锦鲤疱疹病毒荧光定量PCR检测方法的建立

2010年 第 4期 总 第 265期 第 31卷 锦鲤疱疹病毒荧光定量 国·牧业论坛· PCR检测的建立 张 艳 ，孟庆峰 ，钱爱东 ，王伟利 (1．吉林农业大学动物科技学院，吉林长春 130118；2．吉林出入境检验检疫局，吉林长春 130062) 【摘 要】根据锦鲤疱疹病毒(KHV)胸苷激酶(TK)基因的保守序列设计一对引物和相应的TaqMan探针，建 立荧光定量PCR方法，用于锦鲤疱疹病毒快速、灵敏 、可定量的检测手段。构建并制备实时荧光定量 PCR的 品，对反应体 系进行优化 ，并做特异性 ，敏感性和重复性试验 。结果表 明，成功构建 荧光定量 PCR标准 品，建立荧光定量标准曲线 ，标准曲线的相关系数为 0．992，所建立的荧光定量PCR方法特异性强、敏感性 高， 重复性好 。 【关键词】锦鲤疱疹病毒；荧光定量PCR 【中图分类号1S917．1 【文献标识码IA 【文章编号】1672—2078(2010)04—0011—04 Establishment ofa Flurogenic Quantitative Polymerase Chain Reaction AssayforDetectionofKioHepesvirus ZHANG Yan ，MENG Qing—feng2,QIAN Ai—dong ，WANG Wei—li (1．Jilin Agricutural University,College ofAnimal Science and Technology,Changchun Jilin 130118；2．Jilin Exit&Entry Inspection and Quarantine Bureau，Changchun Jilin 1 30062) [AbstmctlA set ofprimers and TaqMan probe for Fluorescent Quantitation PCR were designed to detect the conservative sequence of Kio Hepesvirus thymidine kinase gene．The standard recombinant plasmids for TK gene were constructed as reference standard used in absolute quantification assay．The reaction conditions of FQ．PCR were optimized．The quanti- tative curve was established using the reference standard plasmids．The FQ·PCR method was tested for sensitivity,repeat- ability and specificity by amplification the DNA of the virus．The results demonstrated that the plasmid for FQ-PCR was favorable．The regression coe伍cient ofthe quantitative curve was 0．992．The detection system based on FQ．PCR was rapid． sensitive and steady． [Key words]Koi Herpesvirus；Flurogenic Quantitative Polymerase Chain Reaction 锦鲤疱疹病毒病是由锦鲤疱疹病毒(Kio Hep— esvirus，KHV)引起的一种传染性疾病，目前的研究 表明，该病毒仅感染鲤和锦鲤，且各年龄段的锦鲤 和鲤鱼均可感染，死亡率高达 8O％～ 100％“ 。此病 首先在以色列暴发，接着美国、欧洲一些国家，如英 国、德国、比利时，亚洲一些国家均有此病的暴发， 给锦鲤和鲤鱼养殖业造成重大经济损失 。 