猪病的实验室检测与监测

猪病的实验室检测与监测     (一)猪的粪尿常规检查法 　　1.尿中的潜血检查　肾、膀胱及尿路的出血性疾病以及溶血性疾病,如猪瘟、猪丹毒、新生仔猪溶血病等,在其尿液中均含有血液或血红蛋白,但若仅有少量,肉眼直接看不到,谓之潜血,必须借助化学来测定。常用联苯胺测定法。 　　(1)原理 血红蛋白中的铁,具有过氧化物酶的作用,可分解过氧化氢放出氧,使联苯胺氧化呈绿色或蓝色。 　　(2)试剂 ①联苯胺冰醋酸饱和液；②3%过氧化氢溶液。 　　(3)测定方法 取被检尿液3－5毫升,置洁净试管中煮沸,以破坏其他可能存在的过氧化物酶。 冷却后加入联苯胺冰醋酸饱和液数滴,再加3%过氧化氢溶液数滴,混合,数秒钟后即可呈现反应。 　　(4)结果判定 若供检尿呈绿色或蓝色,为阳性反应,颜色的深度(绿、蓝绿、蓝色、深蓝),可表示反应的强弱(+、++、+++、++++ )。若5分钟后仍不变色,则为阴性反应。 　　2.粪中的潜血检查 粪便中潜血阳性,见于胃溃疡、胃穿孔及胃肠道的出血性疾病。 　　(1)原理与试剂 与尿的潜血检查相同。 　　(2)测定方法取洁净棉签两根,滴以生理盐水,一支棉签上涂粪,另一支作对照,均置酒精灯上加温片刻,以破坏可能存在的几种过氧化物酶。待冷,各加1%联苯胺冰醋酸溶液及3%过氧化氢液各2滴,观察颜色出现的快慢及深浅。 　　(3)结果判定 如果涂粪棉签呈蓝色,而对照棉签颜色不变,为阳性反应；假若两支棉签均呈蓝色,为假阳性反应；若两支棉签均不变色,为阴性反应。 　　检验结果,可按以下： 　　加试剂后立即出现深蓝或深绿色者为最强阳性反应（++++）。 　　加试剂后初现浅蓝色,半分钟内渐现深蓝或深绿色者,为强阳性反应(+++)。 　　加试剂半分钟后,在1分钟内出现绿蓝色者,为阳性反应(++) 　　加试剂1分钟后,在2分钟内出现绿色者,为弱阳性反应 (+)。 　　加试剂2分钟后,在5分钟内缓缓出现浅绿色者,为痕迹反应(土)。 　　若5分钟后仍不出现浅蓝色或浅绿色者,为阴性(一)。 . 　　3.粪便的显微镜检查 本法是借助显微镜观察检查粪便中的寄生虫虫卵和幼虫,同时也可了解到被检猪的消化能力和胃肠道有无炎症病变。 　　(1)直接涂片法 取洁净载玻片1片,先滴1大滴生理盐水(若用50%甘油水溶液更好),再以竹签挑取被检粪便少许,与载玻片上的生理盐水混匀,涂成薄层,即可镜检。 　　本法简便易行,常用于检查粪便中有无寄生的蠕虫卵,由于取粪量很少,检出率较低，所以要求每个样品多涂几片(5－ 6片)。若在涂片中同时见到多量的红细胞和白细胞,则表示肠道有炎症。 　　(2)饱和盐水浮集法 先制备饱和食盐溶液,即在1000 毫升沸水中加入食盐380克,冷却后用纱布过滤备用。检查时,取5－10克猪粪，加入20倍量的饱和食盐溶液,搅拌溶解后用纱布滤入另一烧杯中,去掉粪渣,静置30－60分钟,使比重小于饱和食盐溶液的虫卵浮集于液面上,然后用直径0.5－ 1厘米的铁丝圈平行接触液面,使铁圈中形成一个薄膜,将其抖落于载玻片上,加盖玻片后,先用低倍镜观察,再转到高倍镜检查。 　　本法也不复杂,采用民虫卵比重大的盐水使虫卵集中浮在液体的表层,检出率较高,尤其对线虫卵检出效果较好。 　　(二)猪的血液常规检查法 　　血液常规检查的项目有多种,但是目前用于猪病诊断的项目不多,常用的有血红蛋白含量测定、红细胞计数、白细胞计数等。必须指出的是,血液常规检查仅仅是为临诊诊断提供一些数据,是一种辅助诊断手段,在操作时要严格遵循和注意事项,力求准确,避免差错,同时应与临诊检查密切结合,才能得到正确的结论。 　　1.血红蛋白含量测定 健康猪的血红蛋白值为10.5 克/100 毫升(变动范围9.5-12.0,若是血红蛋白的含量增多,见于各种原因引起的血液浓缩,如剧烈的腹泻、呕吐、出大汗及某些中毒病。血红蛋白含量降低,见于仔猪贫血及各种慢性消耗性疾病,如慢性猪瘟、仔猪蛔虫病等。 　(1)器械和试剂 ①国产萨利氏血红蛋白计；②0.1摩/ 升(1%－2%)盐酸溶液。 　　(2)方法 ①于测定管内加入0.1摩/升盐酸溶液至百分数刻度的"20"处(约5－6滴)。