大脑白质有髓神经纤维髓鞘超微结构定量研究的体视学方法

CHINESE JOURNAL OF ANATOMY Vo1．32 No．5 2009 解剖学杂志 2009年第 32卷第 5期 大脑 白质有髓神经纤维髓鞘超微结构定量研究的体视学方法 李 琛 。 杨 妹 。 张 伟。 唐 勇 △ (重庆医科大学，1附属第一医院神经内科，2组织学与胚胎学教研室，3生命科学院，重庆 400016) 摘要 目的：运用新的体视学方法研究大鼠白质有髓神经纤维髓鞘超微结构，以期为以后各种有关髓鞘超微结构的相关研 究提供可靠的方法学依据。方法：6～8月龄雌性 Long—Evans大鼠。运用电镜技术及相应的体视学方法计算白质内有髓神 经纤维的总长度、有髓神经纤维髓鞘总体积、有髓神经纤维及轴突直径 、髓鞘断面面积、髓鞘内外周长、髓鞘平均厚度。结 果：获得了正常 6～8月龄雌性 Long-Evans大鼠有髓神经纤维总长度及髓鞘超微结构的各项数据，两种不同方法得到的髓 鞘平均厚度并没有显著性差异。结论：把新的体视学方法和电子显微镜结合起来定量研究了大鼠大脑白质有髓神经纤维 髓鞘超微结构，所描述的方法为以后进行髓鞘超微结构的定量研究提供了有用的工具。 关键词 大脑；白质；有髓神经纤维；髓鞘；体视学；大鼠 Stereological methods for quantitative investigation in myelin sheath ultrastructure of myelinated fibers in white matter of brain Li Cheng ～ ，Yang Shu ～ ，Zhang Wei ，Tang Yong ’。’。 (1．Department of Neurology，First Affiliated Hospital；2．Department of Histology and Embryology 3．College of Life Sciences，Chongqing Medical University，Chongqing 40001 6，China) Abstract Objective：To investigate the myelin sheath ultrastructure of myelinated fibers in rat white matter of brain and to provide methods for the future related quantitative studies on the myelin sheath ultrastructure．Methods：5 adult(6-8 months)Long-Evans rats were used．The total length of myelin fibers，the total volume of myelin sheathes of myelinated fi— bers，the mean area of myelin sheath profiles，the mean perimeter of myelinated fiber profiles and axon profiles，mean diam— eter of myelinated fibers and axons of myelinated fibers and thickness of myelin sheaths in the white matter were investigated with transmission electron microscopy and stereological techniques．Results：The present study obtained data of both the to— tal length of myelinated fibers and the myelin sheath ultrastructure of myelinated fibers in the white matter of 6-8 month old female rats．Conclusion：The present study combined the new stereological techniques and transmission electron microscopy to quantitatively study the myelin sheath ultrastructure of myelinated fibers in rat white matter．The stereological techniques described in this study proved tO be very useful tools for the future related quantitative studies on the myelin sheath ultra— structure 0f myelinated fibers． Key words cerebrum；white matter；myelinated fiber；myelin sheath；stereology；rat 在正常老年大脑__]]，在铜鳌合剂盟 、三乙基锡[3]以 及溶血卵磷脂中毒_4j，严重的糖尿病l_5]，蛋白脂蛋白缺 乏／过多的转基因动物 ]，多发性硬化[7J等均存在中枢 神经系统有髓神经纤维脱髓鞘改变。而在以往的研究 中多是基于对髓鞘超微结构的定性观察，或者以定性 观察到的髓鞘存在改变的有髓神经纤维占整个观察有 髓神经纤维的百分比来粗略反映问题 ，如何准确定 量研究有髓神经纤维髓鞘超微结构，国内、外尚未见报 道。