BMSCs种植双相复合支架修复兔关节软骨及软骨下骨缺损

中国修复重建外科杂志2010年1月第24卷第1期 ·87· 基金项目 ：国家自然科学基金资助项目（30973049）；国家重点基础研究发展计划（973）资助项目（2005CB623901） 作者单位 ：四川大学华西医院（成都，610041） 1 骨科，2 生物治疗国家重点实验室 • 干细胞与组织工程研究室，3 国家生物医学材料工程技术研 究中心 通讯作者 ：项舟，教授，博士导师，研究方向 ：软骨缺损的修复与重建，E-mail: xiangzhou15@hotmail.com • 干细胞与组织工程 • 种植双相复合支架修复兔关节软骨 及软骨下骨缺损 刘明 1 项舟 1，2 裴福兴 1 黄富国 1 岑石强 1 钟刚 1 范红松 3 肖玉梅 3 孙静 3 高宇 1 【摘 要】 目的 关节软骨的病变常伴有软骨下骨缺损，其修复重建一直是骨科难。探讨 BMSCs- 双相支架 复合物修复骨软骨缺损的可行性，比较其与植入单纯双相支架及动物自身修复效果的差别具有重要意义。 方法 以聚 乳酸 / 聚羟基乙酸共聚物（poly-lactic-co-glycolic acid，PLGA）、羟基磷灰石（hydroxyapatite，HA）为原料制备由软骨相和 骨相构成的三维支架，提取天然Ⅰ型胶原（collagen type Ⅰ，Col Ⅰ）涂于表面制成 PLGA-HA-Col Ⅰ双相支架。取新西兰 乳兔骨髓分离培养获得的第 2 代 BMSCs，以 1 × 106 个 /mL 接种于双相支架，扫描电镜观察支架结构和细胞分布。取 30 只 6 月龄新西兰大白兔，建立股骨远端关节面骨软骨缺损模型，随机均分为 3 组，A、B 组分别于缺损区植入单纯双相支架 和 BMSCs- 双相支架复合物，C 组作为空白对照组未植入支架材料。于术后 1、3、6、9 个月取材行大体及组织学观察，术 后 9 个月对 A、B 组标本行大体评分比较、micro CT 扫描定量分析及免疫组织化学染色观察。 结果 扫描电镜示双相 支架孔隙连通性好，软骨相和骨相孔径不同，BMSCs 在双相支架内生长良好。大体观察示术后 9 个月内 A 组关节表面逐 渐形成类软骨样组织，部分出现塌陷或不规则缺损 ；B 组关节面无塌陷或碎裂，新生组织质地更接近正常组织 ；C 组缺损 一直存在。大体评分显示 3 组修复效果比较差异均有统计学意义（P < 0.001），B 组优于 A 组，C 组最差。micro CT 扫描 示 A、B 组软骨下骨得到良好的修复重建，定量分析示 B 组骨组织体积分数、结构模型指数及骨小梁数目均高于 A 组，但 差异无统计学意义（P > 0.05）。组织学观察示术后 1 个月 A、B 组缺损区存在炎性反应 ；术后 3 个月新生组织长入 ；术后 6 个月支架完全降解，新生组织在植入物及缺损边缘爬行生长 ；术后 9 个月形成大量胶原纤维，表面多为纤维软骨。C 组 观察期内缺损持续存在。术后 9 个月免疫组织化学染色示 A、B 组标本缺损区 Col Ⅱ染色呈弱阳性，Col Ⅰ染色阳性。 结 论 PLGA-HA-Col Ⅰ双相支架具备较适宜的一体化修复骨软骨缺损的物理特性，接种 BMSCs 后整体修复效果更好。 【关键词】 组织工程 BMSCs 双相支架 骨软骨缺损 修复 兔 中图分类号 ： Q813 R681.8 文献标志码 ：A REPAIRING DEFECTS OF RABBIT ARTICULAR CARTILAGE AND SUBCHONDRAL BONE WITH BIPHASIC SCAFFOLD COMBINED BONE MARROW STROMAL STEM CELLS/LIU Ming1, XIANG Zhou1,2, PEI Fuxing1, HUANG Fuguo1, CEN Shiqiang1, ZHONG Gang1, FAN Hongsong3, XIAO Yumei3, SUN Jing3, GAO Yu1. 