饱和转铁蛋白和凝血酶在脑出血后早期脑损伤中的作用

饱和转铁蛋白和凝血酶在脑出血后 早期脑损伤中的作用 朱丹化叶盛曾博诸葛启钏 【摘要l 目的探讨脑出血后早期脑组织中铁的来源及其损伤机制，观察是否存在另一种铁相关血液成分如饱和转铁蛋白 (holo—Tf)，它和凝血酶也可能参与脑出血后早期的脑损伤。方法在雄SD大鼠右侧大脑基底核分别注入holo—Tf、游离转铁蛋白 (apo—Tf)、小剂量凝血酶、凝血酶与apo—Tf复合物以及凝血酶与holo—Tf复合物。24h后观察脑水肿情况，鉴定DNA破坏(免疫组 化测定8一羟基一2一脱氧鸟苷)和铁分布(三价铁染色测定)情况。结果holo—Tf、apo—Tf和1U凝血酶单独注射都不能导致脑水 肿。而holo—Tf和凝血酶复合物能导致明显脑水肿(P<0．05)、DNA破坏和同侧基底核铁的蓄积。结论在脑出血后早期(24h内)的 确存在铁介导的脑损伤，它与血红素降解产物之一的铁离子无关。主要作用机制可能是holo—Tf和小剂量凝血酶导致脑出血后脑损 伤。而凝血酶可能通过促进细胞内铁摄取来加重脑损伤。 【关键词】脑水肿铁氧化应激凝血酶转铁蛋白 HoIo—transferr呐andthrombinareinvolvedinbraindamageafterintracranialhemorrhageZHUDanhua，YESheng。ZENGBo，eta1． DepartmentofNeuroaurgery。theFirstAffiliatedHospitalofWenzhouMedicalCollege。Wenzhou325000。China 【Abstract】ObjectiveToinvestigatetheinvolvementofhoIo—transfeⅢn(holo-If)inbraintissuedamageafterintracranial hemorrhage(ICH)．MethodsMaleSprague-Dawleyratsreceivedanintracerebralinfusionofholo-Tf，apo(noniron—Ioaded)一Tf， thrombin．oracombinationofTfwithlhrombinintotherightbasaIganglia．Theratswereeuthanized24hlaterformeasurementof brainedemaandassessmentofDNAdamage(by8一hydroxyI一2一deoxyguanos；neimmunohistochemistry)．Irondistributionwas examinedbyirondyeing．ResultsHolo—Tf。apo-Tf。or廿1rOmbindidnotinducebrainedemawhenadministeredalone．The combinationofholo—Tfwiththrombincausedbrainedema(P<0．05)．DNAdamage，andintracellulariFORaccumulationjnthe ipsilateralbasalganglia．ConclusionResultssuggestthatTf-boundironmaycontributetoICH-inducedbraininjuryandthrombin mayfacilitatecellularironuptake． 【Keywords】BrainedemaIron0xidativestressThrombinTransferrin 许多研究已证实脑出血后第3天血红素降解产物 开始缓慢释放，包括铁离子、胆红素和一氧化碳，其中 铁的释放在脑出血3d后介导的脑损伤中起重要作用。 然而有研究发现脑出血后早期(24h内)也出现铁介导 的脑损伤。那么脑出血早期的铁来源于哪里呢?是否可 能存在一种铁相关成分，它能导致脑损伤并且与血红 素的降解产物无关。因此，本实验观察在血浆中正常存 在的饱和转铁蛋白(holo—Tf)是否能导致脑损伤。将 holo—Tf或游离转铁蛋白(apo—Tf)单独或加入凝血酶分 别注人大鼠脑内观察脑水肿、DNA破坏和铁分布情况， 现将结果报道如下。 1和方法 1．1动物准备和脑内注射实验使用雄性SD大鼠34 只，体重300～4009，由温州医学院提供。将大鼠用水合 作者单位：325000温州医学院附属第一医院神经外科 氯醛(4ml／lOOg)麻醉后放在立体定向仪架上，在右冠状 缝旁开中线3．5mm处颅骨上钻Imm4,；fL，用微量进量 器26号针头穿刺右侧基底核(前后肉水平位，前肉向右 旁开3ram，硬脑膜向下6mm)，分别注入apo—Tf(Sigma 公司)0．