人骨髓间充质干细胞的培养及向软骨细胞分化

人骨髓间充质干细胞的培养及向软骨细胞分化① 100850 　北京　军事医学科学院基础医学研究所　李秀森　郭子宽　刘晓丹　侯春梅　毛　宁 　　摘　要　为建立分离纯化、大量扩增人骨髓间充质 MSC ,改进其冰冻保存的 ,并初步探索其体内向软骨细胞分化的最佳方法 ,以 Percoll (11073g/ ml)密度梯度离心法分离人骨髓中单个核细胞 ,用含经筛选的 10 %的胎牛血清的低糖 DMEM 体外培养扩增骨髓干细胞 (MSC) ,FCM鉴定细胞纯度 ,传代 2 次以后的细胞吸附于明胶海绵内 ,以 TGF2β为主要刺激因子体外诱导 1 周 ,植入裸鼠皮下。在不同的 时间取出组织块 ,甲苯胺蓝染色显示细胞外基质。结果发现 ,体外培养扩增的人间充质 MSC表达 CD166、CD29、CD44 等表面抗原 ,不表 达 CD34、CD45、HLA2DR等抗原 ;MSC可以不经消化 ,直接在原培养瓶内冻存在 - 70 ℃低温冰箱 ,3 个月后复苏的细胞生物学特性没有明 显改变 ;体外诱导的细胞植入裸鼠皮下 4 周后即出现软骨细胞特有的结构。说明骨髓 MSC具有独特的生物学特征 ,体外培养的 MSC具 有体内成软骨能力 ,应用 MSC构建软骨组织具有一定的可行性。 　　关键词　骨髓间充质干细胞 ;软骨 ;细胞分化 中国图书资料分类号　R329128 CULTURE OF HUMAN MESENCHYMAL STEM CELLS FROM BONE MARROW AND THEIRDIFFERENTIATION IN2 TO CARTILAGE Li Xiusen , Guo Zikuan , Liu Xiaodan et al . Institute of Basic Medical Sciences , Academy of Military Medical Sciences , Beijing 100850 Abstract 　To develop the methodology to purify and culture2expand mesenchymal stem cells (MSC) from human bone marrow and investigate the optimal system for MSC differentiation into chondrocytes mononuclear cells were harvested by gradient centrifugation on Percoll at density of 11073g/ ml and seeded in low2glucose DMEM containing 10 % fetal calf serum. The purity of cells was evaluated by flow cytometric technique. MSC of 2 passages thereafter were absorbed into a biomaterial of gelatin sponge and induced to differentiate in to chondrocytes for one week under the influ2 ence of TGF2βand other inductive agents. The feature of chondrocytes in engineered tissues was identified by toluidine blue staining at various time points. The results showed that human mesenchymal stem cells culture2expanded were positive for CD166 , CD29 , and CD44 , but negative for CD34 , CD45 , and HLA2DR. Furthermore , when treated cells absorbed into the biomaterial were implanted subcutaneously into BALB2c nude mice , they formed cartilage2like tissues after 4 weeks. Our conclusions is that cultured marrow MSC have unique biological features and the capacity to differentiate into chondrocytes in vivo , so they are useful for cartilage engineering by serving as the seed cells. 　　