1Department of Orthopedics, 2Division of Stem Cell and Tissue Engineering, State Key Laboratory of Biotherapy, 3National Engineering Research Center for Biomaterials, West China Hospital, Sichuan University, Chengdu Sichuan, 610041, P.R.China. Corresponding author: XIANG Zhou, E-mail: xiangzhou15@hotmail.com 【Abstract】 Objective To explore the preparing methods in vitro and test the clinical applicability of implantation in vivo of bone marrow stromal stem cells (BMSCs)-biphasic scaffold to repair defects of cartilage and subchondral bone and to compare the differences in repaired outcomes of composite, single biphasic scaffold and rabbits themselves. Methods The upper chondral phase and the lower osseous phase of the plugs, using poly-lactic-co-glycolic acid (PLGA), hydroxyapatite (HA), and other biomaterials, were fused into carrier scaffold, on which collagen type I (Col I) was coated. The surface and inner structure of biphasic scaffold were observed under scanning electron microscope (SEM). BMSCs was isolated from the bone marrow of tibia and femurs of young New Zealand rabbits using centrifuging and washing, and their morphologies and adherences were observed everyday. Then BMSCs were inoculated on the surface of scaffold to form BMSCs-scaffold composites. Osteochondral defects were surgically created on articular surface of femoral intercondyles of 30 New Zealand BMSCs Chinese Journal of Reparative and Reconstructive Surgery, January 2010, Vol. 24, No.1·88· 外伤或炎症等原因造成的关节软骨缺损十分常 见，但其自身修复能力差，临床治疗效果均不尽如人 意。临床上认为关节软骨全层损伤后必然会进展成难 治性关节炎 [1]，最终面临全关节置换术的治疗 [2]。近 年来，软骨组织工程作为研究焦点，正日益受到科研工 作者和临床医生的广泛关注。大量研究表明，BMSCs 是一种良好的组织工程种子细胞 ；且多个动物实验证 明它可联合多种支架材料治疗软骨缺损 [3-8]。但如何 进一步促进或控制 BMSCs 向软骨细胞或成骨细胞方 向分化，仍是目前骨软骨组织工程领域有待解决的问 题之一。根据既往研究和目前已有的动物实验可知 [9]， 修复软骨的同时修复软骨下骨，可以较好地模拟软骨 修复的微环境，从而获得相对理想的修复效果。 我们的实验综合天然材料与人工合成高分子材 料的优点，制作新型双相复合支架材料（双相支架），体 外构建 BMSCs- 双相支架复合物，再将其与单纯双相 支架分别植入膝关节骨软骨缺损动物模型，观察二者 在骨软骨修复过程中的差异，旨在为临床寻找一种可 行且有效的一体化修复软骨及软骨下骨缺损的治疗 方 法。 1 材料与方法 1.1 实验动物及主要试剂、仪器 1.5 周龄新西兰乳兔 2 只，雌雄不限，平均体重 100 g ；6 月龄健康新西兰大白兔 30 只，雌雄不限，体 重 1.4 ～ 1.7 kg ；均由四川大学华西医院动物实验中心 提 供。 