该病的主要临床症状是精神沉郁，食欲废绝； 行为上无方向感的游泳，甚至停止游泳；皮肤上出 现苍白的块斑和水泡；鳍、鳞片、口腔、腹部出血或 收稿日期：2010年 3月 5日 基金项 目：吉林省科技厅项 目(20080218)。 作者简介：张艳(1983-)，女，吉林省辽源市人，全 日制硕士研究生， 主要从事动物病毒学方面的研究。 通信作者：王伟利(1965一)，女，研究员，主要从事动物检疫及分子 生物学研究。E—mail：Wang—weili@l63．tom。 电话 ／0431—87989877／8681 4288／868141 88 E-mail：Jlxmsy@i63．COlt! 充血；患病鱼出现症状后 1～ 2 d内死亡。 该病毒适合培养温度为2l℃，只对锦鲤鳍细胞 系敏感，产生细胞病变。目前国内有效的监测和诊 断方法不多，主要用聚合酶链式反应(PCR)方法。PCR 方法和细胞培养技术是OIE推荐的KHV诊断方法。 目前，很多流行病的诊断都采用一种新技术——荧 光定量PCR方法，该方法以其敏感性、特异性高，污 染少，可定量等优点逐渐成为实验室和临床诊断中 的主要方法。本研究利用锦鲤疱疹病毒 VR52标 准株建立荧光定量PCR(Flurogenic Quantitative Poly— merase Chain Reaction，FQ．PCR)方法，利用一对特异 性引物和探针建立一种特异的实时定量PCR方法， 以期为 KHV感染提供快速、特异的诊断方法。 1 材料和方法 1．1 毒株 KHV标准毒株 VR52购 自ATCC⑩公司。鲤春 ·n 。 ·窦验硼穷· 病毒血症病毒(SVCV)，传染性造血器官坏死病毒 (IH】 ，)和病毒性出血性败血症病毒 (IHN、，)阳性 质粒由深圳出入境检验检疫局馈赠 1．2 试剂和仪器 组织基因组 DNA提取试剂盒 (DV8l1A)，Ta— qDNA聚合酶，PCR反应试剂盒，质粒提取试剂盒， PMD-1 8T Vector,Takara Agarose Gel DNA Purification KitVer．2．0，Takara M iniBEST Plasmid Purification Kit Ver．2．0，DNA分子量Marker，DNAgreen，焦磷酸二乙 酯 (DEPC)均购 自宝生物工程(大连)有限公司，其 他试剂均为 国产或进 口分装。核酸蛋白分析仪 Gene．specv为 Hitachi Naka Instruments Co．Ltd公司 产品。荧光 PCR仪 ABI7000 Sequence Detection Sys． tems为ABI公司、普通PCR仪PTC．200PeltienTher- mal Cycler为 MJ Research公司产 品。凝胶成像仪 Gel DoeTMXR为 BIO．RED公司产品，高速冷冻离 心机 3K30为德国SIGMA公司。 1．3 FQ'PCR标准品的制备 1-3．1 引物的设计与合成 根据 GenBank上公布的 AB375391 KHV胸苷 激酶(TK)基因的保守序列，利用Premier5．0引-物设 计软件设计两条引物，送上海生工合成。引物序列 如下 ： 上游引物 TK1为：5 一GGGT1’ACCTG1．ACGAG一3 下游引物TK2为：5 -CACCCAGTAG rrn气TGC一3 1．3．2 TK基 因的扩增 将 KHV标准毒VR52接种 KF细胞，待出现细 胞病变收获细胞毒。用组织基因组DNA提取试剂 盒提取细胞毒的核酸，做为扩增的。提取过程 按照说明进行操作 。PCR扩增体系如下：25 的体系，DNA模板 3 ，l0×Ex Taq buffer 2．5 ， dNTP(2．5 mM)2．5 ，引物 TK 1 (10 pM)，引物 T l (10 pM)，Taq酶(5U／laL)0．2 rtL，DEPC处理 水补到 25 。反应条件为 94"C 5 min；95℃l min， 52℃ 1 min，72℃ l min，40个循环；72℃ 10 min；4"C 保温。扩增片段大小为409 bp，以 1％琼脂糖凝胶 电泳分析扩增效果。 1．3．3 TK基 因的克隆与鉴定 利用 DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒将 TK基因 PCR扩增产物回收(具体操作见试剂盒说明书)，将 回收的产物与 PMD．