NEW乙型肝炎病毒表面大蛋白检测用于筛查隐匿性HBV感染

1 乙型肝炎病毒表面大蛋白检测用于筛查隐匿性乙型肝炎病毒表面大蛋白检测用于筛查隐匿性乙型肝炎病毒表面大蛋白检测用于筛查隐匿性乙型肝炎病毒表面大蛋白检测用于筛查隐匿性 HBVHBVHBVHBV感染感染感染感染※※※※ 吴正林 庄 鹏 林汉利 陆学东 刘 键 钟小强 林广城 目的：目的：目的：目的：用血清学方法检测乙型肝炎病毒表面大蛋白（HBLP）来筛查隐匿性 HBV 感染，探讨临床隐匿性 HBV 感染的血清学检测策略。方法：方法：方法：方法：在日常工作中从临 床检测备份管随机收集 2000 份用国产 ELISA试剂检测 HBsAg 阴性结果的血清 标本，双份分装－20℃冻存，单份标本实施 HBLP 检测，HBLP 阳性标本增加另 外两种共三种国产 ELISA试剂双份复查 HBsAg；HBLP 阳性标本再经美国超灵 敏MONOLISA HBsAg ULTRA试剂双份检测 HBsAg，并行双份 DNA定量、 结果取均值。结果：结果：结果：结果：2000 份 HBsAg 阴性标本共检出 15 例 HBLP 阳性；HBLP 阳性标本用三种国产 ELISA试剂双份复查 HBsAg 结果一致阴性；通过美国超灵 敏MONOLISA HBsAg ULTRA试剂复查 HBsAg 结果全部阳性；前述 15 份标本 HBV DNA定量分析结果显示均小于 500copies/ml，其中 400~500 copies/ml 2例， 300~400 copies/ml 3 例， 200~300 copies/ml 5 例， 100~200 copies/ml 4例，小于 100 copies/ml 2 例。结论：结论：结论：结论：用国产常规 ELISA 试剂检测 HBsAg 普遍存在漏检， 漏检标本 HBLP 结果可能阳性，检测 HBLP 有利于筛查出隐匿性 H BV 感染，为 积极寻找临床隐匿性 HBV 感染的检测策略提供了血清学参考。 关键词：关键词：关键词：关键词： 乙型肝炎病毒；表面大蛋白；隐匿性；HBsAg DeDeDeDetetetetectingctingctingcting hepatitishepatitishepatitishepatitis BBBB VirusVirusVirusVirus LargeLargeLargeLarge SurfaceSurfaceSurfaceSurface ProteinProteinProteinProtein totototo filtratefiltratefiltratefiltrate thethethethe OccultOccultOccultOccult HBVHBVHBVHBV infectioninfectioninfectioninfection WU Zheng-lin, ZHUANG Peng, LIN Hang-li, LU Xue-dong, LIU Jian, ZHONG Xiao-qiang, LIN Guang-cheng Department of Clinical Laboratory, The Fourth People′s Hospital of Shenzhen , Shenzhen 518033 , China Corresponding author: LU Xue-dong, Email: luxuedong2004@yahoo.com.cn 基金项目：深圳市福田区科技计划重点项目(FTWS090) 作者单位：518033 广东深圳市第四人民医院检验医学部（吴正林、陆学东、刘 键 、 钟小强、林广城），感染科（庄 鹏），消化科（林汉利） 通讯作者：陆学东，电子信箱：luxuedong2004@yahoo.com.cn 2 [Abstract][Abstract][Abstract][Abstract] ObjectiveObjectiveObjectiveObjective Detecting hepatitis B virus large surface protein (HBLP) with serological method to filtrate the occult HBV infection and study the clinical detection strategy. MethodsMethodsMethodsMethods Two thousands HBsAg negative stochastic serum samples were collected from the copy tubes in daily work to detect hepatitis B Virus markers (HBVM) with national ELISA regent kits and put them － 20℃ frostily. The 2000 samples were detected with HBLP and filtrated the positive samples. The HBsAg markers were doubly counterchecked with other two adding kinds of national ELISA regent kits (total 3 kinds) at the filtrated