聚乳酸 /聚羟基乙酸聚合物（poly-lactic-co-glycolic acid，PLGA，聚乳酸与聚羟基乙酸质量比为 75 ∶ 25， 相对分子质量为 200 × 103）、羟基磷灰石（hydroxyapa- tite，HA）、NaCl 晶体（济南岱罡生物科技有限公司）； DMEM/F12 培养基、L-DMEM 培养基（GIBCO 公司， 美国）；FBS（HyClone 公司，美国）；胰蛋白酶、Ⅰ型胶 原酶、鼠抗兔Ⅰ型胶原（collagen type Ⅰ，Col Ⅰ）单克 隆抗体（Sigma 公司，美国）；EDTA（上海试剂三 厂）； 鼠抗兔 Col Ⅱ单克隆抗体（Calbiochem 公司，美国）； 免疫组织化学试剂盒（北京中山生物技术有限公司）； 兔 BMSCs 分离液 1.090（天津灏洋生物制品科技公司）。 扫描电镜（日本电子株式会社）；micro CT 及 uCT80 图 像分析处理软件（Scanco Medical 公司，瑞士）。 1.2 BMSCs 的分离、培养 取 1.5 周龄新西兰乳兔 2 只，空气栓塞法处死后取 胫骨、股骨，提取全部骨髓抽吸物，经密度梯度离心法 收集其中的 BMSCs 制成单细胞悬液。取 1 滴于细胞 计数板上行细胞计数，以（5 ～ 10）× 105 个 / 瓶接种于 2 个 25 mL 培养瓶培养。当细胞生长至 90% ～ 100% rabbits, which were divided into groups A, B and C. In group A, a biphasic osteochondral composite were implanted into defect, BMSCs and biphasic cylindrical porous plug of PLGA-HA-Col I in group B, and group C was used as a control without implant. Specimens were harvested to make macroscopic and histological observations at the 1st, 3rd, 6th, and 9th months after operation respectively; meanwhile immunohistological and micro-computed tomography (micro CT) examinations were performed and graded at the 9th month after operation. Results SEM showed an excellent connection of holes in the biphasic scaffold infi ltrated by Col I. Optical microscopy and SEM showed a good growth of BMSCs in scaffold without obvious cellular morphological changes and an accumulation in the holes. Macroscopic samples showed a resistant existence of defects of group C within 9 months; the scaffold completely degenerated and chondral-like tissue formed on articular surface with partly collapses and irregular defects in group A; and smoother surface without collapses and approach to normal with texture of new regeneration in group B. There were statistically signifi cant differences in macroscopic results (P < 0.001), group B was superior to group A, and group C was the worst. The micro CT showed good repairs and reconstruction of subchondral bone, with a acceptable integration with newborn chondral-like tissue and host bone in group B. Quantifi cational analysis of relevant parameters showed no signifi cant