18T Vector连接 16 h。连接体 系：PMD．18TVector1 laL，PCR产物 1 0L，DEPC处理 ·12· 脏塑幽 。 ． 20l0年 第 4期 总第 265期 第 3l卷 水 3 ，连接液 5 pL。将连接产物转化到DH5ct感 受态细胞，加入 IPTG和 X。Gal，涂在Amp+琼脂平 板上，次日挑取4个白色单个菌落 分别进行PCR 鉴定。将阳性克隆菌落接种到Amp+LB液体培养 基中，37~C摇床过夜，利用质粒小量提取试剂盒提 取质粒，以1％琼脂糖凝胶 电泳鉴定。 1．3．4 质粒标准品浓度的计算 将上述质粒用核酸蛋 白分析仪测定 260nm与 280 nlTl波长下的 oD 值，判断其纯度 (OD：60l1lTl／ OD 。。nm>1．8者为纯品)，然后按照下面的公式转换 成质粒的拷贝数：每微升质粒拷贝数 (质量／分子 量)×(6．02×1 023)=【质粒浓度(ng／laL)×1 】×10。9／ 【(载体分子量+插入片段分子量)×660】×(6．02× 10 个／mo1)，其中：6．02×10 是阿佛加德罗常数； 660是每个碱基的平均分子量；重组质粒的总长度 为3101bp。标准品作 10倍梯度稀释，_20℃保存备用。 1．4 实时荧光定量PCR检测方法的建立 1．4．1 引物和 TaqMan探针的设计与合成 以1_3中PCR扩增的片段为模板，利用Beacon Designer5．0软件设计了 1对特异引物和TaqMan探 针，引物和探针均由大连宝生物有限公司合成，探 针的5 端用荧光基团FAM 标记，3 端用淬灭基团 TAMRA标记。引物及其 TaqMan探针序列见表 1。 扩增长度为 116bp。 表 1 KHV FQ．PCR所用引物和探针序列 序列 繁 GC Tm值 ／％ ，℃ 54．5 58．7 63．2 59．1 65．2 67．2 上游引物 5’．CCCTTCACCGTCAGAA1 TCTC．3’ 22 下游引物 5'-AGCTCGTACTGGGCCATCC-3 l9 探 针 5 )TGAGACAGGGACGACACACCGCC(TAMRA)-3。23 1．4．2 荧光定量 PCR反应体系及条件 反应体系：25 的总体系，DNA模板5 ，l0× Ex Taq buffer 2．5 ，dNTP(2．5 mM)2．5 ；上游引 物 l laL(10pM)，下游引物 l 0L(10pM)，探针0．81aL (10 pM)，Taq酶 (5 U／pL)llaL，DEPC处理 水补 到 25 。置荧光定量PCR仪中，反应条件为94℃3rain； 94℃ 15 S，60℃30 S，72℃ 1 min，5个循环；94℃10 s， 60"C 40 S，40个循环，收集荧光信号。用矩阵法筛 选引物和探针 的最佳使用量。 l_4．3 标准曲线的制备 将KHV标准品质粒做 l0倍系列稀释，采用优 化好的条件进行实时荧光定量 PCRo根据质粒拷 贝数和对应的Ct值，利用 SDS1．2分析软件得到标 电话 ，0431 87989877／86814288／86814188 E—mail：Jlxmsy@1 63．tom 吐 jEl幽 2010年 第 4期 总 第 265湖 第 3l卷 准 曲线。 1．4．4 FQ．PCR特异性试验 用建立的荧光定量PCR反应体系同时检测鲤 春病毒血症病毒 (SVCV)，传染性造血器官坏死病 毒 (IHNV)和病毒性出血性败血症病毒(I卜n )阳 性质粒，检测 KHV引物和探针的特异性。 1．4．5 FQ—PCR重复性试验 对FQ—PCR模板进行 10倍系列稀释，并做 2组 平行样，检测其重复性。 2 结果 2．1 KHV TK基因特异性片段的扩增 目的片段大小为409 bp，经 1％琼脂糖凝胶电 泳结果如图 1所示。 409bp 图 1 KHVTK基因 PCR扩增结果 M：100bpDNAladderMarker；1为阴性对照：2为KHVPCR．ff增片段 2．2 KHV标准阳性质粒的构建与鉴定 将 目的片段与PMD．18TVector连接，转化到大 肠杆菌DH5a，经过Amp+的琼脂平板的培养，挑取 阳性克隆菌，提取质粒，并测序。