基因芯片论文：3种检疫性黄单胞菌的基因芯片检测

3种检疫性黄单胞菌的基因芯片检测 龙 海 1, 2 � 李一农 1* � 李芳荣 1 ( 1.深圳出入境检验检疫局 � 广东深圳 � 518001; 2.深圳市检验检疫科学研究院 ) 基金项目:深圳出入境检验检疫局博士基金项目 ( SZ2007101 ) 通讯作者: E - m a i:l li_y inong@ 126. com 收稿日期: 2010- 03- 24 Detection of three quarantineXanthom onas by gene chip. Long Ha i 1, 2 , L iY inong 1* , L i Fangrong 1 ( 1. Shenz� hen Entry- Ex it Inspection andQuarantine Bureau, Shenzhen 518001, China; 2. ShenzhenAcademy of Inspection and Quarantine) Abstract� A specific gene chipmethod w as deve loped to detectXanthomonas oryzae pv. oryzae ( Xoo)、X. oryzae pv. oryzicola (Xooc) andX. axonopod is pv. citri ( Xac) . The RNA po lymerase sigma factor ( rpoD ) w as se lected to design un iversa l primers and species- specific probesw hich can simu ltaneously detect three bacteria. The results suggested that detection o f three bacteria mentioned above by gene chip is an effect ive procedure w ith h igh speci� f icity. The gene ch ip method deve loped here prov ides idea lmeans to detect ion of plant bacteria and w ill be used w ide ly. Key words� Xanthomonas; gene ch ip; detection 摘要 � 本研究建立了基因芯片检测我国检疫性细菌水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌和柑桔溃 疡病菌。以 RNA多聚酶西格玛因子 ( RNA po lymerase sigma factor, rp oD )基因为靶标, 设计了一对通用引物 和 3条特异性探针能够同时检测这 3种重要的病原菌。检测结果表明: 建立的基因芯片检测方法特异性 强,能实现上述 3种黄单胞菌的准确检测,为植物致病菌的检测提供了理想手段, 有良好的应用前景。 关键词 � 黄单胞菌;基因芯片;检测 中图分类号 � Q7, S41- 30 � � 黄单胞菌属 (Xanthomonas)的菌致病性多样, 许多种类都对农业生产造成巨大危害。黄单胞菌 属包含了 20个种, 70个分类地位已经确定的致病 变种和 70个分类地位尚不确定的致病变种 [ 1]。现 行的�中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名 录 中就收录了 14个黄单胞菌的种或致病变种。 水稻白叶枯病菌 ( Xanthomonas oryzae pv. oryzae, Xoo)和水稻细菌性条斑病菌 (X. oryzae pv. oryz icola, Xooc)是黄单胞菌属水稻黄单胞菌的不 同致病变种, 二者都是水稻上重要的细菌性病害。 水稻白叶枯病菌可造成水稻减产 10% ~ 30% ,严 重时可达 50%以上。水稻细菌性条斑病菌可造成 水稻减产 5% ~ 10% ,严重时可达 20% [ 2]。柑桔溃 疡病菌 (X. axonopodis pv. citri, Xac)能够侵染为害 绝大多数柑桔栽培品种,是影响全球柑桔种植业发 展的重大检疫性病菌 [ 3]。这 3种病菌都是我国重 要的检疫性细菌。 目前,已经有许多关于黄单胞菌检测的报道, 例如普通 PCR[ 4] , 双重 PCR [ 5] , 实时荧光 PCR [ 2]和 滚环扩增 [ 3]等。这些方法存在易污染、检测通量低 等缺陷。基因芯片技术可以对多种靶基因同时检 测和鉴定, 以其快速、高通量、平行化等优势得到 广泛的应用 [ 6]。本研究利用基因芯片技术, 同时对 水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌和柑桔溃疡 病菌进行检测鉴定,希望能为植物病原细菌检测技 术的进一步发展提供参考,为农业和植物检疫部门 提供技术储备。 