differences. Histological results showed infl ammations located in defects at the 1st month, new tissue grew into scaffold at the 3rd month; new chondral-like tissue crept on the margin of defects and biphasic scaffold degenerated completely at the 6th month, and lots of collagen formed in subchondral bone with major fi brocartilage on chondral area at the 9th month after surgery in groups A and B. In groups A and B, immunohistological observations were weak positive for Col II and positive for Col I. Conclusion Biphasic scaffold implanted in body can induce and accelerate repair of defects of articular cartilages which are mainly fi lled with fi brocartilage, especially for subchondral bone. Scaffold combined with BMSCs has the best repairing effects 9 months after implantation. 【Key words】 Tissue engineering Bone marrow stromal stem cells Biphasic scaffold Osteochondral defect Repair Rabbit Foundation items: National Natural Science Foundation of China (30973049); National Basic Science Research and Development Grants (2005CB623901) 中国修复重建外科杂志2010年1月第24卷第1期 ·89· 融合时，以 0.25% 胰蛋白酶消化，按 1 ∶ 2 传代。取第 2 代细胞备用。 1.3 双相支架的制备 取 20 g PLGA 溶解于 50 mL 丙酮，以质量比为 15 ∶ 85 加粒径 100 ～ 300 μm 的 NaCl 晶体造孔后，置 入 6孔板孔内，稍加挤压成型，即为双相支架的软骨相， 厚度约 1 mm。另取 PLGA 和 HA 以质量比 1 ∶ 1 混 合，同法以粒径 300 ～ 500 μm NaCl 晶体造孔，铸入模 具中软骨相的上部，制成骨相，厚度约 2 mm，以 AgNO3 溶液除尽 NaCl，小圆刀片将模型支架切分成 4 mm × 4 mm × 3 mm 的长方体结构备用。以牛皮为原料采用 稀酸萃取法制得可溶性海绵状 Col Ⅰ，将其均匀涂层 于双相支架表面，即形成 PLGA-HA-Col Ⅰ双相支架， 扫描电镜观察双相支架的孔隙分布、孔隙内部连通性 和孔径大小。随机选取 10 块支架，分别放入盛有无水 乙醇的试管中，以无水乙醇为置换液体，采用液体置 换法测试支架材料的孔隙率，每块支架测量 3 次，取平 均 值。 1.4 BMSCs- 双相支架复合物的制备 在无菌 24 孔板内滴加 3 ～ 5 mL 含 10%FBS 的 L-DMEM 培养液，将双相支架材料放入孔板内浸渍预 湿。取第 2 代兔 BMSCs，以密度为 1 × 106 个 /mL，采 用巴氏管悬滴法接种于置有双相支架材料的经预湿处 理的 6 孔板中，培养 7 d 后备用。扫描电镜细胞在 双相支架上的分布情况。 1.5 软骨及软骨下骨缺损模型的建立及分组 取 6 月龄健康新西兰大白兔 30 只，手术前 30 min 肌肉注射抗生素。称重后以戊巴比妥腹腔麻醉，沿单 侧膝部髌骨内侧缘行 2.5 cm 纵形切口，将髌骨牵向外 侧，用小骨凿在股骨内外侧髁间关节面中部作一深约 3 mm 的骨软骨缺损，缺损范围为 4 mm × 4 mm。将动 物随机分为 3 组，每组 10 只。A、B 组分别于缺损区植 入单纯双相支架及 BMSCs- 双相支架复合物，植入后 材料与周围正常软骨不作缝合 ；C 组作为空白对照，未 植入材料。