经 0．8％琼脂糖凝 胶 电泳，质粒大小为 3 101 bp，结果如图2所示。测 序结果显示，质粒中含有 目的片段。以质粒为模 板，进行常规PCR鉴定，扩增出409bp的 目的片段， 如图3所示，说明质粒构建成功，取 2号管对应的 质粒做标准品，用于荧光定量 PCR方法的建立。 M l 1 2 3 4 M2 图2阳性重组质粒电泳结果 M-：lkbp DNA ladderMarker；1、2、3、4为提取质粒 M 2：DL2000 Marker． 电活 0431—8798987 7／8681 4288／868 41 88 E-mail：jIxmsy@163．corn 409bp ·实验研究· 图3 阳性重组质粒PCR鉴定结果 M：100bp DNA ladder Marker： 1为阴性对照：2、3、4、5为质粒 PCR扩增 片段 2_3 重组质粒浓度的测定 提取的质粒经核酸蛋白分析仪测定，其质量浓 度为32．85 lag／mL，OD2 nm／OD：舯llm 比值为 1．825， 符合纯度要求。根据每个阳性质粒含 3101bp，所提 质粒DNA溶液浓度可换算为 1．6×10 个拷贝／laL。 2．4 弓I物租探针最佳使用浓度的确定 以相 同浓度的阳性核酸为模板 ，选用不同 浓度范围的引物和探针 ，采用矩 阵法筛选引物 和探针的最佳使用浓度。在模板量相同的情况下， 以循环 阈值 (Ct值)最小 ，荧光强度增加值(ARn) 最大，若两者不一致，优先以Ct值为准，矩 阵法 优选后，引物和探针 的最佳浓度分别为0．4pM和 O．32pM 。 2．5 FQ．PCR标准曲线的建立和回归方程的确定 对标准阳性质粒 l0倍系列稀释，以优化的条 件进行 TaqManFQ—PCR扩增。利用 SDS1．2分析软 件 ，以Ct值为纵坐标，质粒 DNA拷贝数的对数为 横坐标，获得一条标准曲线，如图4所示。可见， 在 1．6× 10～ 1．6× 10 拷 贝之间，测得的数值基 本在一条直线上，与 ct值有 良好的相关性，相关 系数R2=0．992，说明各个浓度组相关性非常好，可 以对病毒进行可靠的定量检测 ，此阳性质粒可作 为 FQ—PCR 的标准品。质粒在稀释到 10 仍能检 测到荧光信号，对应 16个拷贝数，该方法检测的 灵敏度为 l6个病毒拷贝数，灵敏度较高。图中， 标准 曲线的斜率为．3．09，截距为20．96，可 以得出 拷 贝数 N与 ct值之间的线性关系表达式即回归 方程：Ct=-．3．09IgN+20．96。待测样品的Ct值可直接 从仪器中读取，通过回归方程，可确定样品中核酸 的含量。 ·l3· ·墓论综述· 囤 图 4 KHV荧光定量PCR标准曲线 图 5 FQ—PCR重复性试验 2．6 FQ．PCR重复性试验 将KHV核酸做梯度稀释，做两组重复样，结果 如图5所示，重复样 Ct值之间相差 0．1左右，重复 性较好。 2．7 FQ．PCR特异性实验 分别对 IHNV、SVCV、IHNV、KHV阳性质粒， 用建立好的KHVFQ—PCR的反应体系，进行扩增。 如图6所示，只有KHV有扩增 曲线，呈现出良好的 特异性。 ·14· i l l；i} l l；I l ：；i l{i； l r i l i l l i {l l ；}；{ ；{l ； ： } l l 1 l i 0 一一 ■卞 l }} t} · ! } t}聋舅 +} ： j{l l ；{ ， ； {： } l j 膏 }j； 。{ }：{ l i；{ { ． l i l：：{：； ；。{ ；； { ! l： { r ，¨ }川r r 于¨} }r r。u }¨ ?’ l }l l ：l l{ j l l i l l 。 }； l { ；； l j!l }0{Ⅲ}¨} ‘一l： 0{毒。。暑0L⋯ { }。