②用血红蛋白吸管吸取供检血液至20(或10)立方毫米处,用清洁脱脂棉拭净血红蛋白吸管尖端外壁附着的血液,迅速将血红蛋白吸管插入测定管底部的盐酸溶液中,缓缓压出血液,并以此盐酸溶液反复洗净管内所附着的血液。③以玻棒充分搅拌,使供检血与盐酸溶液充分混合,静置10分钟。④沿管壁向测定管内逐滴加入蒸馆馏水(或N/10盐酸溶液),随加随用玻棒搅拌,并与两侧的标准色柱相比较,直至管内液体的颜色与标准色柱一致为止。⑤ 读取测定管内液体凹面的刻度数,-即100毫升血液中所含血红蛋白的克数或百分数。如被检血的用量只达血红蛋白吸管的刻度"10"处时,将读数加倍。 　　(3)注意事项 ①吸血量应准确,血红蛋白吸管中的血柱不应混有气泡。②供检血液及稀释液均应沿测定管壁加入, 不能直接冲向管底而产生大量气泡。③搅拌要均匀,防止血液发生凝块。④稀释时蒸馏水应分次、逐滴加入,勿使液体颜色谈于标准色柱而无法比色。⑤混合完毕,应于10分钟后、 30分钟内进行比色。因在室温下,1分钟后约有75%的血红蛋白可与盐酸作用而呈褐色,5分钟后有88%,至10分钟时, 有95%的血红蛋白才能转化为褐色的酸性血红素。 　　2.红细胞计数 红细胞计数是将一定量供检血经一定倍数稀释后,计算其一定容积内的红细胞数,并换算为每立方毫米血液的含量,健康猪的红细胞数平均值为600万/立方毫米,(变动范围为500 万－700万)。红细胞增多,为血液浓缩,如脱水、出大汗、胸膜炎的渗出期等；红细胞减少,为各类贫血性的疾病或慢性消耗性的疾病。 　　(1)器材和稀释液 ①血红蛋白吸管,吸血用(与测定血红蛋白通用)。②红细胞计数板,同时也可用于白细胞、血小板计数用。目前一般使用的为鲍氏计数板，上面刻划两个计数室,每个计数室分为9个大方格,每1大方格的面积为1平方毫米,加血后(盖片)的深度为1/10毫米。每个大方格又划分为16个中方格(用于白细胞计数),每个中方格又分为16个小方格,共计400个小方格,用于红细胞计数。③盖玻片、吸管、试管及生理盐水等。 　　(2)方法 ①取小试管l支,先以普通吸管准确吸取红细胞稀释液4毫升(准确的数量为3.98毫升),置于试管中。② 稀释血液。用血红蛋白吸管吸取供检血样至20立方毫米处, 用于脱脂棉拭去管尖外壁附着的血液,然后将血红蛋白吸管插入已装稀释液的试管底部,缓缓放出血液,再吸取上清液反复洗净沾在吸管内壁上的血液数次,立即振摇试管1－2分钟,使血液与稀释液充分混合,即得200倍的稀释血液。③充液。取清洁干燥的计数板和盖玻片,将盖玻片紧密覆盖于血细胞计数板上,并将血细胞计数板置显微镜台上,用低倍镜先找到计数室,然后用小吸管取已摇匀的稀释血液1滴,使吸管尖端接触盖玻片边缘和计数室空隙处,稀释的血液即可自然引入并充满计数室。④计数。计数室充液后,应静置1－2分钟, 待红细胞分布均匀并下沉后开始计数,计数红细胞用高倍镜, 一般计数中央大方格中四角的4个及中央1个中方格(共计 5个中方格,即为80个小方格)内的红细胞,5个中方格内红细胞的最高数和最低数相差不得超过正负10%,否则表示血液稀释混合不均。红细胞在高倍镜下呈圆形,淡黄色,发亮。为避免重复和遗漏,在计数时应按一定的顺序进行。压在双线上的红细胞都应计算在内，对于压在线上的红细胞,每格都只计入上方和左侧线上的红细胞,而压在下方和右侧的红细胞则均不计入。计算按下列公式进行： 　　每立方毫米血液内红细胞总数=x/80×400(小方格总数)×稀释倍数×10 　　x为计数5个中方格(80个小方格)的红细胞数。如血液稀释200倍,为计算方便,也可将计数5个中方格(80个小方格)内的红细胞总数,乘以10000,即得每立方毫米血液内的红细胞总数。 　　3.白细胞计数 白细胞计数,对某些疾病的辅助诊断有重要的意义。多数细菌性感染和炎症,都能使白细胞增多,如猪丹毒、肺炎、链球菌感染等。而一些病毒性的传染病则能使白细胞减少，如猪瘟、流行性感冒等；某些严重疾病的后期,机体高度衰竭时,亦可见白细胞减少；长期应用某种药物(如氯霉素),也可引起白细胞减少。健康猪白细胞的平均值为 13000个/立方毫米(变动范围为11000－16000个)。 　　(1)器材和稀释液 器材基本同红细胞计数所用,不同的是稀释液采用1%－3%醋酸溶液(或1%盐酸溶液)。