Key words　bone marrow mesenchymal stem cells ; cartilage ; cell differentiation 　　骨髓中除含有造血干细胞外 ,还存在着另外一种具 有向中胚层和神经外胚层组织细胞分化能力的多能干细 胞 ,即间充质干细胞 (MSC) 。它是一种具多向分化潜能 的原始骨髓细胞 ,在一定的条件下可以向成骨细胞、软骨 细胞、脂肪细胞、基质细胞等分化[1、2]。因此 ,MSC 是组 织工程尤其是骨或软骨组织损伤修复中重要的种子细 胞。 本研究利用作者优化的骨髓 MSC 分离纯化、大量 扩增的方法[3～5] ,初步探索了骨髓 MSC向软骨细胞分化 的可行性 ,并在动物体内进行了验证。改进了 MSC的冻 存方法 ,以期为骨髓 MSC 在软骨损伤中的应用提供依 据。 1 　材料与方法 1. 1 　骨髓 MSC的分离纯化及培养　采集正常人骨髓 , 肝素抗凝 ,用低糖 DMEM(DMEM2L G, Hyclone 公司)适 当稀释 ,用 11073g/ ml 的 Percoll 液 (Pharmacia 公司) 900 g 离心 30min ,分离单个核细胞 (MNC) ,将收集的 MNC 用 DMEM2L G洗 2 次 ,计数并调整细胞浓度 ,按2 ×105/ cm2 加入含有经筛选的胎牛血清 (10 % , Hyclone 公司) 的DMEM2L G的 24 孔培养板 (Coster 公司)中 ,在 37 ℃、5 %CO2饱和湿度的培养箱中培养 48h 后 ,除去非贴壁细胞 ,更换新的培养体系继续培养。待贴壁细胞的密度增至90 %左右时 ,用 0105 %胰蛋白酶 (Amresco 公司)消化 ,按6 000个细胞/ cm2的密度植入培养瓶中传代培养。112 　骨髓 MSC的鉴定　胰蛋白酶消化收获骨髓 2 ×105个 MSC细胞 ,分别与抗 CD29、CD34、CD44、CD45、CD92、CD166 和 HLA2DR ( Phar Mingen 公司) 单抗室温反应30min ,经 PBS洗涤 2 次后与标记 FITC的二抗避光反应15min ,细胞洗涤后悬浮于 PBS中 ,以备流式细胞仪。细胞化学染色采用常规方法进行。113 　骨髓 MSC的冷冻保存及复苏　取扩增培养的含不同密度 MSC 的培养瓶 (75mm2) 吸弃培养体系 ,加入含李秀森 ,实验师。主要从事细胞生物学、实验血液学研究。已发表论文 20 余篇 ,获军队和北京市科技进步二等奖各 1 项 ,三等奖 1 项。①国家重点基础研究发展规划 (编号 G1999054302)和国家自然科学基金(编号 30070857)资助课题 ·1901·　解放军医学杂志 2002 年 12 月 第 27 卷 第 12 期 Med J Chin PLA Vol 27 No 12 Dec 2002 　 10 %DMSO、30 %或 90 %胎牛血清的 DMEM2L G的冻存 体系 ,按 12ml/ 瓶将瓶底面积铺满 ,封严瓶口 ,用包布包 裹两层 ,平整存放于 4 ℃冰箱的冷冻盒内 ,存放 2～4h 后 ,转移至 - 70 ℃低温冰箱。冻存不同时间后 ,取出含细 胞的培养瓶 ,放入水温 40 ℃水浴箱快速解冻 ,避免剧烈 晃动 ,以免摇动的冰块摩擦瓶底使细胞脱落 ,弃上清 ,用 PBS洗涤 2 次 ,再加入 MSC的培养体系 ,37 ℃培养箱培 养。 114 　骨髓 MSC 向软骨分化的诱导 　取扩增的人骨髓 MSC(传代 3 次) ,将 5 ×105/ 10μl 的细胞加入体积为 3～ 4mm3的生物材料胶原海绵(华西医科大学组织工程中心 实验室张志明教授赠送)内。在 37 ℃、5 %CO2培养箱内 孵育 4h。然后加入 10 %FBS的DMEM2L G中继续培养 , 第 2 天弃上清 ,加入 015ml 含有下列物质的软骨诱导分 化培养体系 :DMEM2L G,胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸均为 6125μg/ ml ,BSA1125μg/ ml ,丙酸盐 1mmol/ L ,抗坏血酸磷 酸盐 3715μg/ ml ,地塞米松 10 - 7mol/ L (以上均为 Signa 公 司产品) , TGF2β1 50ng/ ml (PharmTech 公司) 。每天半量 换液 ,连续培养 7 天。然后将培养的含细胞的生物材料 植入经乙醚麻醉的 6～7 周龄的裸鼠 (本院动物室提供) 皮下 ,经体内培养不同时间脱颈杀死裸鼠 ,取出形成软骨 的组织块 ,经 40 %甲醛固定后进行组织切片 ,HE染色观 察结果。 