弓形虫两种保种方法的试验

中国兽医寄生虫病 2007，15(5)：22-24 Chinese Journal ofVetennary Parasitology · 简报 · 弓形虫两种保种方法的试验 陈永军， 王 权， 龚朋飞， 韩红玉， 姜连连， 黄 兵 (中国农业科学院上海兽医研究所／农业部动物寄生虫学重点开放实验室。上海 200232) 摘 要： 目的 寻求一个简便、适宜的弓形虫保种方法。方法 采用不同温度的冷冻保存法和细胞培养保存法 对弓形虫保存进行了试验研究，为深入研究弓形虫提供保证。结果 弓形虫在液氮(一196oC)、一7O℃能长期保 存，4℃能保存 14 d。通过细胞培养能获得大量的弓形虫滋养体，对培养细胞的选择性不强。结论 两种保种方法 保存后 弓形虫毒力不变。 关键词： 弓形虫；冷冻保存法；细胞培养 中图分类号：$858．935．935 文献标识码 ：A 文章编号：1005-0868(2007)05-0022-03 TW o PRESERVATIoN METHoDS oF Z1D?I，DP ．S：?l rA GD?、7=DⅡ CHEN Yong-jun， WANG Quan， GONG Peng—fei， HAN Hong—yu， JIANG Lian—liar， HUANG Bing (Shanghai Veterinary Research Institute，CAAS／Key Laboratoryfor Animal Parasitology， Ministry ofAgriculture，Shanghai 200232，China) Abstract： Objective To seek a simple proper preservation method of Toxoplasma gondii strains and pro— vide foundation for further study．M ethods Cryopreservation of Toxoplasma gondii strains by using refrigerator in different temperature and cell culture conservation were tested．Results Toxoplasma gondii eaR be preserved at 一 196。C．一70。C permanently，and oC for 14 days．Plenty of Toxoplasma gondii can be obtained by cell culture and it can infect almost every kinds of cells except erythroplastid．Conclusion The virulence of Toxoplasma gondii was steady after two preservation methods． Key words： Toxoplasma gondii；cryopreservation；cell culture 弓形虫病是一种常见的危害较严重的人畜共患 寄生虫病，属于二类传染性疾病，弓形虫是严重危 害人类生殖健康的病原性原虫，已成为人畜共患疾 病研究中的主要疾病之一。现有的保种方法主要有 小鼠传代保存、冷冻保存法、细胞培养保存法、鸡胚 培养保存法，许多地方一直使用小鼠传代保存，浪费 了许多资源同时存在被感染的风险，为此作者在 《国家自然科技平台弓形虫病保存技术规程方法》 中选择了简便、适宜的冷冻保存法和细胞培养保存 法并对此进行了验证试验。 收稿日期：2007-04-29 基金项目：国家自然科技资源平台项目(2005DKA21205-4) 作者简介：陈永军(1969～)，男，上海人，兽医师，主要从事 动物寄生虫病学研究。 