为使白细胞核着色,便于识别,并与红细胞稀释液相区别,可于稀释液中加入1%亚甲蓝或1%结晶紫溶液数滴。 　　(2)方法 ①取清洁、干燥的小试管1支,以0.5毫升吸管准确吸取白细胞稀释液0.38毫升,放入试管中。②稀释血液。以血红蛋白吸管准确吸取供检血液至20立方毫米处,用干棉球擦去管尖外壁所附的血液,立即将被检血吸入已装稀释液的试管底部,并吸取上清液反复洗净沾在吸管内壁上的血液数次,然后振摇试管1-2分钟,使血液与稀释液充分混合，即可成为20倍稀释的血液。③充液的步骤和操作,同红细胞计数。④计数的方法与红细胞计数相同,但白细胞计数时用低倍显微镜即可,计数四角处4个大方格(每个大方格包括16个中方格)内的白细胞总数。计算按下列公式进行： 　　每立方毫米血液内白细胞数=x/计数的大方格数×血液稀释倍数(20倍)×10(计数室的深度) 　　x为计数4个大方格(或计数成对角线的位置上的两个大方格)内的白细胞数。 如血液稀释20倍,并计数4个大方格,则白细胞的总数为x/4×20×10=x×50(个/立方毫米)。　(三)细菌的分离、培养和鉴定 　　猪的细菌性疾病种类很多,危害不小,常见的细菌病有仔猪黄痢、白痢、猪水肿病、副伤寒、猪丹毒、猪肺疫、链球菌病等,其中有的疾病可以一目了然(如仔猪黄痢、白痢等),易于诊断,有些疾病则一时难以确诊(如副伤寒、猪接触传染性胸膜 肺炎等),而更多的细菌病是并发或继发感染的,为了做到及时、正确地诊断猪病,规模化的猪场有必要开展细菌的分离、培养和鉴定工作,同时还可将分离出的细菌,通过抑菌试验筛选出敏感性强、疗效好的抗菌药物进行治疗。掌握了细菌学的检查技术,还可开展对猪舍消毒效果的测定,饮用水、饲料中的细菌学检查等项工作。 　　规模化猪场的化验室开展这项工作,需要一定的设备和条件,操作人员应该具备兽医微生物学的基本知识和实验室的操作技术、要求做到正确、熟练,其内容包括病料的采集,细菌的分离培养,形态观察,生化试验和动物接种试验等。 　　下面以猪肺疫的病原-多杀性巴氏杆菌的分离、培养和鉴定为例,作简要介绍。 　　1.采样与病原分离 　　 猪肺疫病原为多杀性巴氏杆菌,临诊上可分为3型：最急性型,见于流行初期,常无明显的症状而突然死亡；急性型,较为常见,多呈急性胸膜肺炎症状,病程 3－5天；慢性型主要表现为慢性肺炎的症状。 　　(1)病料的采取 生前采取血液、水肿液，死后无菌操作采取心血、肝、脾、淋巴结、骨髓或肺部病灶等。 　　(2)病料的处理 脏器或淋巴结应先作表面除杂，将组织块浸渍于95%酒精中立即取出，引火自燃,这样反复2－3 次,或在沸水中浸烫数秒钟,然后用灭菌刀剖切，其剖面在血琼脂平板一侧涂抹,面积是平板的1/5。再用铅耳在涂层上划抹分离,分离时应涂抹数个平板,以提高检出机会。 　　(3)直接镜检 血液作推片,其他脏器以剖面作涂片各若干片,用数片以甲醇固定作革兰氏染色,另数片作瑞氏或美蓝染色。如发现大量革兰氏阴性、两端钝圆、中央微凸的短小杆菌,即可初步确诊。本菌无鞭毛,不能运动,能形成荚膜。单染菌体呈卵圆形,两端着色深,中央着色浅,好像两个并列的球菌,故有两极杆菌之称。病料用印度墨汁染料染色,可清晰地见到细菌的荚膜。 　　(4)分离培养 最好用麦康凯琼脂和鲜血琼脂平板同时进行分离培养,本菌在麦康凯琼脂上不生长,而在鲜血琼脂平板上,培养24小时后,可长成淡灰白色、圆形、湿润、不溶血的露珠样小菌落。涂片染色镜检,为革兰氏阴性小杆菌,再进一步可作生化和动物接种试验。 　　2.病原的鉴定 　　(1)生化反应 本菌在48小时内可分解葡萄糖、果糖、单奶糖、庶糖和甘露醇等,产酸不产气，一般对乳糖、鼠李糖、菊糖、水杨苷和肌醇等不发酵。可产生硫化氢和氨,能形成被基质,甲基红(MR)试验和维培二氏(V-P)试验均为阴性。接触酶和氧化酶均为阳性。石蕊牛乳无变化,不液化明胶。 　　(2)动物接种试验 取病料在灭菌研钵中加生理盐水 1：10制成乳剂,如作纯培养的毒力鉴定,用4%血清肉汤24 小时培养液或取血平板上菌落制成生理盐水菌液,皮下或腹腔接种小白鼠2－4只,每只注射0.2毫升,一般经10个小时左右致死。