4mg，holo—Tf(Sigma公司)0．4mg，凝血酶(Sigma 公司)1U，apo—Tf+凝血酶(0．4mg+1U)，holo—Tf+凝lIIL酶 (0．4rag+1U)。上述药物分别用50斗l0．9％氯化钠溶液溶 解，并用微泵以10¨l／min速度注射。注射完后停针 5min缓慢拔出针头，骨蜡封闭颅骨小孑L后缝合皮肤。Tf 的剂量根据正常血浆水平(约3。5ng，ITll)选择【11。holo-Tf 的百分比取决于铁的水平，大鼠一般为30％～40％。选 择凝血酶的剂量时考虑：(1)该剂量单独使用不会导致 脑损伤I：I，便于观察其是否能加剧holo—Tf导致的脑损 伤。(2)大脑内注入凝血酶能增量调节脑内Tf受体的表 达I，I，说明凝血酶和Tf有潜在关联。 1．2实验分组实验分2大组。第1大组共5小组，每 23 万方数据万方数据 组5只大鼠，右基底核分别注入apo—Tf、holo—Tf、凝血 酶、apo—T“凝血酶、holo—T“凝血酶。24h后处死并测定 脑组织水含量。第2大组共3小组，每组3只大鼠，右基 底核分别注入holo—Tf、apo—Tf+凝Il『L酶、holo—Tf+凝血 酶。24h后处死并用免疫组化法测定脑组织中8一羟基一 2一脱氧鸟苷(8一OHdG)及三价铁染色测定铁分布。 1．3脑组织水含量测定立体定向仪下大鼠脑内注射 药物后24h，将大鼠用水合氯醛(4ml／1009)腹腔内注射 麻醉，然后断头取脑，快速沿额极后4mm冠状位取3ram 后脑组织块，并分离成左右基底核和皮层4组织块，同 时取小脑作为对照。取出立即用电子天平称其湿 重，然后用100℃烘干机24h烘干后测其干重，最后计 算脑组织水含鼍(％)=(湿重一干重／湿重)×100％。 1．4免疫组化和组织化学大鼠麻醉后心内注射4％ 多聚甲醛溶液(溶解于磷酸盐缓冲o．9％氯化钠溶液，pH =7．4)固定后，取出脑组织，放人4％多聚甲醛溶液12h， 常规脱水，透明，将脑组织石蜡包埋，切片厚度为4斗m。 用免疫组织化学(EliVision法)测定8-OHdG。显微镜观 察细胞核染色显示棕黄色颗粒为免疫组织化学染色阳 性。改良Perl’s染色技术测定Fe“浓度。显微镜观察含 铁血黄素旱蓝色，胞核呈红色为Perl’s阳性细胞。 1．5统计学处理所有数据通SPSSl0．0软件包处理， 计量数据均以牙拯表示，组间比较采用方差分析(Scheffe 事后多重比较检验)。 2结果 2．1脑组织水含量见表1。 表1各组脑组织水含量(％) 组别 n 对侧皮层 同侧皮层 对侧基底核 同侧基底核 小脑 凝血酶 holo一7rf atm--Tf al'0-Tf+凝IffL酶 hoIo-7rf．+凝血酶 78．9±0．08‘ 78．5±0．09‘ 78．6±0．08‘ 78．8±0．10+ 78．7±0．04 79．0±0．19’ 77．7±0．05‘ 79．1±0．17+ 78．9±0．17‘ 79．0±0．17‘ 80．2±O．02 77．9±0．04‘ 77．6±O．10+ 77．8±O．09． 77．74-0．05 78．2±0．3r 78．1±0．06‘ 78．1±0．10‘ 78．2±0．40‘ 81．0±O．1l 77．9±0．10‘ 77．8±0．08． 77．7±0．07’ 77．8±O．03‘ 77．9±0．09 注：与hoIo-Tf+凝血酶组比较，’P<0．05 表1提示，脑内注射holo—Tf、apo—Tf或凝m酶24h 内均不能导致同侧基底核区和皮层的脑水肿，而注射 holo—T“凝血酶导致同侧基底核区和皮层明显脑水肿 (与其它组比较，均P<0．05)。 2．2注射holo—Tf后铁染色注射holo—Tf(图la)或 apo—Tf+凝IfIL酶(图1d)均不能导致Perl阳性细胞出现， 然而注射holo—T“凝血酶能导致同侧脑组织Perl阳性 细胞】}{{现(图lb)，但对侧没有}l{现(图1c)。 2．3 DNA损伤注射hoio—Tf(图2a)或apo—Tf+凝血酶 (图2d)后同侧基底核8一OHdG免疫反应缺失。注射 holo—Tf+凝血酶后同侧基底核测到大量8-OHdG免疫 反应(图2b)，但对侧没有测到(图2c)。 24 万方数据万方数据 3讨论 出血后铁主要来源于红细胞的裂解。脑内注射已裂 解红细胞能导致急性脑损伤【4j，与之对照，脑内注射完整 红细胞所产生的脑损伤时间为3d，与红细胞正常裂解 的时间相同。因为铁能导致自由基形成从而导致脑损 伤【蚓，所以在大鼠脑出血模型中观察铁螯和剂对脑出血 后脑损伤的影响发现它能减轻急性脑损伤，而且它在脑 出血后6h使用有效，24h后使用效果较差161。