1 材料和方法 1．1 材料 1．1．1 细胞 应用 MDCK(犬肾细胞)、Vero，细胞 培养。 1．1．2试剂 1．1．2．1 冷冻液的配制 按二甲亚砜：小牛血清： 1640营养液=1：2：7的比例配制，过滤除菌，作无 菌试验，一20。c保存。 1．1．2．2 细胞生长液(pH7．2)内包括 90％DMEM 培养液，10％的新生牛血清，青链霉素各200 U／mL， 以5．6％NaHCO 调节 pH。 1．1．2．3 消化液(pH7．8)为90份的 0．o2％EDTA 和 10份的0．25％胰酶，抗菌素同上，以5．6％Nail— CO3调节 pH。 1．2 方法 维普资讯 http://www.cqvip.com 第 15卷第 5期 陈永军等：弓形虫两种保种方法的试验 1．2．1 冷冻保存 法 1．2．1．1 虫株的获取⋯ 取本所液氮保存的龚地 弓形虫 RH株 ，在无菌条件下，腹腔接种昆明系小鼠 3只，每鼠0．2 mL，d4时，小鼠出现弓形虫典型症状 如背毛逆立、闭目、腹部膨大、粪便干燥结块时，脱颈 致死，快速置75％酒精全身体表消毒，然后剪开并 剥去腹部皮肤，无菌操作注入高压灭菌的 pH 7．2 PBS液 2—3 mL，随即轻轻按摩腹部，使 PBS和腹腔 液混匀，抽取腹腔液检查，此时切勿将针头刺破内 脏，以免出血或造成污染。 1．2．1．2 虫株毒力的复苏 从液氮接种小鼠的第 一 代弓形虫腹腔液，连续传接种小鼠，以同样方法收 集第三代弓形虫腹腔液。 1．2．1．3 虫株的计数 采用血球计数板对弓形虫 进行计数。计数公式：四大格内弓形虫数／4×10 即为每毫升弓形虫滋养体数。 1．2．1．4 不同稀释浓度和冷冻温度的保存 按上 述方法获取连续接种的第 3代弓形虫滋养体腹腔 液，计数得弓形虫滋养体数为 6．4×10 个／mL腹腔 液，依次按设计浓度稀释，分装于冻存管中，贴上标 签。在不同的条件下冻存。液氮冻存时，先放在液 面上预冷3 min，随后即可沉入液氮内保存。 1．2．1．5 弓形虫滋养体定期复苏检查 定期取出 不同冷冻温度保存的弓形虫冻存管，即刻置入 37。C 水温解冻，在无菌条件下，腹腔接种昆明系小 鼠3 只，每鼠0．2 mL，每次取一滴在显微镜下观察是否 有活虫。 1．2．2 细胞培养传代保存法 ] 1．2．2．1 MDCK(犬肾细胞)、Vero细胞的培养和传 代 MDCK、Vero细胞在细胞生长液内于37。C CO， 培养箱内培育，2 d可长成单层，2—3 d可传代一 次。传代时，倒去 MDCK细胞培养瓶中的培养上清 液，用 PBS液漂洗一次，以去除残留培养液中的小 牛血清。用几滴 EDTA胰蛋白酶溶液覆盖于细胞表 面消化。37。C消化几分钟，吸出消化液，加入少许 培养液，用弯头巴氏管轻轻吹打，将贴在瓶壁上的细 胞洗脱并吹散。在另外培养瓶中加入新的培养液及 数滴细胞悬液，使之重新贴壁，长成单层。 1．2．2．2 接种弓形虫滋养体 选择生长良好的培 养二日龄细胞，调换新鲜配制的细胞生长液后 ，选 MDCK、Vero细胞各 3瓶，每瓶接种 100 uL小鼠腹腔 液，计 1．7×10 个弓形虫滋养体，接种后每 日吸出 少许培养液同时添加细胞生长液 2 mL，采用血球计 数板对培养液进行弓形虫计数。逐日计数整个培养 瓶中的虫体数。 1．2．2．3 弓形虫细胞培养液传代细胞培养 选择 培养 8 d的少许培养液接种新的已长成单层 MI3． CK、Vero细胞 ，同时以小鼠腹腔液做对照，继续按接 种弓形虫滋养体腹腔液的方法细胞培养并计数。 1．2．2．4 弓形虫细胞培养液传代小鼠试验 选择 培养8 d的少许培养液接种小 鼠，同时以小鼠腹腔 液做对照，观察小鼠感染状况。 2 结果 2．1 冷冻保存法统计结果 表 1 不同保存期出虫情况统计结果(出虫：+未出虫：一) 2．