR产物的鉴定等步骤分区或分室进行。实验室的运作应从“净区”到“脏区”单 方 向进行 。 A. 2.2 实验过程中，应穿实验服和戴手套，手套要经常更换。各区要有专用实验服，经常清洗。 A.2.3 各区所有的试剂、器材(尤其是移液器)、仪器都应专用，不得带出该区。 A.2.4 所有溶液、水、耗材和器具要1210C,15 min-20 min灭菌，避免核酸和(或)核酸酶污染。每种 溶液应使用高质量的成分和新蒸馏的双蒸水。在200C-250C贮存的试剂中，可加0. 025%的叠氮钠 所有试剂应该以大体积配制，然后分装成仅够一次使用的量进行贮存。 A.2.5 装有DNA模板或引物的离心管打开之前，要简短离心，离心管不能用力崩开，以免产生气 溶胶 。 A. 2.6 前PCR区中，最好能在PCR操作箱中加人PCR反应各组分。 A. 2.7 实验前后，实验室用紫外线消毒以破坏残留的DNA, A. 2.8 可伸 用 UDG和 dUTP系统控制污染 。