2 　结　果 211 　骨髓 MSC的分离培养及形态特征　应用 Percoll 液 (11073g/ ml)梯度离心(900 g ×30min)从骨髓中分离单个 核细胞 ,接种于经筛选的 10 %FBS的 DMEM2L G中 ,72h 后出现贴壁的纺锤状细胞 ,10～14 天后形成克隆 ,MSC 贴壁稀疏时 ,长梭形细胞的两极朝向不规律 ,细胞排列混 乱 ,细胞之间往往通过突起相连接。约 3 周时出现致密 的贴壁细胞层 ,此时 ,细胞的两极开始有规律地排列成束 状 ,有的呈漩窝状 ,细胞呈半透明状 (倒置生物显微镜 下) 。胞浆淡染 (Wright2Giemsa 原位染色时细胞不易着 色) 。胞核呈长椭圆形 ,核仁 2～6 个 (3 个居多) ,染色质 较密集(图 1) 。 图 1 　人骨髓 MSC 形态 (原位瑞氏2姬姆萨染 色 ,20 ×215) 212　骨髓 MSC 的表型特征 　用流式细胞仪分析了 MSC的表面抗原的标记 ,结果显示 ,MSC 均一地表达 CD166(间质细胞阳性) ;粘附分子 CD29、CD44 (纤连蛋白 和透明质酸盐的受体、基质细胞阳性) ;而 CD34(造血干/ 祖细胞及内皮细胞阳性) 、CD45 (白细胞阳性) 、HLA2DR (抗原递呈细胞及激活 T 细胞阳性)及荆豆素 (内皮细胞 的标记)阴性。 213 　骨髓 MSC细胞化学特征　将 MSC消化后离心涂 片 ,采用常规方法进行酸性醋酸酯酶 (ANAE) 、糖原 (PAS) 、碱性磷酸酶 (ALP) 、苏丹黑B (SB)和酸性磷酸酶 (ACP)染色。光镜下计数至少 200 个细胞。染色结果显 示 ,骨髓 MSC ANAE和 PAS呈强阳性反应。SB 和 ACP 均为阴性反应。而ALP则有 5 %～15 %的阳性细胞。用 软骨基质特异性染料甲苯胺蓝染色显示细胞外基质淡红 色异染。 214 　冷冻保存后的骨髓 MSC生物学特性　40 ℃水浴中 复苏的 MSC 经过 3 天左右的培养 ,约有 99 %的细胞成 活(附表) 。 附表　冷冻保存 3 个月对 MSC的影响 细胞贴壁 存活细胞 ( %) CD166 (前/ 后) 细胞周期(前/ 后) G0～G1 G2～M S 70 % 99 9719/ 9514 9119/ 9115 4192/ 4197 3118/ 3110 80 % 99 9719/ 9516 9119/ 9116 4192/ 4190 3118/ 3111 100 % 70～85 9719/ 9418 ⋯ ⋯ ⋯ 实验结果显示 ,冷冻保存 MSC 不影响其生物学活 性。选择贴壁 70 %～80 %满的细胞冻存为宜 ,复苏后的 细胞几乎 100 %的存活。 215 　骨髓 MSC向软骨细胞分化　将包含有 MSC的生 物材料块体外在软骨诱导分化培养体系的作用下孵育 1 周后 ,再移植到裸鼠皮下 ,在裸鼠体内微环境下诱导骨髓 MSC向软骨细胞分化。诱导 4 周时生物材料支架大部 分被吸收 , 骨髓 MSC逐渐形成软骨细胞。图 2(封 3)为 植入 4 周时在裸鼠皮下形成的软骨样组织块。图 3 (封 3)为组织块经切片 HE染色后的软骨细胞。从图中可以 明显看出 ,骨髓 MSC诱导的软骨细胞胞体较圆 ,胞浆较 少以致呈空泡状。细胞核较小 ,呈圆形 ,一般偏于一侧 , 染色质浓缩 ,核仁 1 个 ,较模糊。个别细胞已经失去细胞 浆和细胞核而形成细胞空壳。 3 　讨　论 人们早在 19 世纪就已经证实 ,骨髓中含有一种具 有形成骨、软骨及脂肪细胞能力的细胞 ,但研究工作真正 取得重要进展还是 20 世纪 80～90 年代[6 ]。Friedenstein 等[1 ]的研究建立了骨髓 MSC分离培养的方法。自此 ,有 关 MSC的研究逐渐深入。证实了骨髓 MSC为较大体积 ·2901· 　解放军医学杂志 2002 年 12 月 第 27 卷 第 12 期 Med J Chin PLA Vol 27 No 12 Dec 2002 　 的细胞 ,形态呈纺锤状 ,不表达分化相关的细胞标志 ,其 倍增时间为 30h ,细胞周期研究显示约 10 %细胞处于 DAN 合成期。其细胞表面表达 SH2、SH3、SH4、SB10、 SB20、SB21、CD13、CD29、CD44、CD49b、CD90、CD120a、 CD124 等表面抗原。经过数十代传代和低温冷冻保存后 细胞表型和分化潜能不发生明显改变。 目前 ,人们已经建立了骨髓 MSC向成骨细胞、成软 骨细胞、脂肪细胞以及神经元样细胞分化的体外模型 ,证 实了人骨髓 MSC 多向分化的能力。然而有关人骨髓 MSC体内成软骨细胞分化能力的报道不多。