胃癌组织基质金属蛋白酶-7基因表达与门静脉血和腹腔转移的关系

176 安徽医学 2007年第28卷第 3期 胃癌组织基质金属蛋白酶 一7基因达与门静脉血和腹腔转移的关系 项和平 张长乐 [摘 要] 目的 研究胃癌组织基质金属蛋白酶一7(MMP一7)基因表达与胃癌门静脉血转移和腹腔转移及胃癌 病理特征之间的关系，探讨其l临床意义。 采用逆转录聚合酶链反应(Reverse transcriptase—polymerase chain reac- tion。RT—PCR)方法检测 30例胃癌患者癌组织和正常黏膜 MMP一7mRNA，采用 RT—PCR方法检测 30例 胃癌患者和 10例腹腔良性疾病患者门静脉血和腹水中细胞角蛋白20的 mRNA(CK20 mRNA)。结果 胃癌组织 MMP一7 mRNA阳 性率60％(18／30)，明显高于远端正常组织的11％(4／30)，(P<0．001)；胃癌组有 MMP一7基因表达的门静脉血 CK20 mRNA检出率达 83．3％(15／18)，显著高于无 MMP一7基因表达的 8．3％(1／12)，(P<0．001)；胃癌组有 MMP一7基因 表达的腹水 CK20 mRNA的检出率为 66．7(12／18)，虽高于无 MMP一7基因表达的41．7％(5／12)，但(P>0．05)；MMP一 7基因表达与组织分化、TNM分期和肿瘤浸润深度相关(P<0．05)；对照组门静脉血和腹腔冲洗液中 CK20 mRN均为阴 性。结论 MMP一7基因表达与胃癌血行转移有关，参与了胃癌的浸润、转移过程，有助于判断预后 ，MMP一7基因表达 阳性的胃癌患者应尽早行全身化疗。 [关键词] 胃肿瘤；肿瘤细胞；逆转录聚合酶链反应；细胞角蛋白一20；基质金属蛋白酶一7转移 Expression of MM P一7 gene in gastric cancer tissues and its correlation with metastasis in portal vein nlood an d peritoneal cavity Xiang Heping，Zhang Changle Department ofSurgery，the SecondAffiliatedHospital，AnHuiMedical University，HeFei 230022 [Abstract] Objective To study the expression of matrix metalloproteinase一7(MMP一7)mRNA in gastric cancer and the relationship with clinicopathologic factors and metastasis in portal venous blood and in peritoneal cavity，explore its clinical significance．Methods Reverse transcriptase—polymerse chain reaction(RT—PCR)was used to detect the MMP一7mRNA in tumor tissues and in the surrounding normal tissues of 30 patients with gastric cancer，and RT—PCR was used to detect the CK20 mRNA in portal venous blood and in peritoneal washings of 30 patients with gastric cancer and 10 patients with benign disease who underwent laparotomy served as controls．Results The positive rate of MMP一7mRNA in tumor tissues 60％(18／30)were significantly higher than those the surrounding normal tissues 11％(4／11)，(P<0．001)；The positive rate of CK20 mRNA in portal venous blood of patients witfi MMP一7mRNA expression(83．