死亡小白鼠的呼吸道及消化道粘膜有出血小点,肝肿大、有坏死灶。取心血及肝脏涂片染色镜检,见大量两极浓染的细菌,即可确诊。 　　(3)血清型鉴定 多杀性巴氏杆菌可分为多种血清型。目前国际上公认的分型方法是将特异性荚膜抗原吸附于红细胞上,作被动血凝试验,将本菌分为A,B,D,E 4个血清群,又将菌体抗原作凝集反应,将本菌分为12个血清型,用阿拉伯数字表示。猪巴氏杆菌的血清型以5：A和6： B为主。 　抗原和相应的抗体在动物体内或体外都能发生特异性结合反应,这种反应称为抗原抗体反应,习惯上把体内的抗原抗体反应称为免疫反应,体外的抗原抗体反应称为血清学反应, 因为抗体主要存在于血清。 　　血清学反应可以用已知的抗体检查未知的抗原,也可用已知的抗原测定未知的抗体。人们根据抗体能与相应抗原发生反应并出现可见的抗原-抗体复合物的原理,设计了许多血清学诊断方法,不仅可以检测动物体内乃至体外的病原微生物,或其抗原性成分,而且还可以测定动物机体对病原微生物侵袭或对其抗原成分的免疫反应。在抗原-抗体复合物呈不可见状态时,可以通过琼脂扩散、凝集试验以及酶标记等指示系统,使其变为可见或可测状态。 　　由于血清学反应具有高度的特异性和敏感性,因此在兽医学上广泛用于对许多传染病的诊断、病原微生物的鉴定及抗体的检测等。 　　目前已知的血清学诊断方法很多,随着科学在术的进步,新方法、新技术还在不断地出现,要求达到微量、准确、快速、 简便。现介绍几种在目前条件下规模化猪场通过学习都能做到的诊断方法：凝集试验、沉淀试验和酶联免疫吸附试验。 　　1.凝集试验 　　 凝集试验的原理是：颗粒抗原(红细胞、细菌、病毒等)与含有相应抗体的血清混合,在电解质的参与下, 则能发生特异性结合，形成抗原抗体复合物,这种复合物呈均匀状态悬浮于液体中,这时肉眼是看不见的,当抗原抗体复合物在一定浓度的电解质作用下,复合物表面的电荷大部分被消除,失去了互相排斥的作用，复合物之间互相吸引，凝集成团,即出现肉眼可见的凝集现象。作用于凝集反应的抗原,称为凝集原,与之相结合的抗体,称为凝集素。 　　凝集反应按其原理可分为直接凝集反应和间接凝集反应两类。用于猪病诊断的常用操作方法有以下几种。 　　(1)全血平板凝集试验 本试验在实践中主要用于细菌性疾病的抗体检测和抗原(经分离培养后)的鉴定。现举例用已知猪丹毒抗原(丹毒杆菌的纯培养液)测定被检猪血清中的抗体。其操作步骤如下： 　　①材料 猪丹毒凝集抗原,玻片,9号针头,酒精棉球,酒精灯,铅耳(取血环)等。 　　②操作 用铂耳取已知抗原1滴,置于玻片上。用酒精棉球擦拭针头,铂耳在酒精灯上灼烧消毒。用针头刺破被检猪的耳静脉,以铂耳取血与玻片上的抗原等量混合,在2－3分钟内观察结果。 　　③结果判定 出现颗粒状的凝集,为阳性反应。否则为阴性。 　　(2)试管凝集试验 　　 试管凝集试验是一种定量法,用于测定被检血清或其他体液中有否某种抗体及其效价,可作临床的辅助诊断,或用于流行病学监测。在猪场中,本法常用于猪布氏杆菌病的诊断。 　　①材料 布氏杆菌病试管凝集抗原(1：20倍稀释),布氏杆菌病阳性血清、阴性血清(1：25倍稀释),稀释液(0.5% 石炭酸生理盐水),灭菌小试管,1毫升吸管,试管架,待检血清等。 　　②操作 取试管7支置于试管架上,设阳性和阴性血清及抗原对照各1支,测定管4支,以后每增加一个样品,只需增加4支测定管。 　　按表2示意稀释血清,加抗原,完成后每支管内应含 1毫升液体。 　　加入抗原后,将试管充分振荡,置37℃温箱反应24小时后，判定结果。 　　③判定标准 　　"一"　液体均匀混浊,管底无凝集物,不凝集。 　　"+"　液体透明度较差,管底有少量凝集物,为25%凝集。 　　"++"　液体中等混浊,管底有中等量的伞状沉淀,50%菌体凝集。 　　"+++"　液体几乎透明,管底有明显伞状沉淀,75%菌体凝集。 　　"++++"　液体完全透明,管底出现大片的伞状沉淀,100% 菌体凝集。 　　结果判定：以出现50%菌体凝集的血清最高稀释度为该血清的凝集价。在检测猪布氏杆菌病时,血清凝集价在1：50以上时，可判为阳性反应，若凝集价为1：25则为可疑(需复试验1次)。如猪群中基本无阳性反应,则凝集价1：25也可判为阴性。 　　