1� 材料与方法 1. 1� 供试菌株 见表 1。 1. 2� 试剂和仪器 溶菌酶、TE、SDS、SSC、SSPE、灭菌 ddH 2O、苯 酚、氯仿、乙醇、DMSO、N aBH4, 以上几种试剂购自 上海生物技术工程有限公司; 10 ! Buffer ( M g2+ ∀9∀ 2010年第 5期 植物检疫 PLANT QUARANT INE V o.l 24 No. 5 free)、MgC l2、Taq酶、以上几种试剂购自大连宝生 物; Cy5- dNTPs( Am ersham B iosciences) ; 基片 (北 京博奥生物有限公司 ); 芯片点样仪 (德国 GeS im 公司 ) ; 激光共聚焦扫描仪 GenePix 4200A (美国 Axon公司 ) ; PCR仪 (德国 B iom etra公司 )。 表 1� 本研究所用细菌菌株 菌株 � � � � � � � � � � 编号 来源 � � � X anthom onas oryzae pv. oryzae Xoo1 南京农业大学 X. oryzae pv. oryzae Xoo2 南京农业大学 X. oryzae pv. oryza e Xoo3 中国检验检疫科学研究院 X. oryzae pv. oryzicola Xooc1 南京农业大学 X. oryzae pv. oryzicola Xooc2 南京农业大学 X. oryzae pv. oryzicola Xooc3 中国检验检疫科学研究院 X. axonopodis pv. citri Xac1 南京农业大学 X. axonopodis pv. citri Xac2 中国检验检疫科学研究院 P antoea stew arti i sub sp. stew artii Pnss1 深圳出入境检验检疫局动植中心 A cid ovorax avena e pv. avenae 470101 中国农业大学种子健康检测中心 A. avenae pv. citru lli 470121 中国农业大学种子健康检测中心 Burkholderia g lad ioli pv. alliicola 470201 中国农业大学种子健康检测中心 C lav iba cter m ich iganensis pv. m ich iganensis 470301 中国农业大学种子健康检测中心 C. m ich iganensis pv. nebrasken sis 470321 中国农业大学种子健康检测中心 C. m ich iganensis pv. seped onicum 470331 中国农业大学种子健康检测中心 P seudomona s syringae pv. phaseolicola 470501 中国农业大学种子健康检测中心 1. 3� 基因组 DNA的提取 根据文献 [ 6]的方法进行细菌基因组 DNA的 提取。 ( 1) 1. 5 mL菌液, 室温 13000 r /m in离心 5 m in, 去上清; ( 2)取沉淀加浓度为 50 g /L的溶菌酶 100 �L, 悬浮菌液, 37 # , 放置 2 h; ( 3 )加入 TE 385 �L, 20% SDS 15 �L, 煮沸 10 m in; ( 4)用等体 积的苯酚、氯仿抽提, 充分振荡混匀, 4 # 13000 r/ m in离心 5m in,将上清液移至灭菌离心管; ( 5)加 1 mL冰无水乙醇, - 20 # 放置 30 m in以上, 沉淀 DNA; ( 6) 4 # 13000 r/m in离心 10 m in, 弃上清, 冰无水乙醇洗涤 1次, 75%乙醇洗涤 2次, 溶解于 100 �L灭菌 ddH2O, - 20 # 保存备用。 1. 4� 引物和探针的设计与合成 从 NCB I( http: / /www. ncb i . nlm. n ih. gov) GenBank数据库中获取黄单胞菌 RNA多聚酶西格 玛因子 ( RNA polymerase sigma factor, rpoD )基因序 列。用 primer 5软件对序列进行比对分析,选择相 对保守的区域设计通用引物,在引物的扩增区间找 到适于设计探针的所有片段, 将候选序列递交到 GenBank进行 B last比对分析, 选择理论上特异性 较好的探针。质控探针包括阳性定位点探针和阴 性质控探针 [ 7] , 均与黄单胞菌 rpoD 基因序列无同 源性的寡核苷酸片段。阳性定位点探针通过和荧 光标记的互补链杂交显示信号, 用于确定基因芯片 点样阵列的位置和杂交过程的质控。检测阳性定 位点探针的是 Cy5标记的互补链。阴性质控探针 用于基因芯片非特异性杂交背景的质控。检测引 物和探针的合成、修饰及标记由上海超世生物技术 有限公司完成 (见表 2)。 