3％，15／18)were significantly higher than those without MMP一7 expression(8．3％，1／12)，(P<0．001)；and the positive rate of CK20 mRNA in peritoneal washings of patients with MMP一7 mRNA expression(66．7％，12／18)were higller than those without MMP一7 mRNA expression(41．7％，5／12)，but do not have statistical significance(P>0．05)；The overexpression of MMP一7 mRNA was also related to different gastric cancer cell line，the TNM classification and the stage of the cancer(P<0．05)．None of 10 patients with benign disease was positive．Con- dusion MMP一7 gene may play a role in the blood metastasis of patients with gastric cancer，All the patients with over expres。 sion of MMP一7 mRNA should be chemical cured as soon as early and it also can be helpful to the judgement of prognosis of gas- tric c ． an cer． [Key words] Stomach neoplasm；Tumer cells；Reverse transcriptase polymeras chain reaction；CK20；MMP一7；Metasta。 s； 胃癌是常见的恶性肿瘤之一，肿瘤的血液转移和 腹腔转移与胃癌患者的预后密切相关，及早检出血液 中的癌细胞和腹腔内脱落癌细胞 (exfoliated CanCer cells，ECC)，进而采取有效的阻断治疗，是提高疗效 的关键，RT—PCR检测具有高度敏感性和特异性，可 在 10 ～10 个正常细胞中检测出 1个癌细胞，被认为 作者单位：230022 合肥 安徽医科大学急诊外科 通讯作者：张长乐 是目前检测微转移的最有效方法 J¨。成功的肿瘤微 转移 的检测取决于是否具有适 当的肿瘤标记 物。 CK20具有严格的上皮组织特异性 ，且 CK20在细胞发 生化生、癌变、肿瘤转移、体外培养等改变时，持续阳性 表达。检测胃癌患者血液、腹腔液 CK20可作为癌细 胞血液播散和腹腔播散的标志，有助于判断胃癌患者 维普资讯 http://www.cqvip.com 安徽医学 2007年第 28卷第 3期 有无血液和腹腔转移。 材料与方法 一 、临床资料：收集本院2003年 5月至 2004年 5 月收治的胃癌病人 30例为实验组，全部病例均经胃镜 病理证实；术前检查无其它部位的恶性肿瘤；术前未接 受放疗和化疗；全部病例均经手术切除治疗。收集本 院同期住院开腹手术的良性疾病患者 10例，作为对照 组。实验组男性 18例，女性 12例；年龄 38～77岁，平 均年龄59．5岁。 二、标本采集：于手术进腹时仔细止血，进腹后，常 规探查 ，浆膜如有浸润则以4层无菌纱布覆盖病灶。 有腹水的病例直接收集腹水，无腹水者以温生理盐水 (37~C)50 ml冲洗肿瘤所在区域局部腹腔，轻轻搅动 后收集冲洗液约25 ml，收取腹水后寻找到胃网膜右静 脉，置人导管至门静脉，各抽取 5 ml门静脉血，血标本 和腹水标本立即以肝素抗凝存于 一70~C低温冰箱中保 存，留待检测 CK 20 mRNA。30例胃癌标本离体后，如 有大体浆膜浸润，先描记浆膜受侵范围，随后立即取一 小块肿瘤组织及一小块距肿瘤 5 cm以上正常胃黏膜 组织作为对照，用生理盐水及 0．1％焦碳酸乙二酯 (DEPC)冲洗后存于 一70~C低温冰箱中保存留待检测 MMP一7 mRNA。所有器械均经 0．1％DEPC液浸泡 24小时去 RNA酶处理。 三、引物：根据 GenBank核酸数据库 MMP一7 (NM002423)、CK20(X73502)：使用 Primer Premier 5． 