(3)间接红细胞凝集试验 　　 本法简称间接血凝试验。其原理是：将抗原(或抗体)吸附在比其体积大千万倍的红细胞表面,只需少量的抗体(或抗原)就可使这种致敏的红细胞通过抗原和抗体的结合而出现肉眼清晰可见的凝集现象。这种试验能大大提高反应的敏感性。 　　用抗体致敏红细胞检测相应的抗原,称为反向间接血凝试验,反之,称为正向间接血凝试验。在猪病的诊断中,常采用本法对猪口蹄疫、水疱病、猪瘟、传染性胸膜肺炎等疾病抗原的鉴定,或抗体的检测。现举例猪口蹄疫的抗体检测(正向间接血凝),操作步骤如下。 ①目的 检测被检血清样品中猪口蹄疫抗体的效价。 　　②材料 猪口蹄疫(○型)正向间接血凝标准致敏红细胞 (由兰州兽医研究所提供),标准阳性、阴性血清,稀释液,96 孔"V"型有机玻璃微量血凝板,微量加样器,滴头，被检血清等。 　　③操作 将待检血清置60℃水浴中灭活30分钟,用微量加样器对血凝板上的每孔加入25微升稀释液。取25微升待检血清加到第一孔,用加样器以吸人与排出的动作混合3-4次,取出25微升放人第二孔混匀,依次到第九孔,取出25 微升弃掉。血清稀释度从第一至第九孔分别为1：2,1：4, 1：8,1：16,1：32,1：64,1：128,1：256,1：512(第一排的 10－12孔设阳性血清对照、阴性血清对照和抗原对照)。每孔 加入25微升致敏红细胞,振荡1-2分钟,置37℃温箱或室温下反应1－2小时或更长时间，然后判定检测结果。 　　④判定标准 　　"一"　红细胞沉底,呈圆点状,无凝集现象。 　　"+"　红细胞大部分集中于中央,周围只有少数凝集,即 25%凝集。 　　"++"　红细胞呈薄层凝集,中心致密,边缘松散,即50%凝集。： 　　"+++"　红细胞凝集程度较上有所增加,即75%凝集。 　　"++++"　红细胞呈薄层凝集,布满整个孔底或边缘,卷曲呈荷包蛋边状,为l00%凝集。 　　结果判定：以出现50%凝集(++)的血清最高稀释度为该血清的间接血凝价。 　　(4)乳胶凝集试验(LAT) 　　 本法在猪病中主要用于伪狂犬病和萎缩性鼻炎的诊断,是用其病毒致敏乳胶抗原来检测被检猪的血清、全血或乳汁中的抗体,具有简便、快速、特异、 敏感的优点。 　　①材料 伪狂犬病病毒致敏乳胶抗原,伪狂犬病阳性血清、阴性血清,稀释液,玻片,吸头,被检血清或全血或乳汁(通常采初乳,经3000转/分钟离心10分钟,取上清液作待检样品) 　　②试验方法 　　定性试验：取被测样品(血清、全血或乳汁)、阳性血清、阴性血清、稀释液各1滴,分置于玻片上,各加乳胶抗原1滴,用牙签混匀,搅拌并摇动1－2分钟,于3－5分钟内观察结果。 　　定量试验：先将血清在微量反应板或小试管内作连续倍比稀释,各取1滴依次滴加于乳胶凝集反应板上,另设对照 (同上),随后各加乳胶抗原1滴。如上搅拌并摇动,然后判定。 　　③结果判定 首先对照组要出现如下的结果,本试验才能成立：阳性血清加抗原呈"++++"阴性血清加抗原呈"一"，抗原加稀释液呈"一"。 　　"++++" 全部乳胶凝集,颗粒聚于液滴边缘,液体完全透明。 　　"+++" 大部分乳胶凝集,颗粒明显,液体稍混浊。 　　"++" 约50%乳胶凝集,但颗粒较细,液体较混浊。 　　"+" 仅有少许凝集,液体混浊。 　　"一" 液滴呈原有的均匀乳状。 　　以出现"++"以上凝集者，判为阳性凝集。 　　2.沉淀试验 　　 沉淀试验的原理是：利用可溶性抗原如细菌的培养滤液、病毒的可溶性抗原和血清等,与相应的抗体结合,在电解质存在时,可形成肉眼可见的白色沉淀物。参加沉淀反应的抗原,称为沉淀原，抗体叫做沉淀素。沉淀试验的具体方法有多种,如环状沉淀试验、琼脂扩散试验和免疫电泳等。在猪病的诊断中,目前最常用的是琼脂扩散试验。现将本试验简要介绍如下。 　　琼脂扩散试验，是根据沉淀试验的原理,抗原和抗体可在琼脂凝胶中扩散,并由近及远形成浓度梯度，当抗原、抗体的特异性互相对应时,它们在琼脂基质中适合比例下相遇,便可相互结合,形成抗原-抗体的结合物,分子量相应增加,颗粒变大,故在琼脂凝胶中不再扩散,在抗原、抗体比例较适合的位置上形成白色可见的沉淀线,此种沉淀反应,称为琼脂免疫扩散试验，简称"琼扩"。