表 2� 引物和探针序列 名称 靶基因 序列 ( 5∃- 3∃) 长度 ( n t) 附加说明 引物 X rpoD- F rpoD CGGCTTCAACGACCTGATY 19 黄单胞菌通用正向引物 X rpoD- R rpoD GAYCTTCTTGAACTTGGCGTAT 22 黄单胞菌通用反向引物 探针 Xo- S1 rpoD NH2 - TTTTTTTTTTGAGGATGCGCTGGATGAAG 29 Xoo特异性探针 Xoo- S1 rpoD NH2 - TTTTTTTTTTGAGGATGCGGTGGATGAAG 29 Xooc特异性探针 ∀10∀ 2010年第 5期 植物检疫 PLANT QUARANT INE V o.l 24 No. 5 (续表 2) 名称 靶基因 序列 ( 5% - 3% ) 长度 ( n t) 附加说明 Xac- A1 rpoD NH2 - TTTTTTTTTTGACACGGCGACCGGAC 26 Xac特异性探针 Pos- cka NH2 - TTTTTTTTTTGGGTGGGATCAATTTGG 27 阳性定位点探针 An tiPos- ckb Cy5- CCAAATTGATCCCACCC 17 检测阳性定位点探针的互补链 Neg- CK c NH2 - TTTTTTTTTTCTGGAACAGCCAGAAGGAC 29 阴性质控探针 注: a, b, c的序列来自文献 [ 7 ]. 1. 5� 制备芯片 芯片基片选择晶芯光学级醛基基片。探针用 TE缓冲液 ( pH 8. 0)稀释至终浓度 40�mol/L, 将 10�L 50% DMSO加入 384孔板中,再加入等量的 探针溶液,轻轻混匀,并按预先设计的探针顺序 (见 图 1) ,用芯片点样仪将探针点至基片上。点样后 的基片于 37 # 、100%湿度下放置 12 h ,用 0. 2% SDS溶液漂洗 5m in;去离子水分别漂洗 3次, 每次 2 m in;再将基片放入 0. 2% NaBH4封闭液中漂洗 15m in,前 5m in搅拌, 中间 5m in静置,后 5m in搅 拌;去离子水漂洗 3次, 每次 2m in; 2 000 r/m in室 温离心 2m in, 4 # 避光保存。用激光共聚焦扫描 仪对基片进行预扫描质检。 在每张基片上分别有 4个相同矩阵, 每个矩阵 共 4行 11列, 第 1行和第 1列为阳性定位点探针; 第 4行除第 1列为阳性定位点探针,其余均为空白 对照;其他探针设 5个重复。各探针的具体说明见 图 1。 Pos- ck Pos- ck Pos- ck Pos- ck Pos- ck Pos- ck Pos- ck Pos- ck Pos- ck Pos- ck Pos- ck Pos- ck Xo- S1 Xo- S1 Xo- S1 Xo- S1 Xo- S1 Xoo- S1 Xoo- S1 Xoo- S1 Xoo- S1 Xoo- S1 Pos- ck Neg- CK Neg- CK Neg- CK Neg- CK Neg- CK Xac- A1 Xac- A1 Xac- A1 Xac- A1 Xac- A1 Pos- ck 空白对照 空白对照 空白对照 空白对照 空白对照 空白对照 空白对照 空白对照 空白对照 空白对照 图 1� 黄单胞菌基因芯片检测探针排布图 1. 6� 靶基因片段荧光标记 PCR扩增 基因芯片检测荧光标记 PCR反应体系: 0. 25 mmo l /L的 10 ! Buffer (M g2 + free)、2. 0 mmo l /L M gC l2、0. 2mmo l/L的 Cy5 - dNTPs、正向引物和反 向引物各 0. 2�mol/L、1 U Taq酶、模板 DNA为 10 ~ 20 ng,总体积 25�L。 荧光标记 PCR扩增在 T3 PCR仪上进行, 扩增 条件为: 94# 5 m in; 94# 30 s, 60# 30 s, 72# 30 s,共 30个循环; 72# 10m in。 1. 7� 杂交及扫描 分别取杂交液 7�L( 2% SDS和 5% SSPE等体 积混合 )、PCR标记产物 6�L 和定位点探针 1�L, 混匀后 95 # 变性 5 m in, 立即于冰水中放置 5 m in。 将变性后的混合物加入芯片点样区, 盖上盖玻片置 于湿盒中 50 # 避光杂交 3 h。杂交后的芯片依次 在洗液 & ( 0. 3 ! SSC , 0. 2 % SDS ) 和洗液 ∋ ( 0. 06 ! SSC) 中各清洗 2m in, 室温 2 000 r/m in离 心 2 m in。芯片用激光共聚焦扫描仪扫描, 图像用 GeneP ix 5. 0软件分析。 2� 结果与分析 2. 1� 荧光标记 PCR扩增及特异性 以供试菌株 DNA为模板, 用通用引物 X rpoD - F /XrpoD- R进行荧光标记 PCR扩增, 电泳结果 表明只有 Xoo、Xooc和 Xac等 3种黄单胞菌出现目 标片段,大小为 220 bp,其他供试菌株和阴性对照 都没有扩增产物 (图 2)。 