samples. The last samples were doubly tested again with American MONOLISA HBsAg ULTRA regents. HBV DNA levels were quantitative analyzed with fluorescence quantitative PCR (FQ-PCR) and taking the mean results. RRRResultsesultsesultsesults Fifteen HBLP positive samples were detected out from the 2000 serum samples. We educed the conform negative results from the three kinds of national regents but conform positive results from the American MONOLISA HBsAg ULTRA regents in repeating HBsAg detection at the 15 samples. The HBV DNA FQ-PCR quantitative results were all less than 500 copies/ml and divided into two cases between 400~500 copies/ml, three cases 300~400 copies/ml, five cases 200~300 copies/ml, four cases 100~200 copies/ml and two cases were less than 100copies/ml. ConclusionConclusionConclusionConclusion The false HBsAg negative results for serum samples are more generally through national regents than through importations and HBLP results maybe are positive in these samples. Detecting HBLP marker is propitious to filtrate the occult HBV infection. This study provided a kind of serological reference for actively searching for the detecting strategy in occult HBV infection field. [Key[Key[Key[Key words]words]words]words] Hepatitis B virus/HBV; Large surface protein; Occult; HBsAg 隐匿性HBV 感染具有传染性和致病性已成共识, 在不明原因肝脏疾病病因 学诊断、献血安全和器官移植受者HBV 感染等方面均具有重要意义。隐匿性 HBV 感染目前还没有一个明确统一的准确定义，从临床检验的角度一般理解为 在ELISA方法检测HBsAg 阴性的个体用PCR 或其他核酸扩增方法检出了 HBVDNA。隐匿性HBV 感染的发生机制可能与基因变异、窗口期、HBV 低水平 复制及受限于方法学和检测所用试剂的灵敏度等诸多因素有关[1]。本研究尝试采 3 用包被针对HBV构象型前S区高亲和力、高特异性单克隆抗体的HBLP ELISA试 剂盒常规检测HBLP这一血清学指标来筛查临床隐匿性HBV感染。 和方法材料和方法材料和方法材料和方法 一、标本来源 在日常工作中从临床检测备份管随机收集 2000份用国产 ELISA试剂检测血 清学指标（HBVM） HBsAg 阴性结果的血清标本，双份分装－20℃冻存。所有 标本为真空采血、空腹血清，除外溶血脂血标本。来源于 2008 年 9月至 2009 年 1 月来我院体检科健康查体者。 二、试剂与方法 1. HBsAg 检测： A、B、C三种国产 HBsAg 检测试剂均为经国家正式注册合格 的国产品牌试剂，ELISA方法，选择波长 450nm，Cutoff=0.105。2000份血清标 本经国产 A试剂检定 HBsAg 阴性后全部检测 HBLP，筛选出 HBLP 阳性标本。 针对 HBLP 阳性标本增加 B、C另外两种 HBsAg 国产 ELISA试剂，经 A、B、C 三种国产试剂同时双份复检 HBsAg。临介血清和质控品购自卫生部临床检验中 心。HBLP 阳性标本的 HBsAg 确证采用灵敏度极高的美国超灵敏 MONOLISA HBsAg ULTRA试剂，ELISA方法，选择波长 450nm，Cutoff =0.081，本试剂灵 敏度低于 0.060ng/ml，经WHO认可的 SFTS 2001亚型盘 adw2、adw4、adr、ayw1、 ayw2、ayw3、ayw4、ayw5、ayr 验证 S/CO均大于 5。 2. HBLP 检测：试剂盒由北京热景生物技术有限公司生产，ELISA方法；选择波 长 450nm，Cutoff =0.105；随盒附带质控品阳性对照 OD＞1.0，阴性对照 A＜0.1。