这些结果 说明脑出血早期也存在铁介导的脑损伤。 转铁蛋白是铁从组织运输到血浆的重要物质，转铁 蛋白以holo—Tf和apo一"If的形式存在于血浆中。通常 holo—Tf占30％一40％。与apo—Tf相比，holo一"If和Tf受 体结合力更好。通过Tf受体来实现铁的细胞内摄取和 释放m。脑内Tf受体一般在上皮细胞上浓度较高，而在 脑实质细胞上较少表达。脑l叶J血能增加Tf受体水平Isl。 凝血酶是一种多功能丝氨酸蛋白酶，由无活性的凝 血酶原产生，催化纤维蛋白原转变为纤维蛋白，在凝血 级联反应中起关键作用。脑出血后凝血酶在脑内产生的 时间是一个持续的过程，直至凝m酶原的耗竭。动物模 型已经证实铁和凝血酶在脑出血介导脑损伤中的作用 191。凝血酶产生于m肿形成的过程中，脑实质组织的凝血 酶能导致急性脑损伤f101。凝血酶抑制剂能减轻脑出血后 脑水肿和肢体功能缺失⋯】。有人已经发现少剂量的凝血 酶通过各种抑制脑损伤途径对脑组织有保护作用㈨01， 本实验发现单独注射1u凝血酶并不能导致明显脑损 伤与以上结论相符。而腩内注射大剂量(5或10U)凝血 酶就会产生脑损伤。在某些特定条件下小剂量凝血酶也 能致腩损伤，比如同时注射lu凝血酶和活化的组织型 纤维蛋白溶酶原或脑缺吼时注射低剂量凝血酶【121会加 剧脑损伤。以上这些表明凝m酶的作用随着剂量改变和 细胞环境变化而变化，其具有潜在的诱导细胞损伤的功 能。最近发现腩内注射1U凝m酶1d或3d后能导致同 侧基底核Tf受体水平明显增加口1，所以它在一定条件下 可能会通过增量调节转铁蛋白受体来促进铁摄取从而 导致局部铁浓度增加。但是脑出血后凝血酶介导的脑损 伤是否通过铁初始介导尚未明确。Wagner等15I最近报道 在白种人血浆中存在一种成分能快速诱导氧化应激。 本实验开始观察holo一"If和apo—Tf能否导致脑损 伤(通过脑水肿来评价)。注射转铁蛋白剂量的选择相当 于它在100“l血浆中的浓度11I，结果holo—Tf，apo—Tf和 凝IfIL酶均不能导致脑水肿；而注射holo—T“凝血酶能导 致明显脑水肿(约81％)这恰好能证明脑}f；血24h内不 仅存在脑损伤并且与铁有关。 实验中单独注射holo—Tf不能增加细胞内铁水平 (通过Perl’s染色法来评估)，这可能表明在正常脑组织 中低浓度的Tf受体阻止转铁蛋白结合铁转移铁到细胞 内；注射holo—T“凝血酶能提高细胞内铁染色表明通过 凝血酶对Tf受体的增量调节导致铁结合转铁蛋白进入 脑实质细胞增加。 脑内铁增高可导致脂质过氧化和自由基形成，自由 基的一个靶点之一就是DNA。在本实验中注射holo一11f+ 凝血酶能导致DNA的氧化损伤(通过测定8-OHdG来 评估)，这也能证明脑出血24h内存在与铁相关的脑损 伤。 所以本实验所涉及的3个内容(脑水肿、细胞内 铁水平检测和DNA损伤指标)相辅相成，表明大鼠模型 脑内注射holo—Tf．+凝血酶24h内能导致脑水肿，增加细 胞内铁水平和导致DNA损伤；而单独注射holo—Tf或 apo—Tf+凝血酶却不能。机制町能因为凝血酶能增量调 节神经元上的Tf受体I”，促进铁从holo一"If转移到脑细 胞内，从而导致细胞内铁水平增加。因此在脑内血肿形 成时，h01n_Tf和凝血酶的同时存在可能导致脑损伤，这 也可以解释为何铁螯和剂能减轻脑m血后急性脑损伤。 总之，本实验表明注射holo—T“凝血酶能导致细胞 内铁水平增加可能与凝m酶通过增量调节转铁蛋白受 体来促进铁摄取和氧化应激有关。这=fill是脑}l；血后早 期脑损伤的主要途径，它对提供治疗策略有重要价值。 4参考文献 【1】GreiveKA，OsickaTM，RussoLM．eta1．ephrotic-like proteinuriainexperimentaldiabetes【J1．AmJNephrol，2003． 23：38-46． 【2】XiG，KeepRF，HuaY．eta1．Attenuationofthrombininduced brainedemabycerebralthrornbinpreconditioning[J】．Stroke． 1999．30：1247—1255． 【3】HuaY。KeepRF，HoffJT，eta1．Thrombinpreconditioning attenuatesbrainedemainducedbyerythrocytesandiron【乩J CerebBloodFlowMetab，2003，23：1448—1454． 【4】HuangF-P．XiG．KeepRF，eta1．Brainedemaafter 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