}¨ t,4{}一 ；{ l ；l l l；； l{ } {：{{ l { l l l i l{{ {l i； {i l l； l }l i l l }}{ l 喜 {毒 0一 {一0 00 }¨0， 舞工 }毒 j-l0 i0一 { 一；l l { ；{ i l r{ j{ ；i i l ’ } ， { f } - i l } f { } f { { } ‘ i } l 毒毒一 l～上00 0i“～l善善， 0；上 善 0 } 0}王¨ { l l ；l； l l ； l l：l l l l i l l ；{l { ： ； ； ／ {{l l l ；： {! j }l l 0亨 r P11 ⋯P ÷ 一 一 r ～r r } 啊 l l l{ l j； ；{ l 』， l l；；； ㈠ i 2 41鬟曼l ⋯ 0 l 图6 FQ PCR特异性实验 1为 KHV核酸FQ—PCR结果；2,3、4、5、6分别是 IHNV、SVCV、 IHNV阳性质粒、阴性对照和空白对照。 3 讨论 目前对锦鲤疱疹病毒病的诊断方法主要有Soli— man等 、Gunimaladevi等 报道采用LAMP法能高 = 三J ． 2010年 第 4期 总 第 265期 第 31卷 度灵敏、快速、省力的检测出KHV病毒；乌日琴等嘲、 刘荭等 陆 也初步建立了快速、灵敏和操作简便的 KHV病毒的PCR检测方法。这些方法只能作为定 性分析的手段。而本文建立的 FQ．PCR不仅具有 普通PCR的高灵敏性，而且由于荧光探针的使用， 可以通过光电传导系统直接探测PCR扩增过程中 荧光信号的变化以获得定量结果，所以还具有DNA 杂交的高特异性、光谱技术的高精确性和实时监测 的特点；FQ．PCR克服了常规 PCR的许多缺点，如 普通 PCR需要琼脂糖凝胶电泳来观察结果，费时 费力，并且紫外线和溴化 乙锭对人体又有害，这些 复杂的过程增加了假阳性的机会，FQ．PCR具有扩 增与 自动分析一体化，缩短了检测时间。本文建立 的FQ—PCR检测方法，具有高灵敏性、高特异性、操 作时间短，可做为 KHV检测首选的方法。 本文 FQ—PCR标准品的构建是荧光定量 PCR 方法建立的基础，本文选用6个稀释度的标准阳性 质粒模板，建立的标准曲线，相关系数为0．992，表 明拷贝数与 ct值相关性 良好，本试验最低可检出 16个病毒拷贝，说明灵敏度较高。因此本研究构 建的检测 KHV的标准品可用于 FQ—PCR检测。 由于FQ．PCR可定量检测病毒数量的特点，可 做为判断病毒在体内定植规律、复制水平和用药后 病毒是否被清除、新药的药效学等方面研究提供有 力的参考，有很好的应用前景和研究价值。 参考文献： [1】 Gilad O ，Yun S，Andree B．，Initial characteristics of kio herpesvirus and development ofa polymemse chain reaction assay to detect the virus in kio，Cyprinus carpio kio．Dis AquaOrg，2002，48(2)：101～ 108． [2】 张立峰，刘晶，苏世敏．一种新发现的鱼类病毒KHV在 国外的流行和研究现状【J]冲 国动物检疫，2003，20(2)： 41～ 43． [3】 Soliman H，EI-Matbouli M．An inexpensive and rapid diagnos- tic method ofKoi Herpesvirus(KHV)infection by loop-medi- ated isothermal amplifi cation[J]_J Vkol，2005，17(2)：83． [4] GunimaladeviI，KonoT，VenugopalMN，eta1．Detectionof koi herpesvirus in common carp，Cyprinus carpio L．，by loop．mediated isothermal amplification[J】．J Fish Dis， 2004，27(10)：583～ 589． 【5】 乌 日琴，刘中勇，黄宝春．PCR方法快速检测锦鲤疱疹 病毒基因[J]．检验检疫科学，2005，15(2)：6～8． [6】 刘荭，史秀杰，高隆英，等．进口锦鲤暴发病病原的 nested．PCR鉴定【J】．华中农业大学学报，2002，21(5)： 414～418．圈 电话 ／043卜8 7989877 868l4288，86814188 E-mail：Jlxmsy@163．corn