图 2� 引物 X rpoD - F /X rpoD- R扩增供 试菌株电泳图 1. Xoo; 2. Xooc; 3. X ac; 4. P. stew artii subsp. stew artii; 5. A. avena e pv. avena e; 6. A. avenae pv. citru lli; 7. B. g lad ioli pv. a lliicola; 8. C. m ich iganensis pv. m ich igan en sis; 9. C. m ichiganen sis pv. nebrasken sis; 10. C. m ich iganensis pv. seped onicum; 11. P. syringa e pv. pha seolico� la; 12. 阴性对照; M. DL 2000M ark er. 2. 2� 3种黄单胞菌的杂交结果 将荧光标记 PCR扩增产物与基因芯片上的探 针进行杂交, 杂交结果见图 3,由 A~ C可知: 3种目 标菌在阳性定位点探针的位置上出现荧光信号, 说 明杂交是成功的; 3种目标菌在各自的特异性探针 的位置上出现阳性荧光信号, 而其他细菌均为阴 性,表明该芯片可以准确地检测出目标病菌。D为 ∀11∀ 2010年第 5期 植物检疫 PLANT QUARANT INE V o.l 24 No. 5 3种目标菌的 DNA等量混合后, 经过荧光标记 PCR 扩增后,其产物与基因芯片上的探针进行杂交的结 果。杂交结果表明可以同时检测 3种目标黄单 胞菌。 A � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � B C� � � � � � � � � � � � � � � � � � � � D 图 3� 基因芯片特异性实验结果 � A. X. oryzae pv. oryza e, Xoo; B. X. oryza e pv. oryz icola, Xooc; C. X. axonopod is pv. ci tri, Xac; D. Xoo、Xooc and Xac 3� 讨论 16S rDNA、23S rRNA和 16S ~ 23S rRNA间区 等在植物病原细菌的分子诊断中, 常被选做靶基 因。但是研究发现, Xoo和 Xooc的这些基因完全 相同,无法作为靶基因设计特异性引物和探针。而 黄单胞菌的 rpoD基因序列之间存在差异, 可以作 为靶基因设计引物和探针来检测不同的黄单胞菌。 本研究建立的基因芯片检测方法能够同时检测和 区分 Xoo、Xooc和 Xac,是一种简单、灵敏、可靠的基 因鉴别诊断方法。本研究在筛选探针时发现杂交 温度降低会增强探针信号, 但探针的特异性会降 低;杂交温度升高会降低探针信号, 但探针的特异 性会增强,所以建议设计探针时要考虑探针 Tm值 尽量高一些。本研究针对每种目标菌都设计了几 对序列互补的探针,但是互补探针杂交的效果并不 相同,例如, 有的探针杂交信号很好, 但是与其互补 的探针杂交信号却较弱,或者没有杂交信号。基片 上的探针与 PCR产物结合后形成复合物, 该复合 物的空间位阻可能会影响杂交效果 [ 7 ]。所以设计 探针时还要考虑探针和 PCR产物结合的位置以及 探针本身的长度。 本实验建立了一种基因芯片检测 3种病原细 菌的新方法,为其发展奠定一个良好的技术和理论 基础。但是, 其中还有很多不足之处, 如一张芯片 检测的细菌种类较少、杂交灵敏度测试等问题。目 前我们正致力于在不增加引物的前提下增加芯片 上检测致病菌的数量,并结合多重 PCR技术, 使其 达到简便、准确、高通量。 参考文献 1� G erard S, Sadd ler, John F B. G enu s I. Xan thom on as. / / Brenn er D J, Krieg N R, S taley J T. Bergey% sM anual of System at ic Bacteriolo� gy: 2nd ed. N ew York: Springer, 2001. 2� 廖晓兰,朱水芳,赵文军, 等. 水稻白叶枯病菌和水稻细菌性条 斑病菌的实时荧光 PCR快速检测鉴定. 微生物学报, 2003, 43 ( 5) : 626~ 634. 3� 黄冠军,殷幼平,张仑, 等. 柑桔溃疡病菌滚环扩增检测体系的 建立. 微生物学报, 2008, 48 ( 3) : 375~ 379. 4� 张华,姜英华,胡白石,等. 利用 PCR技术专化性检测水稻细菌 性条斑病菌. 植物病理学报, 2008, 38( 1 ): 1~ 5. 5� 张华,胡白石,刘凤权. 双重 PCR技术检测水稻白叶枯病菌和细 菌性条斑病菌. 植物检疫, 2007, 21(增刊 ): 34~ 35. 6� 陈昱,潘迎捷,赵勇,等. 基因芯片技术检测 3种食源性致病微 生物方法的建立. 微生物学通报, 2009, 36 ( 2) : 285~ 291. 7� 章桂明,章正.植物病原真菌检测平台方法的建立. 北京:中国 农业出版社, 2005. ∀12∀ 2010年第 5期 植物检疫 PLANT QUARANT INE V o.l 24 No. 5