3. HBV DNA 定量分析：试剂盒购自深圳匹基生物工程有限公司，实时荧光定量 PCR 方法，阳性工作品拷贝数参照试剂盒内具体给定，双份检测结果取均 值（注：区别于科研用途的临床诊断检测报告结果小于 500copies/ml 仅供参考）。 严格按照行业主管部门颁布的有关基因扩增检测实验室管理规范执行，所有 HBVDNA 定量分析标本均为真空采血、独立标本，取自临床检测备份管。以上 所有试剂均在有效期内使用，严格按照试剂书及本实验室 SOP程序操作。 三、仪器 1. 瑞士哈密尔顿 Hamilton Fame 24/ 20全自动酶标分析仪 。 2. 德国罗氏实时荧光 PCR定量分析仪。 4 结结结结 果果果果 一、HBLP 检测结果：2000份血清标本经国产 A试剂检定 HBsAg 阴性后全部检 测 HBLP，共筛选出 15例 HBLP 阳性标本。 二、HBsAg 国产 ELISA试剂检测结果：针对 15份 HBLP 阳性标本增加 B、C两 种 HBsAg 国产 ELISA试剂，经 A、B、C三种试剂同时双份复检 HBsAg 结果一 致阴性。 三、美国超灵敏MONOLISA HBsAg ULTRA 试剂检测结果：针对上述15份HBLP 阳性，经 A、B、C三种国产 ELISA试剂复检 HBsAg 结果一致阴性的标本，经 美国伯乐 HBsAg ELISA试剂检测结果均呈阳性。 四、HBVDNA 定量分析结果：针对上述 15份标本行双份 HBVDNA定量检测取 均值，结果显示均小于 500 copies/ml。其中 400~500 copies/ml 2 例，300~400 copies/ml 3 例， 200~300 copies/ml 5 例， 100~200 copies/ml 4 例，小于 100 copies/ml 2例。 讨讨讨讨 论论论论 HBsAg 阳性是 HBV 感染的重要依据, HBsAg 的转阴及抗- HBs 的出现一直 被认为是 HBV 被清除和临床痊愈的标志。但随着分子生物学技术在临床检测中 的发展和应用, 发现部分 HBV 感染者血清 HBsAg 阴性, 但血清或肝组织 HBV DNA 持续存在, 从而提出“隐匿性 HBV 感染”的概念，使得许多隐匿性肝炎的 病原学得到确认，隐匿性 HBV 感染具有传染性和致病性已成共识。目前隐匿性 HBV 感染的研究已成为医学领域热点之一，流行病学资料显示隐匿性HBV 感染 多见于 HBV 高流行区，在高流行区有 70-90 %的人暴露于 HBV，这种长期反复的 暴露是形成隐匿性 HBV 感染的重要原因，临床上大量不明原因的肝脏疾病可能与 隐匿性 HBV 感染相关[1，2]。近日，2009-3-17 南方日报要闻板刊登了广州医学院 附属肿瘤医院历时三年完成的广州医药重大科研项目结果，报导显示广东地区社 区人群 HBsAg 阳性率高达 17.85%，远远超过全国平均水平，主要与广东地区居 民社交活动频繁、酒精消耗量高以及珠三角水资源等因素相关。在类似的 HBV 高流行区大力开展隐匿性 HBV 感染筛查更显重要，本次实验结果为广泛开展隐 匿性 HBV 感染筛查的常规检测策略提供了参考。 HBV 区分为 Dane 颗粒、管状颗粒、小球形颗粒这三种病毒颗粒。Dane 颗 5 粒即完整病毒颗粒，病毒外膜由大蛋白、中蛋白和小蛋白三种包膜蛋白组成，含 有 HBV-DNA。如果血液中含有 Dane颗粒，则 HBLP 检测和 PCR测定 HBV-DNA 均得到阳性结果； 管状颗粒即亚病毒颗粒，它的病毒外膜也是由大蛋白、中蛋 白和小蛋白三种包膜蛋白组成，但不具有病毒核衣壳蛋白和核酸 HBV-DNA。当 血液中含有管状颗粒而缺乏 Dane颗粒或载量极低时，则 PCR测定 HBV-DNA将 得到阴性结果，而 HBLP 检测仍然阳性； 小球形颗粒的包膜蛋白由中蛋白和小 蛋白组成，如果 HBV 感染者血液中只含有小球形颗粒，则大蛋白和 HBVDNA 均阴性[3，4]。HBLP 是 HBV Dane颗粒和亚病毒颗粒的主要包膜成份，与 HBV 病 毒的复制程度密切相关。在感染早期，它与细胞受体结合介导病毒的细胞内摄入 ， 在感染晚期是病毒组装和分泌的关键。HBV 感染肝细胞合成的大蛋白数量远远 超过病毒形态发生所需要的量, 在缺少病毒核衣壳的条件下, 最终形成球状或纤 维状的空的亚病毒颗粒，研究表明血液中 HBLP晚于 DNA消退。乙肝鸭模型证实 了HBV感染者血清的感染性不仅依赖于Dane颗粒的多少, 还依赖于富含大蛋白 的亚病毒颗粒的数量。 作为亚病毒颗粒包膜主要成份之一的 HBLP 具有反式激 活功能, 能使病毒复制重新激活。随着近年来对乙肝病毒表面大蛋白在乙型肝炎 发病机制、病毒感染与复制等方面的深入研究, 具有双重拓扑结构的乙肝病毒表 面大蛋白对 HBV 感染、复制及疗效动态监测的临床应用价值越来越被世界各国 所重视[3，4，5]。 本次实验从 2000份国产常规试剂检测 HBsAg 阴性标本中检出 15例 HBLP 阳性，这 15 份标本再经另外两种国产试剂检测 HBsAg 仍然阴性。经美国超灵 敏MONOLISA HBsAg ULTRA试剂确证 HBsAg 均呈阳性。最近中国药品生物制 品检定所报告用同一份乙肝表面抗原定量血清评价国内外 6家 HBsAg 酶联免疫 诊断试剂的灵敏度，结果显示进口试剂较国产试剂灵敏度高 4 一 10 倍[6]，本次 实验结果与之相符。