修复关节囊，保证髌骨在正常解剖位置，关 闭切口。术后动物单笼饲养，不行术肢外固定，自由活 动、取食 ；术后第 2 天使用抗生素，观察动物大小便，防 止腹泻及其他传染性疾病。 1.6 检测指标 1.6.1 一般情况 术后 9 个月内观察动物的感染、腹 泻情况，活动状况，膝关节功能等，如出现死亡则记录 死亡原因。 1.6.2 大体观察 使用耳缘静脉空气栓塞法，术后 1、 3、6个月每组处死 1只动物，术后 9个月处死剩余动物。 剖开关节腔，显露髌股关节面，取新鲜标本，观察关节 软骨缺损部位的大体愈合情况。按大体评分 [10] 评价各组术后 9 个月时的修复效果。 1.6.3 micro CT 扫描观察 对术后 9 个月 A、B 组标 本大体观察后行 micro CT 扫描。层距 18 μm，高分辨 率（1 026 μm × 1 026 μm × 604 μm），连续扫描 223 层， 约 4 mm（修复观察区范围），每个标本扫描 5 h，观察 修复组织的微观结构。然后以扫描区域关节面为起始， 截取高约 3 mm 三维重建图像，将其输入 uCT80 图像 分析处理软件，计算机自动生成每个标本观察区的相 应数据，包括骨组织体积分数（trabecular bone volume， BV/TV）、结构模型指数（structure model index，SMI）、 骨小梁数目（trabecular number，Tb.N.）。 1.6.4 组织学观察 取上述各时间点各组标本，4% 多 聚甲醛固定、40% 甲酸脱钙后，常规石蜡包埋，5 μm 厚 度切片，行番红 O、HE、甲苯胺蓝及 Masson 三色法染 色，观察新生软骨细胞、成骨细胞形态及分布，胶原纤 维合成及关节软骨细胞特异细胞外基质的产生与合成 情 况。 1.6.5 免疫组织化学染色 取术后 9 个月 A、B 组标 本切片，固定、漂洗后加正常马血清（1∶ 20）封闭切片， 乙醇逐级脱水，透明、浸蜡、石蜡包埋，5 μm 厚连续切 片，SP 法免疫组织化学染色。镜下观察分化细胞分泌 Col Ⅰ和 Col Ⅱ的情况。 1.7 统计学方法 采用 SPSS13.0 统计软件包进行分析。数据以均 数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，P值< 0.05 为有统计学意义。 2 结果 2.1 双相支架扫描电镜观察 双相支架为疏松多孔材料，软骨相与骨相结合紧 密（图 1）。支架内部孔隙连通性良好，软骨相孔径为 100 ～ 300 μm，骨相孔径为 300 ～ 500 μm，双层支架 为孔孔相通的蜂窝样多孔结构。经液体置换法测定， 支架材料孔隙率为 83.15% ± 3.44%。扫描电镜观察示 BMSCs在双相支架中呈圆形或梭形，细胞间密切接触， 在孔隙中有大量聚集分布的倾向，孔隙深处亦有细胞 分布（图 2）。 2.2 一般情况 术后9个月内有4只动物死亡，其中A组术后3周、 B 组术后 1 个月分别因感染死亡 1 只，A 组术后 1 周、 B 组术后 6 个月分别因腹泻死亡 1 只。术后当天 A、B 组动物术肢膝关节即能接近正常主动屈伸活动，术后 2 个月 C 组动物术肢基本恢复正常功能。 2.3 大体观察 Chinese Journal of Reparative and Reconstructive Surgery, January 2010, Vol. 24, No.1·90· 术后 1 个月，A、B 组标本外观无差异，材料与周 围宿主软骨间的界限分明，材料表面无软骨样组织形 成 ；C 组标本缺损处清晰。术后 3 个月，A、B 组标本 缺损中心及缺损边缘外观无明显差别，材料与周围宿 主软骨间的界限比较分明，关节修复部位表面已出现 黄白色新生组织，A、B 组支架与周围软骨组织有较明 显差异 ；C 组标本缺损处可见少许软骨下骨修复，其内 有少量炎性肉芽样组织。术后 6 个月，A、B 组标本关 节缺损修补部位支架材料完全降解，两组支架与宿主 软骨部分愈合，新生组织具有青白色光泽，质地韧，外 观类似宿主软骨组织，但 A 组修复区有不规则缺损，关 节面平整度稍差，B 组无缺损区，关节面更平整 ；C 组 标本软骨下骨修复开始出现钙化，缺损边缘向缺损内 部塌陷、卷曲，高度降低，缺损面积增大。术后 9 个月， 3 组标本关节囊愈合良好，未见关节腔粘连和髌骨脱 位。A 组标本关节表面形成类软骨样组织，但缺乏正 常关节软骨的半透明特性，有 2 个标本出现塌陷或缺 损 ；B 组标本修复部位关节平滑，缺损区与宿主区的边 界完全消失，新生软骨样组织质地与正常软骨无明显 差异 ；C 组标本缺损范围不同程度缩小，仍未见有软骨 样组织形成（图 3）。 