0设计三对引物，引物均由大连 Takara公司合成。 MMP一7：目的基因扩增片段长 286 bp sense：5 一GAGAC CCGCATArlq'ACA 一3 antisense：5 一GAATGTCCCATACCCAAAC 一3 CK20：目的基因扩增片段长 280 bp sense：5 一GAACAGGCTCAGGACTATCT一3 anti—sense：5 一CCACTGTAATATGCGGTAAG 一3 B—actin：目的基因扩增片段长510 bp sense：5 一CCCTGGACrlq'CGAGCAAGAGAT一3 anti—sense：5 一GArrITITI’CTGCGCAAGTrAGG 一3 四、实验方法：使用 Trls试剂盒提取总 RNA，使用 mRNA纯化试剂盒分离 MMP一7 mRNA和 CK 20 mR． NA，以MMP一7 mRNA和 CK 20 mRNA为，经逆 转录得到 cDNA进行 PCR扩增，反应参数为：94~C预 变性 5 min；94℃ 1 min，50℃ 1 min，72℃ 1 min，共 32 个循环；最后72℃延伸 15 min。 五、结果判定：RT—PCR产物置 1％琼脂糖凝胶电 泳观察结果，溴乙啶染色，紫外光下照相，RT—PCR部 177 分电泳条带 MMP一7在 286 bp、CK 20在 280 bp处有 清晰、明亮条带者为阳性，无此条带者为阴性，应用捷 达801专业数码凝胶成像与分析系统 3．3分析电泳结 果。 六、统计学处理：所有资料均录入 SPSS 10．0统计 软件包处理：配对资料比较采用McNemar配对)(2检 验，四格表组间率的比主要采用 Fish确切概率法，以P <0．05为差异有显著性的标准。 结 果 一 、MMP一7 mRNA在胃癌组织及远端正常黏膜 的表达 在 30例胃癌组织中有 18例表达 MMP一7 mR． NA，表达率为60％(18／30)，而远端正常组织中仅有4 例表达 MMP一7 mRNA，表达率为 11％(4／30)，经配 对 x 检验，差异有非常显著性(x =14．067，P<0． 001)。胃癌组织及远端正常黏膜 MMP一7 mRNA的 RT—PCR产物的电泳结果见图1。 bp M l 2 3 4 5 b 7 8 图 l 胃癌组织及远端正常黏膜 MMP一7 mRNA的 RT— PCR表达结果 M DL2000DNA标准 1～4 胃癌组织 MMP一7 mRNA的RT—PCR表达结果 5～8 远端正常黏膜 MMP一7 mRNA的RT—PCR表达结果 i 2 ：{ 4 5 6 7 8 0 lO i1 12 2000bp l(J~Dbp 750bp 500bp 250 lOObo 图2 胃癌患者及对照组门静脉血和腹水 CK 20 mRNA的 RT — PCR结果 M DL 2000 DNA标准 1～5 RT—PCR法检测胃癌患者门静脉血CK 20 mRNA结果 6～10 RT—PCR法检测 胃癌患者腹水 CK 20 mRNA结果 11 RT—PCR法检测对照组门静脉血 CK 20 mRNA结果 12 RT—PCR法检测对照组腹水 CK 20 mRNA结果 二、胃癌组织 MMP一7 mRNA表达与门静脉血 cK 20 mRNA检出率关系 在对照组 10例病人中，门静脉血 CK 20 mRNA检 测均为阴性结果，未发现假阳性。在 30例 胃癌病人 中，门静脉血 CK 20 mRNA可检出 16例，检 出率为 维普资讯 http://www.cqvip.com 178 53．3％。胃癌组织MMP一7 mRNA和门静脉血CK 20 mRNA检测结果显示：有 MMP一7基因表达的病例，门 静脉血 CK 20 mRNA检出率高达 83．3％，而 MMP一7 基因表达阴性的病例门静脉血CK 20 mRNA检出率仅 为 8．3％，差异非常显著(P<0．001)；见表 1。门静脉 血 CK 20 mRNA的 RT—PCR产物电泳结果见图2。 三、胃癌组织 MMP一7 mRNA表达与腹水 CK 20 mRNA检出率的关系 在对照组 1O例病人中，CK 20 mRNA检测均为阴 性结果，未发现假阳性情况。在 30例胃癌病人中，腹 水 CK 20 mRNA检出率56．7％。从胃癌组织 MMP一7 mRNA和腹水 CK 20 mRNA检测结果可以看 出，有 MMP一7基因表达的病例腹水 CK 20 mRNA检出率为 66．