因此，本研究利用电子显微镜与新的体视学方法 *国家人事部 2005年度高层次留学人才回国工作资助经费；国家自然 科学基金(30440082)；国家自然科学基金(30572075)；教育部留学回 国人员科研启动基金；重庆市自然科学基金(CSTC，2005BB5034) △通讯作者，E mail：ytang062@yahoo．com．cn 收稿日期：2008—10—21；修回日期：2009 05～21 — - — — 588 --—— 定量研究大脑白质内有髓神经纤维髓鞘，为以后的同 类型研究提供较为完整的方法学借鉴。 1 材料和方法 1．1 动物 采用 5只 6～8个月雌性 Long—Evans大鼠。 1．2 标本固定与取材 2．5 水合氯醛对大鼠进行腹腔麻醉，每公斤体 质量给予 10 mI 2．5 水合氯醛腹膜内注射，待大鼠 被麻醉后进行灌注固定。打开被麻醉大鼠胸腔暴露 心，将灌注用针头插入左心室同时剪开右心耳，打开 灌 注泵 进 行 灌 注。采 用 DHL-3型灌 注泵，先 以 40 ml／min的速度用 0．9 生理盐水冲洗 80 ml。再以 20 ml／min的速度用 2 9／6多聚甲醛与2．5 戊二醛混合 液 进 行 灌 注 5 00 m l， 以 颈 部 僵 硬 为 灌 注 良好 的标 志 。 取 出整个 大 鼠脑组 织 包 括 嗅球 部 分 ， 去 除 小脑 ， 并 将大脑 左 右半球分开 ， 以 69／6琼脂分别包 埋 左 右 大脑半 球 。 冷却后 切取 2 In m 厚 的连 续 脑 组 织 切 片 (图 1 A ， 1B )。 每侧大脑半球平均切取 10 ～ 13 片 。 每 隔 2 张抽 取 1 个脑组 织切 片 ， 第 1 片则 由前 3 片 中随机 确定 。 在 抽取 的脑组 织 切 片 上 随 机 叠 放 测 点 ， 在 测 点 击 中 白质 的地方取组 织块送 电镜标本 (图 1C )， 平 均 每 只 动物抽 取 电镜标本 4 块 。 1 ． 3 电镜 切 片的制备 将组 织 块 在 4 " C 4 ％ 的 戊 二 醛 浸 泡 固 定 2 h， 经 0． 1 m ol／L P B S (pH 7． 2)冲洗 3 次后 用 锇 酸 (O sO ；)在 4 ℃ 条件下 染色 2 h。 此 后 以 50％ 、 70％ 、 90％ 、 1009／6 乙 醇脱水 ， 之 后 利 用 环 氧丙 烷 脱 水 。 然 后 用 环 氧 丙 烷 与树脂不 同比例溶液浸润组 织块 ， 最 后 在 100％树脂 中 浸泡 。 为保证 获得 各 向同性 切 片 ， 将 经 过 电镜染 色 的 标本按 “ 球切法 ” [8j(图 1 D )处 理 ， 即将 浸 泡 好 的组 织 块 放入 直径为 5 m m 的球 形 小 腔 中 ， 然 后 用 树 脂 充 填 小 腔 ，树脂变硬后 包 埋 的标 本就 形 成 了球 形 ， 然 后 滚 动小 球 ，再按常 规 电镜 包 埋 方 法 包 埋 小 球 。 从 包 埋 好 的 每 个 电镜组织块 随机 切取 1 张 60 n Iil 厚 的超 薄切 片 。 在 20 000倍放大 的透射 电子 显 微镜下 ， 从 每张超薄切 片放 大随机选取 8～ 12 个 视 野 进 行 拍 照 ， 平 均 每个 动 物 拍 得 4 0 张 白质神经 纤 维 的电镜照 片 。 1．4 体 视 学分 析 1 ． 4 ． 1 白质体积计算 在解剖显 微镜 下 ， 在每 一 片 脑 组 织 薄片上 随机 叠 放 计 数 点 ， 记 录 击 中 白质 的测 试 点 的个 数 (图 2A )， 计 算 击 中每 只 动 物 白质 的 总 测 点 数 (∑P 州 )。 利用 卡瓦列里 原理 公 式 [。0计算 白质总体积 ： V Ⅳ M — f× n (p)× ∑P wM (1 ) 式 中 ‰ rⅥ 代表 白质 体积 ；岛 (夕)为 每 一 测点 所 对 应 的面 积 (0． 39 IT lrn 。)；t为切 片厚度 (2 m m )。 1 ． 4 ． 2 白质 内有髓 神 经 纤 维 的 长 度 密 度 与 总 长 度 在所 得 到 的 电镜 照 片 上 叠 加 无 偏 计数 框 ， 计数 完 全 落 在计数框 内和 只 与计 数线 (虚线 )相 交 的有髓 神经 纤 维 断面 ， 任何 与禁 止 线 (实线 )相 交 的 断 面 均 被 排 除在 外 不 被计数 (图 2B )。 白质 内有 髓 神经 纤 维 的 长度 密度 ， L v (m f／w m )，按下 面 公式⋯ 。] 计算 ： L v (埘 厂／w in )= 2x ∑Q (m f)／∑A (fra m P ) (2) 式 中∑Q (rn f)为在每 只 动物 抽样 的所 有 照 片上 所 有无 偏计数框 内计 数 的有 髓 神 经 纤 维 断 面 数 的总 数 ； ∑A (fra m e )为 在 每 只 动 物 使 用 的 无 偏 计 数 框 的 总 面积 。 白质 内有髓神经 纤维总长度 ，L (m f， w rn )， 的计算 公式 凹。 