术后 9 个月各组标本大体评分结果见表 1。3 组 标本的新生软骨覆盖面积（占软骨缺损面积的百分比） 评分、新生软骨色泽评分、缺损边缘情况（占软骨缺损 周径的百分比）评分、表面光滑度评分及总体评分比较 差异均有统计学意义（P < 0.001），总体修复效果 B 组 优于 A 组，C 组最差。 2.4 micro CT 扫描观察 micro CT 扫描观察可见，术后 9 个月 A、B 组缺损 区均有大量新生骨小梁形成，并与宿主骨形成了较好 的整合。B 组标本软骨下骨区域有较为连续的骨小梁 形成，A 组该处骨小梁中断或正在形成。图像分析显 示，A组BV/TV、SMI、Tb.N.分别为 0.32 ± 0.08、—0.14 ± 0.33、1.12 ± 0.18，B 组分别为 0.33 ± 0.75、0.06 ± 0.24、 1.19 ± 0.06，B 组均高于 A 组，具有一定临床差异，但两 组比较差异无统计学意义（P > 0.05）。 2.5 组织学观察 组织学观察示 C 组标本术后 9 个月内缺损持续 存在（图 4 a）。A、B 组术后 1 个月，关节缺损修复部 位植入物边缘与软骨组织形成疏松连接，支架材料部 分降解，有死骨伴炎性细胞出现，植入体与宿主组织之 间界面清晰（图 4 b）。术后 3 个月，关节修复部位界 面成移行状态，边界模糊，支架材料大量降解，有新生 骨样组织向材料骨相生长，死骨明显减少，无明显炎性 反应（图 4 c）。术后 6 个月，支架材料降解完全，修复 部位可见大量胶原结构无规律排列，形成均一整体，呈 现向骨组织转化的趋势 ；在缺损表面有部分类软骨组 织向缺损中央爬行生长（图 4 d）。术后 9 个月，两组 均显示较好的软骨下骨修复，部分标本切片可见新生 类软骨样组织，修复软骨主要是纤维软骨，以扁平细胞 为主，纤维结构疏松，呈层状排列，不具有正常软骨组 织的均一性和良好的透光性，有别于宿主呈圆球形态 和软骨 囊 结构的透明软骨及拱顶状排列的纤维结构 （图 4 e）。 2.6 免疫组织化学染色观察 免疫组织化学染色示，术后 9 个月 A、B 组标本缺 损区 Col Ⅱ染色呈弱阳性，Col Ⅰ染色阳性（图 5）。 3 讨论 关节软骨位于活动关节的表面，是一种复杂的复 表 1 术后 9 个月 3 组软骨缺损修复标本大体评分（x ± s） Tab.1 Repair tissue scores of gross samples in three groups 9 months after operation（x ± s） 组别 Group 样本数 n 新生软骨覆盖面积 New cartilage coverage 新生软骨色泽 New cartilage color 缺损边缘情况 Defect margin 表面光滑度 Surface smoothness 总体评分 Total score A 5 2.800 ± 0.447# △ 3.250 ± 0.447# △ 3.840 ± 0.375# △ 2.670 ± 0.985# △ 12.200 ± 1.095# △ B 5 3.400 ± 0.548* △ 3.250 ± 0.447* △ 4.000 ± 0.000* △ 3.670 ± 0.485* △ 14.200 ± 0.447* △ C 7 2.290 ± 0.488*# 1.830 ± 0.389*# 2.900 ± 0.308*# 1.830 ± 0.389*# 8.570 ± 0.976*# * 与 A 组比较 P 值 < 0.001，# 与 B 组比较 P 值 < 0.001，△与 C 组比较 P 值 < 0.001 * Compared with group A, P < 0.001; #compared with group B, P < 0.001; △ compared with group C, P < 0.001 中国修复重建外科杂志2010年1月第24卷第1期 ·91· 合生物结构，在负荷的传导和吸收方面发挥重要作用。 在软骨损伤的修复中，维持填入材料与损伤处的机械 整合是影响功能及结构修复的重要因素 [11]。 3.1 PLGA-HA-Col Ⅰ双相支架材料在骨软骨缺损修 复中的优势 PLGA 具有良好的生物学性能及可调控的物理、化 学及生物学特性，是迄今研究最广泛、应用最多的组织 工程支架材料 [12-13]。而其作为一种人工合成高分子材 料，仍存在一些不足 [14]，如力学强度、体内安全性、细胞 亲和性、生物相容性及生物专一性不够理想等。