7％(12／18)，而无 MMP一7基因表达的胃癌患者 腹水 CK 20 mRNA检出率亦达到41．7％，差异无显著 性(P=0．264)，见表 2。腹水 CK 20 mRNA RT—PCR 产物的电泳结果见图2。 四、胃癌组织 MMP一7 mRNA的表达与胃癌病理 特征之间的关系 胃癌组织 MMP一7 mRNA检测结果表明癌组织中 MMP一7 mRNA的检出率与组织分化、TNM期别及肿 瘤浸润深度相关(P<0．05)；而与有无淋巴结转移及 浆膜浸润范围不相关(P>0．05)，见表 3。 表1 胃癌组织MMP一7基因表达与 门静脉血CK 20 mRNA检出率的关系 表 2 胃癌组织 MMP一7基因表达与 腹水 CK 20 mRNA检出率的关系 表3 I1癌组织 MMP一7 mRNA检出率和 胃癌病理特征的关系 病理特征 例数— 蓦 P值 组织学类型 阜好 13 5 (高 、中) 。分化 良⋯ 17 13 (低 、未、印戒、粘液) 38．5 =0．035 76．5 TNM分期 I+Ⅱ Ⅲ +Ⅳ 淋巴结转移 有淋转 无淋转 浆膜浸润范围 0～10 cm >10 cm 浸润深度 粘膜和粘膜下层 深肌层和浆膜层 安徽医学 2007年第28卷第 3期 8 2 22 16 23 16 7 2 13 17 7 11 6 1 24 17 69．6 ；0．059 28．1 53．8 = 0．246 64．7 16．7 =0．024 70．8 讨 论 MMP一7属于MMP基因家族的成员之一，其相对 分子质量最小，为28 KD。它缺乏 C末端区域，而分子 结构中 C末端区域为基质金属蛋白酶组织抑制剂 (TIMP)与 MMP相互作用的区域，调节着 TIMP的活 性，因此 MMP一7具有强大的基质降解活性和广泛的 · 底物特异性。肿瘤细胞通过分泌 MMP一7来降解构 成基底膜的 ECM成分，从而破坏了机体防御肿瘤浸润 与转移的自然屏障，增加了癌细胞的侵袭性，促使了肿 瘤的浸润和转移。 本研究显示 3O例胃癌中 MMP一7基因表达阳性 率为60％，而远端正常组织的阳性率为 11％，差异有 非常显著性(P<0．001)，与文献相符 ．3]。本研究同 时检测了 MMP一7基因表达与组织分化、淋巴结转 移、TNM分期、浆膜浸润范围和肿瘤浸润深度的关系， 结果显示 MMP一7基因表达与组织分化、TNM分期和 肿瘤浸润深度相关(P<0．05)，而与淋巴结转移和浆 膜浸润范围不相关(P>0．05)。杜月光 曾检测了高 分化的胃癌细胞珠 MKN 28和低分化的胃癌细胞株 DATO111、MGC一802，SGC一7901中 MMP一7表达情 况。结果显示，高分化的 MKN 28细胞株 MMP一7表 达弱阳性，而低分化的胃癌细胞株则 MMP一7表达强 阳性，并对细胞株的习性分析，低分化的胃癌细胞株有 明显的转移能力。郭源等 的研究结果发现 MMP一7 的mRNA表达与肿瘤浸润深度呈正相关，同时MMP一 7的表达量在肿瘤Ⅲ、Ⅳ期比 I、Ⅱ期高。分析认为浸 润性生长是恶性肿瘤的重要特征，MMP一7的高表达 可以导致 ECM降解加快，促进癌细胞浸润性生长，所 以 MMP一7过度表达与胃癌的浸润能力相关。在 胃 癌的发生发展过程中，出现癌基因的激活、抑癌基因的 缺失，肿瘤细胞信号传导的改变，引起 MMP一7基因 的转录、表达增高，从而导致细胞外基质降解，加速肿 维普资讯 http://www.cqvip.com 安徽医学 2007年第 28卷第 3期 瘤浸润性生长，所以 MMP一7的表达量在肿瘤 Ⅲ、Ⅳ 期比 I、Ⅱ期高。Yamashita等 J、Senota等 J、焦春宇 等 的研究均发现 胃癌组织中 MMP一7表达在有淋 巴结转移的病例明显高于无转移者，差异有显著性(P <0．05)。本研究结果在淋巴结转移方面之所以显示 不同结论，分析本组 30例病例，有淋巴结转移的 23 例，而无淋巴结转移的仅 7例，我们认为本组多为中晚 期胃癌，是淋巴结转移阴性病例较少导致结果偏差，因 为从数据上看它们之间有一定的差异，增加病例会增 大显著性。本研究重点检测了 MMP一7基因表达与 门静脉血和腹腔转移的关系，结果显示 MMP一7基因 表达与门静脉血转移密相关(P<0．001)而与腹腔转 移不相关(P>0．05)。新生的毛细血管在肿瘤组织中 的形成为肿瘤细胞进入血循环提供了人 口，在肿瘤血 管形成的起始阶段，内皮细胞受肿瘤源性血管生长因 子的刺激，迁移到肿瘤组织中，随后降解基底膜和周围 的 ECM。MMP和血清蛋白酶在内皮细胞的迁移过程 中起着关键的作用。