本法可用已知抗原测定未知抗体,反之亦然。在猪病的实验室诊断中，常用于猪伪狂犬病的抗体检测,也曾有用此法检查猪瘟、猪水疱病和猪痘等疾病的报道。现以检测伪狂犬病的抗体为例，将其操作方法介绍如下。 　　(1)材料 伪狂犬病标准琼扩抗原,阳性血清,阴性血清, 待检血清(56℃灭能30分钟),生理盐水,打孔器,微量移液器,培养皿,琼扩琼脂(配制方法：含有0.1%石炭酸的磷酸缓冲盐水,加入1%的优质琼脂,在沸水中融化均匀,若有杂质, 须用纱布过滤,然后分装于盐水瓶内,保存备用)。 　(2)操作 　　①浇琼脂板和打孔 将已融化的琼脂趁热倒入平皿,制成3毫米厚的琼脂板,待凝固后进行打孔。一组共7个孔,中间l孔,周围6孔。用打孔器打孔,剔出孔内的琼脂,然后将琼脂板在酒精灯上来回过 2－3次,使琼脂与玻板之间的空隙封闭。 　　②向孔内加样 中央孔加抗原,外周孔第1,5孔加阳性和阴性血清作对照,第2,3,4,6孔加待检血清。将加完样的琼脂平皿合上盖子,置37℃恒温箱扩散24－36个小时,然后判定结果。 　　③结果判定 首先检查标准阳性血清孔和抗原孔之间是否出现明显的致密的白色沉淀线5的，而阴性孔则不出现,只有在对照组出现正确结果的前题下,被检孔才可参照标准判定。 　　④注意事项 　　第一,琼扩所用的琼脂必须是优质的琼脂粉,若用普通的琼脂条,应事先进行净化精制。精制的简易方法是：取条状琼脂24克,加蒸馏水1 000毫升,在沸水中融化,趁热倒入搪瓷盘中,待冷却后切成1平方厘米大小的琼脂块,用蒸馏水或无离子水浸泡2－3天,每天换水4－5次，然后将处理好的琼脂块隔水融化,加入0.1%石炭酸磷酸缓冲盐水,配成1%琼脂。 　　第二,制备琼脂板应在水平台上进行,防止产生厚薄不匀。板的厚度要求一致(7.5厘米的平皿,用15毫升琼脂液)。 浇制时防止产生气泡。平皿浇制的琼脂板在4℃冰箱内可保存15天。 　　第三,打孔的孔径、孔距力求准确、合适。 　　第四,加滴孔中的抗原和血清时,孔内必须加满而又不能外溢。加样时不能带进小气泡。 　　3.酶联免疫吸附试验(ELISA) 　　免疫酶技术是根据抗原与抗体特异性结合的功能,以酶作标记物,利用酶对底物具有高效催化作用的原理而设计的,它既可用于抗原的诊断,也可进行血清抗体的检测。 　　本试验是通过化学方法将酶与抗体(或抗原)结合起来, 标记后的抗体(或抗原)仍然保持与相应抗原(或抗体)相结合的免疫学活性。例如,酶抗体与相应抗原结合后,形成酶标抗体-抗原复合物。复合物中的酶在遇到相应的底物时,催化底物分解、氧化而生成有色物质,有色产物的出现,客观地反映了酶的存在,根据有色产物的有无及其浓度,即可间接推断被检抗原或抗体是否存在及其数量,达到定性和定量的目的。 　　免疫酶技术已经广泛地用于传染性疾病的诊断,血清流行病学调查和抗体水平的,微生物抗原的检测及其在感染细胞内的定位。 　　目前在兽医防治的研究和实践中,对于猪瘟、伪狂犬病、 繁殖与呼吸综合征、流行性腹泻、旋毛虫病、猪气喘病等疾病, 均采用免疫酶技术进行病原诊断，抗体检测和血清学流行病调查,并且已成为规模化猪场化验室工作的一项重要内容。 　　利用免疫酶技术测定抗原或抗体的方法很多，下面仅简要介绍两种适合猪场使用的免疫酶技术。 　　(1) 斑点酶联免疫吸附试验(Dot-ELISA) 　　①材料 硝酸纤维滤膜(孔径0.45微米),0.01摩/升、 pH值7,2的磷酸盐缓冲盐水,封闭液(磷酸盐缓冲盐水加入 10%马血清或0.1%明胶),30%双氧水(H2O2),3,3′-二氨基联苯胺(DAB)抗原液,阴性对照,待检液,待检血清,阳性血清及阴性血清,酶标免抗猪免疫球蛋白G(IgG),0.05摩/升三羟甲氨基甲烷-盐酸缓冲液,洗涤液(磷酸盐缓冲盐水加入 0.05%吐温-20)。 　　②操作 　　检测抗原 　　1)硝酸纤维滤膜(NCM)的处理：在滤膜上划6毫米×6毫米的方格,在方格中央用蘸水笔尖的圆尾末端压成圆形痕迹。置于蒸馏水中浸泡10分钟,取出后晾干备用。 　　2)点样：取1微升待检液在硝酸纤维滤膜圆圈内点样,同时设立阳性与阴性对照,自然干燥或置37℃温箱中干燥。 　　