2 细胞培养结果 在细胞培养中。接种弓形虫 后，细胞逐渐受损裂解，相应地弓形虫逐日增多。至 8 d时，细胞培养瓶上的细胞脱落。弓形虫在培养 过程中，形态大多呈新月形 ，小部分呈卵圆形，当细 胞严重破坏后再继续培养时，虫体呈圆形。接种 1． 7×10 个弓形虫滋养体小鼠腹腔液后不同天数的 细胞培养液，进行游离弓形虫的计数，在接种 2、4、 6、和 8 d后，细胞 内的弓形虫数分别为 65万、625 万、1 080万、924万，结果表明弓形虫在细胞内繁殖 高峰一般均在接种后的6—7 d。连续传代接种5代 细胞，弓形虫在细胞液中的状况相同。 2．3 弓形虫毒力(致病力)检测试验 应用细胞培 养 8 d的弓形虫滋养体的培养液和小鼠腹腔液传代 接种细胞比较，弓形虫的培养增殖数量和细胞脱落 维普资讯 http://www.cqvip.com 中国兽医寄生虫病 2007年9月 时间相同。应用细胞培养8 d的弓形虫滋养体的培 养液传代小鼠，结果与小鼠腹腔液传代比较在弓形 虫滋养体形态、出虫时间无任何差异，显示其毒力未 作任何改变。 3 讨论 在冷冻保存中，对弓形虫滋养体定期复苏检查 时，液氮保存的 1×10 稀释度在4—5 d小鼠出虫， 镜检能观察到弓形虫活动，低稀释度则需要7—10 d 出虫，再不出虫时，需小鼠盲代接种。一7O。c保存 的 1×10 稀释度在6—10 d出虫，镜检未能观察弓 形虫活动。相对液氮保存比较，可能是部分弓形虫 死亡。用保存液4。c保存 的弓形虫两周后未见活 虫。而我们4℃保存的弓形虫腹腔液在 14 d时还能 观察到弓形虫活动，聚集在腹腔液的巨噬细胞周围 或部分已钻入其中，小鼠接种能出虫。有人报道弓 形虫腹腔液在4。c保存能保存 21 d，可能与腹腔液 的巨噬细胞数量较多有关。进一步证实了弓形虫能 侵犯除红细胞外的任何有核细胞。同时在试验中我 们用了1640营养液做冻存液作比较，结果都没出 虫。显示冻存液中一些防虫体结冰的二甲亚砜对虫 体的保存起了很大的作用。 应用的MDCK、Vero两种细胞进行弓形虫滋养 体培养都获成功，显示出弓形虫对细胞感染的选择 性不强。 本实验按《国家自然科技平台弓形虫病保存技 术规程方法》验证了弓形虫冷冻保存法和细胞培养 保存法取得了相同的结果，为不同条件下采用适宜 的保种方法提供了参考。 参考文献： [1] 于恩庶．弓形虫病学[M]．福州：福建科学技术出版 社 ，1991．7． [2] 赵惠芬，郑思民，顾键萍，等．弓形虫的体外培养[J]． 寄生虫学与寄生虫病杂志，1986，4(2)：116-117． [3] 鄂征．组织培养和分子细胞学技术[M]．北京：北京出 版社，1995．8． 《中国草食动物》杂志 邮发代号：54 7 (由原《中国养羊》杂志和《草与畜杂志》合刊更名) 《中国草食动物》是由农业部主管、中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所主办的综合性畜牧科技期 刊。 《中国草食动物》主要刊登包括羊(重点)、牛、兔、马、驼、鹿、鸭、鹅、驼鸟等在内的各种节粮型草食动物 的品种资源、遗传育种、繁殖技术、饲养管理、饲草料生产、畜产品加工等方面的最新研究成果，畜牧业经营管 理和生产经验，同时刊登国内外畜牧科技动态和商品信息。主要读者和服务对象是从事动物养殖和饲草料 科研、生产、经营和管理的各级科研、教学、生产人员及广大养殖专业户等。 《中国草食动物》为双月刊，大16开，72页码，彩色封面，每期定价6．00元，全年36．00元，逢双月 1日 出版。全国邮局和本刊编辑部均可订阅，邮发代号54_．57。 地址：甘肃省兰州市小西湖硷沟沿335号 邮政编码：730050 电话：(0931)2656124 内容丰富 技术新颖 实用性强 欢迎订阅 欢迎刊登广告 维普资讯 http://www.cqvip.com