MMP一7具有广泛的底物特异性 和强大的基质降解能力，从而在肿瘤血管生成的过程 中促进了内皮细胞的迁移，同时在内皮细胞中表达的 MMP一7的蛋白水解活性松散了血管的结构，从而使 肿瘤细胞更易浸润血管。可见，MMP一7表达阳性的 肿瘤患者其癌细胞更具血管侵袭性，促进了肿瘤的血 行转移。已有学者报道_8 随着浆膜浸润范围的扩大， 癌细胞从肿瘤上脱落的机会增大，更益于腹腔浸润，肿 瘤细胞从受浸润的浆膜脱落人腹腔为胃癌患者腹腔转 移的主要途径，陈峻青等 报道 胃癌患者其浆膜受侵 面积 >20 cm×20 cm，尤其 >30 cm×30 cm的腱状型 和多彩弥漫型，即可视为脱落癌细胞阳性病例。本组 研究结果显示 胃癌组织 MMP一7基因表达与浆膜浸 润范围不相关，我们推测这可能是 胃癌组织 MMP一7 基因表达与胃癌腹腔转移不相关的原因。 目前胃癌的诊断主要靠术前的胃镜病理检查，因 此在胃镜下取肿瘤标本时常规行 MMP一7 mRNA检 测，有利于了解胃癌的浸润和转移特征，以便采取相应 l79 的治疗，能提高疗效。对有 MMP一7表达的胃癌 患者术中应尽量切除原发病灶及周围可能浸润的组 织、彻底清扫转移的淋巴结是非常必要的，它可以在最 大程度上减少肿瘤负荷，对于这种病人我们认为术后 应尽早并定期给予全身化疗。另外对有 MMP一7表 达的胃癌患者，我们建议术中通过门静脉插管给予化 疗药物，也可能杀灭进入门静脉血的癌细胞，达到预防 和治疗胃癌血行转移的目的。 参 考 文 献 1 Kodera Y，Yamamura Y，Shimizu Y，et a1．Prognostic value of positive findings in patients with gastric carcinoma undergoing a potentially curative resection．Surgi Onco1．1999；72：60—65 2 Honda M，Mori M，Ueo H，et a1．matrix metalloproteinase一7 expression in gastric carcinoma．Gut，1996；39：444—448 3 杜月光 ，陈慰浙，陈 智，等．人胃癌组织中基质金属蛋白酶 一 7的基因表及意义 ．中国癌症杂志，2003；13(3)：201— 203 4 郭 源，万远廉 ，魏 群，等．基质金属蛋 白酶 一7基因在胃 癌中的表达．中华普通外科杂志，2000；15(2)：82—84 5 Yamashita K，Azumano I，Mmhi M，et a1．Expression and tissue localization of matrix metalloproteinase7(matrilysin)in human gastric can cinomas：implications for vessel inv—asion and me— tastasis．Int J Cancer(pred．Onco1)，1998；79(2)：187—194 6 Senota A，Itch F，Yamanoto H，et a1．Relation of matrilysin mes— senger RNA expression With invasive activity in human gastric cancel Clin Exp Metastasis，1908；16(4)：313—321 7 焦春宇，黄信孚，李吉友，等．基质金属蛋白酶 一7(MMP一7) 在胃癌中的表达意义 ．中国肿瘤临床 ，2003；30(9)：662— 664 8 kodera Y，Nakanishi H，Yamamura Y，et a1．Prognostic value and clinical implications of disseminated cancer cells in the per- itoneal cavity detected by reverse transeriptase polymerse chain reaction and cytology．Int J Cancer，1998；79(4)：429—433 9 陈峻青，齐春莲，单吉贤，等．胃癌浆膜的分型及其意义．中 华医学杂志，1986；66(12)：736—738 (2006—12—18收稿 2007-02—8修回) 维普资讯 http://www.cqvip.com