灵芝抱子粉水溶性多糖的分离、纯化及结构研究

天然产物研究与开发 NATURAL PRODUCT RESEARCH AND DEVELOPMENT 2005 Vol. 17 No. 2 灵芝抱子粉水溶性多糖的分离、纯化及结构研究 赵桂梅，张丽霞，于挺敏，张丽萍‘ (东北师范大学生命科学学院，长春130024) 摘 要:灵芝抱子粉的热水提取液经醇析，脱脂，去单寡糖后由Sepharose CI-613柱层析纯化，所得多糖%G II -2 经高效液相方法鉴定纯度为单一级分，相对分子质量为5.37 x 1(4。再经部分酸水解、高碘酸氧化、Smith降解、 甲基化分析及IR ,GC, GC-MS和13C NMR等方法确定其结构。结果表明多糖SGGn-2由葡萄糖和半乳糖组成， 为少分支结构，由1-3连接和1-6连接的葡萄糖构成主链，部分1->6连接葡萄糖在3位或4位有分支，侧链为 1-4连接的半乳糖，分支末端残基为葡萄糖。 关键词:灵芝抱子粉;多糖;结构 中图分类号:Q539 Chemical Study on the Water Soluble Polysaccharide from Spores of Ganoderma lucidum ZRAO Gui-mei, ZRANG Li-xia, YU Ting-min, ZHANG School of Life Sciences，Northeast Normal Unives妙,Changchun 13 Li-ping' 0024, China) Abstract: The polysaccharide isolated from the spores of Ganodenna lucid- was purified and characterized. The crude polysaccharide was obtained from the hot-water extract of the spores of Ganodenna lucidwa and the polysaccharide SGG II -2 。 isolated场Sepharose CL-613 column chromatography. The HPLC analysis indicated that the SCI- II -2 was a homogeneous polysaccharide. Its molecular weight was estimated to be 5. 37 x 104. By， of partial hydrolysis with acid, periodate oxida- tion, Smith degradation, methylation, IR, GC, GC-MS and 13 C NMR, the structure of SGIG II一。 identified. It is a lowly branched molecule with basic structure composed of (1-3)-linked-glucose and (1-6)-linked-glucose residues in the main chain. Some of (1-6)-linked-glucose residues are substituted at 3-0 or 4-0. The side chain is composed of (1-4)-linked- galactose.The nonreduced end is glucose. Key words: spores; Ganodemia luddon;浏ysaccharide; stricture 灵芝抱子(Spores of Ganoderma lucidum)是由灵 芝发育后期释放出来的担抱子。近年来，随着抱子 粉采集和破壁技术的提高，对灵芝抱子粉有了进一 步的认识。药理试验表明，灵芝抱子粉比灵芝子实 体具有更强更全面的作用，它是灵芝的精华部分，具 有抑制肿瘤细胞生长，调节、提高人体免疫力，降低 胆固醇，提高肌体耐缺氧能力等功能〔‘〕。目前研究 认为，灵芝多糖类化合物是灵芝中主要的活性成分 之一，国内已有报道指出从抱子粉中可提取出具免 疫调节活性的多糖[2l。本文从灵芝抱子粉中提取并 纯化得到单一级分多糖，并对其结构进行鉴定，为进 一步药理活性研究提供基础。 收稿日期 ，通讯作者 :2004-12-23 接受日期:2005-01-1s E-mail: zhan目两25 @ netm. edu. cn 1 实验材料 1.1 原材料 未破壁灵芝抱子粉由辽宁阜新百发生物技术公 司提供。 1.2 药品与试剂 Sephamse CL-6B胶为瑞典Phamiacia产品;三甲 基氯硅烷(GR)为Flukachemika产品。其它化学试剂 均为国产分析纯试剂。 1.3 仪器 高效液相色谱系统:Japan SHIMADZU LC-10ATvP; 2005 Vol. 17 No. 2 赵桂梅等:灵芝抱子粉水溶性多糖的分离、纯化及结构研究 流动相0.9% NaCl水溶液;监测器SHIMADZU RID- 10A;工作站 CLASS Vp;色谱柱 TSK-GEL TYPE: G3000PWxL 7.8 x 30. 0 cm(L)。气相色谱仪为Vavian 3400型，附FID检测器，HP3365化学工作站;色谱柱 SE-30 50 mm x 0. 