3)封闭：将硝酸纤维滤膜置于封闭液中,37℃30分钟, 用洗涤液洗涤1次,约3分钟。 　　4)加工作浓度的猪阳性血清,将硝酸纤维滤膜置于猪阳性血清中,37℃作用1小时,取出用洗涤液洗涤3次,每次3 分钟。 　　5)加酶标兔抗猪免疫球蛋白G,37℃作用1小时,然后洗涤3-4次,每次3分钟。 　　6)加底物溶液(0.05摩/升三羟甲氨基甲烷-盐酸缓冲液 100毫升,加3,3′-二氨基联苯胺40毫克,30%双氧水50微升),作用5－20分钟。 　　7)终止显色,将硝酸纤维滤膜置于蒸馏水中冲洗2－3分钟 　　8)自然干燥,或37℃下干燥。 　　9)判定标准： 　　"一" 不呈现斑点,与阴性对照相同。 　　"+" 斑点较弱或点内有不均质的棕色点。 　　"++" 斑点浅棕色,对比度清晰。 　　"+++" 介于++和++++两者之间。 　　"++++" 斑点深棕色,背景白色。 　　出现阳性反应的血清最高稀释度为该血清的Dot- ELISA效价。 　　10)注意事项：试验中的点样抗原、血清及酶标抗体的稀释度应根据预备试验确定；试验中应使用不溶性供氢体,如 3,3′-二氨基联苯胺,4-氯-1-萘酚等,不能使用可溶性供氢体； 根据试验的目的要求,确定检测抗原或抗体；封闭液可使用异种动物血清、牛血清白蛋白(BSA)或明胶溶液等进行封闭,根据预备试验选择最佳封闭条件。 　检测抗体 　　1)硝酸纤维滤膜的处理,同检测抗原。 　　2)点样：取己知抗原液点样,自然晾干或37℃干燥。 　　3)封闭,同检测抗原。 　　4)将点样后的硝酸纤维滤膜按点样格子剪成小块,置入系列稀释的待检血清(1：10,1：50,1：100,1 ：200,1 ：400, 1：800,1：1600,1：3200,1：6400,1：12800)中,同时设立阳性和阴性血清对照,37℃作用1小时,然后用洗涤液洗涤3次,每次3分钟。 　　5)以下均同检测抗原6),7),8),9),10)项操作。 　　(2)酶联免疫吸附试验(ELISA) 　　 本试验是固相免疫酶测定法中应用最广泛的一种测定方法,以物理吸附法制备免疫吸附剂。现介绍猪病诊断中常用的两种方法-间接法和夹心法。 　　　①间接法 将已知抗原吸附(或称包被)于固相载体,孵育后洗去未吸附的抗原,随后加入含有特异性抗体的被检血清,感作后洗涤未起反应的物质,加入酶标抗同种球蛋白(如被检血清是猪血清,则需用抗猪球蛋白),感作后再经洗涤,加入酶底物,底物被分解后出现颜色变化,颜色变化的速度及程度,与样品中的抗体量有关,即样品中的抗体愈多,颜色出现愈快、愈深。 　　材料：0.05摩/升、pH值9.6碳酸盐缓冲液,稀释液用 0.01摩/升、pH值7.2磷酸盐缓冲盐水(含0.13摩/升氯化钠,5%犊牛血清),洗涤液用0.01摩/升、pH值7.2磷酸盐缓冲盐水(含0.13摩/升氯化钠,0.05%吐温-20),30%双氧水, 邻苯二胺(OPD),pH 值5磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液,2摩/升硫酸,抗原,阳性血清,阴性血清,待检血清,酶标兔抗猪免疫球蛋白G,40孔聚苯乙烯酶联板,酶联免疫检测仪。 　　操作： 　　1)用碳酸盐缓冲液配制一定浓度的抗原包被液包被酶联板,每孔100微升,置37℃条件下2小时,或在4℃冰箱内过夜。 　　2)倾去孔内液体,用洗涤液加满各孔,洗涤3次,每次3 分钟,然后倾尽洗涤液。 　　3)除调零孔外,其余孔加入用稀释液稀释的待检血清,每孔100微升,同时设立阳性、阴性血清对照,置37℃下反应 1.5小时。 　　4) 抗体效价测定：将待检血清进行倍比稀释,每份血清加二排孔,即同一稀释度的血清加上下相邻的两个孔，每孔l00微升,调零孔不加血清。同时设立阳性、阴性血清对照。置 37℃反应1.5小时。 　　5)洗涤同2)。 　　6)除调零孔外,每孔加入酶标记兔抗猪免疫球蛋白G 100微升,置37℃下反应1.5小时。 　　7)洗涤同2)。 　　8)每孔加入新配制的底物溶液(取邻苯二胺40毫克,溶于100毫升pH值5磷酸盐-柠檬酸缓冲液,临用前加入30% 双氧水0.15毫升)100微升,室温下观察显色(5－30分钟)。 　　