一方面表明用国产常规 ELISA试剂检测 HBsAg 普遍存在漏 检，而漏检标本 HBLP 结果可能阳性；另一方面也说明了 HBLP 检测试剂的高 度特异性，源于应用结构生物学技术结合现代免疫学技术筛选出来的针对 HBLP 前 S抗原的单克隆抗体。本次实验结果为积极寻找临床隐匿性 HBV 感染的检测 策略提供了核酸扩增技术(NAT)以外的血清学参考，值得我们思考。NAT技术目 前被认为是判断病毒是否复制的金标准，可以避免由于病毒变异、窗口期、低病 6 毒载量等 HBV 隐匿性感染给常规免疫学检测带来的假阴性结果，已成为目前诊 断 HBV 隐匿性感染的主要方法，我国已于近年尝试采用 NAT技术多管混合筛查 献血员[7]。本次实验 HBVDNA 定量分析结果显示 13 例呈低拷贝复制，只有 2 例低于检测下限。一方面验证了 HBLP 阳性结果的可靠性，同时也再次验证了隐 匿性 HBV 感染大多以低拷贝形式出现[1]，值得临床注意。作为常用 NAT技术之 一的荧光定量 PCR方法已经非常成熟，定量检测准确率极高，可以真实反应HBV 感染和复制状况，但由于费用和其它可操作性问，目前还不适合我国广泛开展 ， 尤其在一些经济欠发达地区[8]。不同人群隐匿性 HBV 感染率有较大差异，文献 报导在 HBsAg 阴性健康献血员中, 血清 HBV DNA 检出率在 0~8.8%[1]，本次实 验用 NAT技术以外的血清学方法检出了 0.75%（15/2000），不排除仍然有一部分 隐匿性 HBV 感染漏检，值得我们深入研究。基于本次实验结果结合目前我国 HBsAg 检测现状，HBLP 检测不失为一个隐匿性 HBV 感染的有效筛查手段。 近期国内外大量文献报导了 HBLP与 HBV DNA的高相关性及其在 HBV感 染、复制及疗效动态监测的临床应用价值[3，4，9，10，11]，从 2008年 8月 HBLP ELISA 检测试剂盒获得国家医疗器械正式注册认证以后，本实验室就在常规 HBVM 的 基础上增设了这一新的 HBV 血清学指标。基于本次实验结果，在常规 HBVM检 测工作中如果发现HBsAg阴性而HBLP阳性多提示HBsAg漏检或隐匿性HBV感染 ， 应该引起重视。我们预期随着 HBLP 检测广泛应用于临床将会显现其在隐匿性 HBV 感染筛查中越来越重要的临床价值。 参参参参 考考考考 文文文文 献献献献 1. 张振华，叶珺，杨东亮.隐匿性乙型肝炎病毒感染的研究进展. 实用肝脏病杂志， 2008 ，11（3）：200－203. 2. Pollicino T, Raffa G, Costantino L, et al. Molecular and functional analysis of occult hepatitis B virus isolates from patients with hepatocellular carcinoma[J]. Hepatology, 2007, 45( 2) : 277- 285. 3. Chai N，Gudima S，Chang J，el a1．Immunoadhesins containing Pre-S domains of hepatitis B virus large envelope protein are secreted and inhibit virus infection[J]．Virol, 2007，81： 4912—4918． 4. Patient R，Hourioux C，Sizaret PY, el a1．Hepatitis B virus subviral envelope particle 7 morphogenesis and intracellular trafficking[J]．Virol，2007，81：3842-3851． 5. 饶高峰，陈恩福，颜鸣鹤，等.乙型肝炎病毒基因型和DNA载量与外膜大蛋白关系研究. 中华实验和临床病毒学杂志，2008，22（5）： 348－350. 6. 吴星，周诚，黄维金，等.乙型肝炎病毒表面抗原定量血清的标定及初步应用. 中国自然医学杂志，2008，10（2）：133－135. 7. 吴玉清，郭建，李金明，等.混合核酸检测法筛查 HBV 窗口期献血者. 中华检验医学杂志 ， 2008，31（5）：566－567. 8. 叶贤林，柏景乔.无偿献血人群低水平乙肝感染情况调查分析. 中国预防医学杂志，2007， 8（3）：183－185. 9. 吴正林，刘 玢,肖桂初,等.乙型肝炎病毒表面大蛋白检测的临床应用研究. 中华医院感染学杂志，2007，17（6）：624－626. 10. 吴正林，刘 玢,肖桂初,等.乙型肝炎病毒表面大蛋白与HBV DNA检测的对比研究. 中国实验诊断学，2007，11（4）：479－481. 11. 龚玉华，胡云，张利莉，等.检测乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白的临床意义. 中华实验和临床病毒学杂志，2007，21（4）：380－382. 作者简介：吴正林 男 41岁 主任技师 目前主要从事临床免疫学检验及实验研究工作 单位：广东深圳市第四人民医院检验医学部 Post Code：518033 Tel: 13688806616 Email: szwzlwzh@yahoo.com.cn