20 mm x 0. 25 um;载气为高纯氮。 INOVA-500型核磁共振仪。SPECORD IR型红外光 谱仪。美国惠普色质联机 HP5890 ( II ) GC/ HP5988MS; HPS石英毛细管柱25 mx0.22 mm x0.2 rim。国产WXG6型自动旋光仪。透析袋为德国 Serva Feinbiochemica公司产品。 2 实验方法 2.1 粗多糖的提取与纯化 取1000 g未破壁灵芝抱子粉经石油醚脱脂，70 %甲醇80℃回流脱去单寡糖，然后水煮三次，合并 水提物，浓缩，用三倍97%乙醇醇析过夜，离心后粗 多糖沉淀真空干燥(6.582 g). 所得粗多糖配成5%糖液，用链蛋白酶脱去蛋 白[3.41后，通过Sepharose CL-6B柱层析，以0.9% Na- Cl溶液洗脱(10 mU20 min)，收集后用酚一硫酸法测 糖分布，截得SGL- I (0. 645 g) , SGL- II(1.511 g)和 SGL, III (0. 274 g)三个级分，将SGIr II依上述条件再 次柱层析，得到级分SGL- II一1(0.683 g)和SGL, II -2 (0.326 g)。 2.2 多糖SGIr II -2的纯度鉴定及组成分析 取10 mL SGL- II -2饱和糖液进行比旋光度测 定[[51;经高效液相查标准曲线可得糖分子量，实验条 件为SHIMADZU高效液相色谱系统，0. 9% NaCl水 溶液为流动相，流速0.5 mL/min，柱温为40士0.1 cC [6];红外光谱检测特征吸收峰;多糖经甲醇解、硅 烷化可经气相色谱得到单糖组成，气相色谱条件为 气化300℃，检测300℃，柱温120℃(保持2 min)， 程序升温8 9C /min至250℃(保持30 min) [7l。 2.3 多糖SGIr II -2结构分析 2.3.1部分酸水解 5%多糖SGL- II -2溶液中加人0.05 moUL的三 氟乙酸，80℃水解20 h，离心，沉淀做GC分析;上清 液用无水乙醇蒸除三氟乙酸至中性，然后置透析袋 中以蒸馏水透析24 h,袋外部分干燥做GC分析，袋 内部分乙醇醇析，上清和沉淀部分干燥分别做GC 分析，并对沉淀进行分子量测定。[8l 2.3.2 高碘酸氧化 取多糖SGL II -2干燥糖样25 mg，用少量水溶 解于25 mL容量瓶中，加人12.5 mL的30 mmol/L NaIO4，定容至25 mL，使NaIO4终浓度为15 mmo/Lo 避光于室温下氧化，按一定时间间隔取样，用分光光 度计在223 nn测定吸收值，4d后氧化反应完成， 加乙二醇终止反应，高碘酸氧化完成，NaIO4的消耗 量可以通过分光光度法和用0.00437 N的NaOH滴 定HCOOH产物测定。[2l 2.3.3 Smith降解 将乙二醇处理后的溶液透析48 h，浓缩，加人 NaBH4还原过夜。用50%的醋酸中和至pH为6- 7，用流水及蒸馏水各透析24 h。取1/3体积的样品 干燥后做GC分析，剩余部分加人等体积的I rnol/L 姚S04,25℃水解40 h，用BaC仇中和至pH为6，以 定量滤纸过滤，滤液用蒸馏水透析48 h,袋外部分干 燥做GC分析，袋内部分用无水乙醇醇析，离心，上 层清液及沉淀部分干燥后分别做GC分析。[9] 2.3.4 甲基化分析 取20 mg彻底干燥糖样，溶于6 mL DMSO(以 0.4 run分子筛脱水)，充氮封管，40℃磁力搅拌至糖 样完全溶解为止。加人6 mL NaOH-DMSO混悬液和 3.6 mL CH31，密封，磁力搅拌反应7 min，加人6 mL 蒸馏水终止反应，产物用流水、蒸馏水各透析24 h 后，浓缩，以等体积氯仿萃取至少3次，萃取液合并， 用蒸馏水洗3次，无水Na2SO4干燥24 h,蒸除氯仿 至1 ML左右，甲基化2次后用红外光谱仪检测有无 -OH吸收峰。 向完全甲基化多糖中加85%甲酸1 ML，充氮封 管，100℃水解4h，用甲醇蒸除甲酸至中性，真空干 燥，再加人2 mol/L三氟乙酸2 niL,100℃水解6 h, 用无水乙醇赶除三氟乙酸至中性。加人NaBH4 60 mg还原24 h，加人阳离子交换树脂，磁力搅拌2 h, 过滤，滤液中加人甲醇蒸除硼酸，真空干燥。加乙 配、无水毗陡各0.5 mL，封管，100℃乙酞化2h，用 无水乙醇赶除乙配，真空干燥。〔’。] 2.3.5 13C NMR 取30 mg多糖SGL-11-2样品溶于D20中配成 饱和溶液，以DSS为内标，INOVA-500型核磁共振 仪，125 MHz, 40℃，测13C NMR谱。 3 结果与讨论 3.1 多糖SGL- II -2的理化性质 多糖SGL-11-2为均一级分(见图1)，呈纯白色 天然产物研究与开发 2005 Vol. 17 No. 2 粉末，易溶于水，相对分子量为5.37 x 1了，比旋光度 [a]奢为一23. 25, GC分析表明其单糖组成为葡萄糖 (Glc)和半乳糖(Gal)、二者摩尔比为nG,, : nGal = 12. 31 :1。其IR光谱显示，在3600一3200 cm‘有一OH吸收 峰，2895 cm‘为一CH,-C玩共振吸收峰，1634 cm‘为多 糖水合共振峰，在891 cm‘有吸收峰说明是R糖普键 (见图2)0 0.006 0.004 0 > 0.002 叫甲 一户，.