9)每孔加入50微升2摩/升硫酸终止反应。 　　10)用酶联免疫检测仪测定每孔490纳米波长的光密度(OD)值。 　　②夹心法 本法是检测抗原的方法,将特异性免疫球蛋白吸附于固相载体表面,然后加入含有抗原的溶液,使抗原和抗体在固相表面形成复合物,洗除多余的抗原,再加入酶标记的特异性抗体,感作后冲洗,加入酶的底物,颜色的改变与被测样品中的抗原量成正比。 　　材料：同间接法。 　　操作(以检测猪瘟病毒抗原为例)： 　　1)抗体包被：将一定浓度的猪瘟高免血清(用碳酸盐缓冲液进行稀释)包被酶联板,每孔100微升,置37℃下2小时, 或4℃冰箱中过夜。 　　2)洗涤：同间接法 　　3)加被检样品,除调零孔外,每份样品加2个孔,每孔加 l00微升,同时设立阳性抗原、阴性抗原对照,酶结合物对照 (抗体加磷酸盐缓冲盐水加酶结合物),置37℃下反应1.5－2 小时。 　　4)洗涤,同2)。　5)加底物溶液,同间接法8)。 　　6)同间接法9)。 　　7)同间接法10)。 　　③结果判定 常用的判定方法有3种。 　　阴阳性表示法：待检样本吸收值：规定吸收值≥0.2－0.4 为阳性。规定吸收值等于阴性样本平均吸收值加SD(标准差)。 　　阳性阴性比(P/N)法：样本吸收值/阴性样本平均吸收值≥2－3者为阳性。 　　终点表示法：以出现阳性反应的样本最高稀释度为该样本的滴度。 　　④注意事项 　　第一,包被过程中以高pH值和低离子强度的条件为佳，包被浓度在1－100毫克/毫升选择最佳浓度。 　　第二,血清或抗原稀释液应含5%－10%异种动物血清, 或1%牛血清白蛋白,或0.5%明胶,以起封闭作用,防止非特异性反应,否则应在2)与3)步之间加封闭液进行封闭。 　　第三,洗涤要充分,酶结合物应按要求进行稀释和使用, 底物溶液一定要现配现用。 　　第四,显色时,阴性对照刚出现微黄色时应立即终止反应。. 　　第五,用阳性阴性比方法判定结果时,阴性对照孔若小于0.1,则易出现误判。 　　第六,用自动酶联仪检测时，应按仪器规定说明确定调零孔。 　　第七,同一稀释度2个孔的490纳米波长光密度值的平均值为该稀释度的光密度值,对照孔应做同样处理。 　　(3)猪瘟单克隆抗体纯化酶联免疫吸附试验 　　①材料 本试验的试剂盒由中国兽药监察所提供,本抗原包括猪瘟弱毒单抗纯化酶联抗原和猪瘟强毒单抗纯化酶联抗原,分别供检测经猪瘟弱毒疫苗免疫后产生的抗体和感染猪瘟强毒后产生的抗体之用。同时提供酶标抗体,阳性、阴性血清,酶联板及其他器材和试剂。 　　②试验方法 　　第一,用包被液将猪瘟弱毒单抗纯化酶联抗原、猪瘟强毒单抗纯化酶联抗原各作l00倍稀释,以l00微升分别加入做好标记的酶联板孔中,置湿盒于4℃过夜。 　　第二,弃去孔内液体,用洗涤液冲洗板3次,每次间隔3－ 5分钟,拍干。 　　第三,用稀释液将待检血清作400倍稀释,每孔加入100 微升,同时将猪瘟阳性、阴性血清以100倍稀释作对照,37℃下培育1.5－2小时。 　　第四,重复第二步。 　　第五,用稀释液将兔抗猪免疫球蛋白G-辣根过氧化物酶结合物作100倍稀释,每孔加入100微升,37℃下培育1.5－ 2小时。 　　第六,重复第二步。 　　第七,每孔加入底物溶液(每块板所需的底物溶液按邻苯二胶5毫克加底物缓冲液5毫升加30%双氧水18.75微升配制)100微升,室温下观察显色反应(一般阴性对照孔略微显色,立即终止反应,并以阴性孔作空白调零)。 　　第八,每孔加入终止液50微升,于酶联读数仪上测定490纳米波长的光密度(OD)③判定标准 　　在猪瘟弱毒酶联板上： 　　光密度>0.2为猪瘟弱毒抗体阳性, 　　光密度<0.2为猪瘟弱毒抗体阴性。 　　在猪瘟强毒酶联板上： 　　光密度≥0.5为猪瘟强毒抗体阳性； 　　光密度<0.5为猪瘟强毒抗体阴性。 　　④注意事项 　　第一，运输单抗纯化酶联抗原时，必须使用冰盒低温运输。 　　第二,配制洗涤液时,应使用新鲜蒸馏水或无离子水；每次洗板后,尽量不使孔中有残余液体,以免影响结果。 　　第三,底物溶液临用前配制,待邻苯二胺完全溶解于底物缓冲液后再加双氧水,混匀后立即加入孔中。 　　第四,终止反应后,应立即读数。