在本实验 中 ,通过优化骨髓 MSC的诱导扩增条件 ,使得骨髓 MSC 数量较快地增加 ,探索改进了该细胞的冻存方法 ,为软骨 细胞的诱导分化提供了充足的种子细胞。之后 ,应用含 有 TGF2β1、地塞米松、抗坏血酸等成分的特定体外诱导 体系在体外诱导一定时间 ,再经裸鼠体内继续诱导 ,使骨 髓 MSC分化成软骨细胞。实验表明 ,骨髓 MSC在动物 体内诱导后 ,生物材料支架胶原海绵被动物吸收后所形 成的细胞 ,经细胞形态及软骨基质特异性染色确认为软 骨细胞。其中起主要作用的因素可能是 TGF2β1 和地塞 米松 ,其中 TGF2β1 可刺激原始间质细胞分化和表达软骨 表型。 软骨细胞体内诱导分化模型的建立 ,为骨髓 MSC 向软骨、成骨、肌肉、肌腱、神经元等细胞分化提供了一个 很好的方法 ,为骨和软骨等组织损伤的修复带来了希望。 值得提出的是 ,由于体内作用时间较短 ,所形成的软骨并 不是完全意义上的软骨组织。这将是我们今后需要继续 探讨的问题。 参　考　文　献 1 Friedenstein AJ , Chailakhyan RK, Gerasimov UV. Bone marrow osteogenic stem cells : in vitro cultivation and transplantation in diffusion chambers. Cell Tissue Kinet ,1987 ,20 :263 2 Yoo JU , Bsrthel TS , Nishimura K et al . The Chondrogenic potential of hu2 man bone2marrow2 derived mesenchymal progenitor cells. J Bone Joint Surg , 1998 ,80(12) :1745 3 李秀森 ,郭子宽 ,杨靖清 等. 骨髓间充质干细胞的生物学特性.解放军 医学杂志 ,2000 ,25(5) :346 4 刘晓丹 ,郭子宽 ,李秀森 等. 人骨髓间充质干细胞分离与培养方法的 建立.军事医学科学院院刊 ,2000 ,24(4) :282 5 郭子宽 ,刘晓丹 ,李秀森等.人骨髓MSC向神经元样细胞分化.中国实 验血液学杂志 , 2001 ,9(1) :91 6 Ferrari G, Cusella2De2Angelis G, Coleffa M et al . Muscle regeneration by bone marrow2derived myogenic progenitors. Science , 1998 ,279 :1528 (2002208217 收稿　2002210210 修回) (本文编辑　李恩江) 《骨质疏松症诊治问答》 　　本书由资深专家总结骨质疏松症的最新研究成果、临床中西医结合治疗骨质疏松症的经验体会编写而成。共 5 篇 ,结合临床常遇到 的病例与百姓生活中的疑问 ,从骨质疏松的发生、发展、预防和治疗等方面 ,采用条目问答的方式 ,详尽地回答了骨质疏松症的一般知识 , 骨质疏松症的诊断 ,骨质疏松症的鉴别诊断 ,骨质疏松症的预防与治疗 ,骨质疏松症的中医药、膳食和物理疗法等问题。内容全面、实用 , 图文结合 ,突出中西医结合治疗的特点 ,是妇女、中老年朋友进行自我诊断、调治、预防的好帮手。 本书将于 2003 年 1 月由人民军医出版社出版。 《医学英语写作技巧和词语辨析》 　　此书为《中华医学杂志》(英文版)资深编审钱寿初先生之新作 ,作者积数十年国际科技交流经验和大量案头材料 ,从写作、语法、修 辞、、格式以及词语方面出发 ,对医学英语的许多特点和用法作了细致的分析。例句宏富 ,娓娓道来 ,涉笔成趣。它是医学生 ,医学临 床及基础科研工作者 ,其他科技工作者 ,从事编辑、教学的专业人员提高英语论文写作和国际交流能力的案头工具书。 本书于 2002 年 5 月由人民军医出版社出版。 《现代急性中毒诊断治疗学》 　　本书分 8 篇 ,系统论述了急性中毒的诊断与救治、急危重病人的救治与监护等基本理论与技术 ,深入阐述了工业性毒物中毒、农 药中毒、植物性毒物中毒、动物性毒物中毒、药物中毒、日常生活用化学品中毒、化学战剂中毒的毒理、发病、临床表现、诊断、治疗等 , 同时论述了国内外最新研究进展和作者的临床经验。参加编写的是全国各单位从事急救特别是中毒急救工作多年的专家。本书内容先 进 ,阐述深入 ,理论与实践并重 ,具有很高的实用参考价值 ,可供急诊科、内科、基层门诊的各级医务工作者参考学习。 本书于 2002 年 8 月由人民军医出版社出版。 ·3901·　解放军医学杂志 2002 年 12 月 第 27 卷 第 12 期 Med J Chin PLA Vol 27 No 12 Dec 2002