HA 在 一定的体内环境下可诱导成骨反应，减轻 PLGA 酸性 降解产物对体内微环境的影响，并可均匀黏附和包埋 细胞，利于软骨修复的同时提供早期的机械支撑。而 胶原具有良好的亲水性和生物相容性，可为细胞提供 支持保护作用，并利于细胞的黏附、生长，减少细胞在 支架上的流失 [15]。扫描电镜观察支架微结构显示，双 相支架拥有与正常松质骨类似的物理结构特性，由此 推测，该材料植入受试动物体内后，利于恢复软骨组织 内部的正常力学环境，并利于软骨及软骨下骨的修复。 因此，本实验在 PLGA 基础上加入了 HA 和天然 Col Ⅰ，以便将各种支架材料进行优势互补，并设计成 由软骨相和骨相构成的三维立体结构。目前，许多研 究已证实 [11，14，16]，组织工程支架的不同孔径有利于多 向分化干细胞向不同方向生长、转化。Karageorgiou 等 [16] 经实验发现，> 300 μm 的支架孔径最有利于 BM SCs 的成骨分化，Kuboki 等 [14] 将混合 BMP 的 HA 制成不同孔径的蜂窝状圆柱体植入裸鼠背部皮下，术 后 2 周小孔径（90 ～ 120 μm）的支架表面有成软骨反 应，而大孔径（350 μm）部分未出现成软骨反应，而是 直接成骨反应。故我们将支架材料设计为软骨相不含 Chinese Journal of Reparative and Reconstructive Surgery, January 2010, Vol. 24, No.1·92· HA、支架孔径为 100 ～ 300 μm，骨相含有 HA、支架孔 径为 300 ～ 500 μm，分别对应兔膝关节的软骨及软骨 下骨，以利于 BMSCs 在不同的微环境中分别向软骨及 骨细胞方向分化。 3.2 各组间对缺损模型修复的效果分析 术后 9 个月内观察 3 组大体标本发现，C 组缺损 一直存在，表明机体对较大范围骨软骨缺损的自体修 复能力相当有限。术后 9 个月，A 组支架完全降解，关 节表面形成类软骨样组织，但其缺乏半透明特性，且部 分出现塌陷或不规则缺损。可能的原因包括 ：机体修 复细胞沿双相支架三维爬行、生长并修复缺损，加快了 修复速度 ；但因自体修复细胞的爬行能力有限，仍有部 分缺损难以得到完整修复，导致修复组织的力学强度 和结构稳定性不足。B 组标本新生软骨样组织质地更 接近正常组织，由此推断，BMSCs 在机体自身修复细 胞难以到达部位（如缺损中央区）发挥着重要作用，支 架上种植 BMSCs 保证了组织修复的完整性和均衡性， 减少了远期并发症的发生 ；因此我们认为，该方案拥有 更稳定的功能维持状态及更理想的临床应用前景。 在检测活体骨的力学性能方面，micro CT 因其各 项指标与骨的力学指标呈高度相关性 [17-18]，且易于算 出 BV/TV[19-21]，被认为是一种优于双能 X 线吸收测量 法 [22-23]、快速且不损伤样本内部结构的有效检查方法， 近年来在微小标本骨的结构、力学分析及组织水平上 的应用尤其具有显著优势 [24-25]。测定结果显示，B 组 各参数均大于 A 组，表明在相同实验期内，BMSCs 使 得更多的骨矿物质沉积于修复组织内部，骨小梁的排 列更趋近于正常骨的板状排列，据此推断其承受应力 的能力及弹性功能均优于 A 组。且 B 组修复组织的微 结构参数较 A 组更接近生理状态下的松质骨，各样本 修复组织间的差距更小，均衡性和稳定性更高，虽然结 果不具有统计学意义（可能与样本量较少有关），但具有 临床意义。我们推测其原因可能为双相支架结构接近 生理状态下松质骨的微结构，使得在缺损修复初期，自 体修复细胞得以依附该立体结构修复缺损。而由于机 体自身修复细胞有限的爬行能力，极大地限制了缺损 中心的修复。因此，从修复组织的均衡性和整体性来 讲，A 组微观下的力学性能指标不及 B 组理想。 双相支架具有良好的黏附性及可塑性，可理想地 贴合术中骨软骨缺损区的大小及形状，并且综合了多 种组织工程材料的优势，为修复过程提供了类似于体 内的微环境。BMSCs具有较强的分化潜能和增殖能力， 其来源、分离方法及分化组织类型等方面对治疗软骨 及软骨下骨缺损均有独特优势 [26]。本实验将 BMSCs 复合于 PLGA-HA-Col Ⅰ双相支架材料上，植入受试动 物体内修复软骨及软骨下骨缺损，取得了满意效果，但 其远期效果尚需长期的观察及临床试验验证。 4 参考文献 1 Strauss EJ, Goodrich LR, Chen CT, et al. 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