，阅 40 图I 多糖SGG 11-2的HPLC图谱 Fig. 1 The HPLC of SGIrn-2 104，大于释放甲酸量0. 47 mol的两倍，表明其除还 原端和1-6糖基外，尚有只消耗高碘酸而不生成甲 酸的键型:1-2,1-2,6,1-4,1-4,6键。可氧化糖 基占72.76%，其中末端及1-6键占46.98%，未被 氧化糖基占27.24%o 高碘酸氧化产物经NaB风还原，GC分析，检出 Glc，说明G1。存在不被104一氧化的1-3,1-2,3,1- 2,4,1-3,4,1-3, 6,1-2,3,4中的某些键型;未检 出Gal，说明Gal已彻底被氧化。检出大量甘油和赤 鲜醇，说明存在1-,1-2,1-6,1-2,6键型或1} 4,1-4,6键型。Smith降解后，袋内沉淀检出Glc，说 明主链中有不被高碘酸氧化的键型。 3.2.3 甲基化产物的GC-MS分析 多糖SGL- II -2的甲基化产物的GC, GC-MS分 析结果见图3及表to 甲基化结果表明其中Gle和Gal的摩尔比为 12.28:1，与纯糖GC结果相一致。Glc位于非还原 末端，GI。有1-3 ,1-6、 1-4,6, 1-3,6的连接方 式，Gal连接方式为1-4。此结果与多糖组成分析、 部分酸水解、高碘酸氧化、Smith降解等结果一致。 表1 多糖SGI,n-2的甲基化产物分析结果 Table 1 Methylation analyses of SGI-11-2 甲基化单糖 Methylated sugai 主要离子碎片 Major fiagments(m/z ) 键型 摩尔比 Mode of linkage Molar ratio 0.2308 ? ? ? ???? ? ? ? ? ? ? ? ， ? ? ? ? 2,3,4,6-Glc 43, 45, 71, 87,117,129,145,161， 2,4,6-Glc 43, 45, 87, 101, ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?????????? ???? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 2,3,4-Glc 129,161 43, 87, 99, 0.2323 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 X Axis Title 129,161,189 图2 多糖SGIG II -2的IR光谱 Fig.2 IR Spectrum of SGI-11-2 2, 3-Glc 2,4-Gle 43,101 43,87, ,117, 117,129,189 1-4,6 1--"3,6 0. 0. ? ? ? ? 2,3,6-Gal 43, 45, 97, 99, 101, 吞“ ，，“ . ，闷.‘‘，.沪 _ _ 一 ~一 ~~~~~~~~~~~碑，，，，， 3.2 结构分析 3.2.1部分酸水解产物分析 多糖Sclr II -2部分酸水解后，乙醇沉淀得白色 粉末，经GC分析为Glc，分子量为3.22 x 1护，说明 G1。构成主链的核心结构;袋外部分检出Gal, Glc，说 明二者可以形成支链或主链的末端残基;袋内醇析 上清检出Glc，说明Glc可以形成支链或主链边缘。 3.2.2’高碘酸氧化及Smith降解产物分析 多糖SGL- II -2经104-氧化，紫外光谱223 rim 检测反应完全后，测得每摩尔己糖消耗1. 19 mol 3.2.4 13C NMR分析 多糖SGL II -2的‘3C NMR图谱如图4, 主要异头碳的化学位移均大于105 ppm，说明 Glc和Gla均呈R构型，67一70 ppm间没有信号，说 明C(6)没有发生取代，78一85 ppm间有信号，说明 C-2, C-3和C一中有被取代的，此结果与甲基化结果 相‘致。 通过以上分析，我们可以推断多糖SGL- II -2可 能具有以下结构:它的主链由葡萄糖基以1-3,1- 6糖昔键连接，平均每十个己糖基有2个分支，分支 2005 Vol. 17 No. 2 赵桂梅等:灵芝抱子粉水溶性多糖的分离、纯化及结构研究 185 点在3-0和4-0上，分支末端残基为Gle,(1-4) Gal 位于侧链。 Abundance 24.00 25.00 26.00 27.00 28.00 29.00 30.00 31.00 32.00 33.00 34加 35.00 Time 图3 多糖SGL II -2的甲基化产物的GC图谱 Fig. 3 The GC pattern of methylated SGI,11-2 ??? ?? ? ? ???? ?? ? ??? ?? ?????? ?????? ?????? ???，?? ?? ?，?? ??? ?? ??? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ? ?? ?? ??? ? ????? ??? ?? ??? ?? ????? ? ????? ??? ??? ?????? ? ?? ??? ? ?? ? ? ? ? 、? ?? ? ? ?? ?? ? 、? ? ? ? ? ? ?? ? ?? 孙)，et al. 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