o] 为 ： L (m 厂， w m )一 L v (卅 fl／w m )× V (w rn ) (3 ) 图 1 大脑 白质 组 织 随机 抽样 及 各 向 同性切 片制 作 F ig 1 Illustration ofthe w ay to sam ple tissue blocks from w hite m atter and the w ay to m ake isotro pic sections from the sam ples blocks A ! Illu stration ofhow to m ake system atic random slices ofrat brain ． T he brain w as em beddedin side sm allbox w ith agar， a 2 rflnq scale paper being put in the bottom ofthe box ． A fter hardened， the brain w as system atically cu t acco rdin g to the scale paper u sing the sam e size sm allbox w ithou ttw o bottom sides。 the first on e being cu t random ly； B ： 2 n~．nl system atic random slices ofrat brain w ere show n ； C ： T he poin t grid w as random ly pu t on the 2 m m brain slices． T he tissue blocks w ere cu t fo r the electron m icroscope specim en s w here the poin ts in the poin tgridhit w hite m atter， as indicatedby arrow ； D ： Isecto r m odel， the n um bers on the m ouldindicated that there w ere 5 - rnln diam eter sphericalholes u n der the num bers ； E ： A ben t m ouldw as illu stra— ted． T he sphericalholes w ere filledw ithem beddin g m edia． A fter the em bedding m edia go tharden ed， the specim en s becam e spheres ； F ： A n am plifiedim — age ofa sphericalspecim en w as show n ． T he w hite m atter blockw as previou sly stain edblackby u ran ylacetate． 式 中 L 。 (m f／w m )为 白质 内有 髓 神经 纤 维 的长 度 密度 ；V (砌 ” )为 白质总体积 。 1 ． 4 ． 3 白质 内有 髓 神经 纤 维髓 鞘 的体积 密度 与 总体 积 在 电镜照 片上 随 机 叠 加 测 试 点 ， 分别 计 数 落在 有 髓神经 纤维髓鞘上 的测 点数 P (1H S )， 以 及 落在整 个 照 片 内的 白质测点数 P (让 伽 )(图 2C )， 白质 内有髓神经 纤 维体积密度 ，V v (聊 s／观 ，” )，按下 面公式ll。一 计算 ： V v (m s~w in )一 ∑P (m s)／∑P (让 ，m ) (4 ) 式 中∑P (m s)为 每 只 动物计数 的落 于 有髓 神经 纤 维髓鞘上 的总测 点数 ；∑ P (w m )为每 只 动物落 于 白质 上 面 的测点总数 。 白质 内有髓神经 纤维髓 鞘总体积 ，V (m s ， w m )，按 下面公式 Em ’计算 ： 式 中 U (m s／w m )为 白质 内有 髓 神经 纤 维 髓鞘 的 体积密度 ；V (w m )为 白质体积 。 1．4 ． 4 白质 内有髓神经 纤维髓 鞘断面 面 积 在 20 000 倍照 片上 随机 叠 加 无 偏计 数框 ， 根 据禁 线法 则 确 定 待 测有髓 神 经 纤 维 断 面 。 然 后 再 随 机 叠 加 等距 测 试 点 (图 2D )，分别计数落在有髓神经 纤 维髓鞘上 的测 点数 ∑P (m s)、 有 髓 神经 纤维 上 的测 点数 ∑ P (Ⅲ _厂)和 轴 突 上 的测点数 ∑P (nz )， 白质 内有髓神经纤维髓鞘断面 面 积 ，a (Ⅲ s)，按 下 面公式 E：o M J 计算 ： a (m s)一 ∑P (m s)× 口 (户) (6) 式 中 n (T K tS )代表 有 髓 神 经 纤 维髓 鞘 断 面 面 积 ；a (声)为每 一 测 点所 对 应 的 面 积 (2． 4 8× 10q ffm 。 )。 以 同样的公式可 以计算得 到有髓神经 纤 维断面 面 积 以及 轴突断面 面积 。 利用所 得 到 的这 些 不 同的断面 面积计 算它们之 间的 比值或差值来反 映髓鞘 的变化 。 1．4 ． 5 白质 内有髓 神经 纤 维髓 鞘 断面 周 长 在所 得 到的电镜照 片上 随 机 叠 加无 偏计 数 框 ， 根 据禁 线 法 则 确定待测有髓 神经 纤 维 断面 ， 然 后 再 随 机 叠 加 等距 测 试线(图 3)，计数测试 线与每个待测有髓 神经 纤 维 断面 外边 界 的交点数 ∑ J ， 白质 内有髓 神经 纤 维髓 鞘 断 面外 一 590 ～ 边界周长 ，b(m s)，按下 面公式‘” ’计算 ： b(m s)= zr／2 × d× ∑ ， (7) 式 中 d 为测试 线 间距 (0． 25 fire )。 同理 我 们 可 以 计数测 试线与每个 待测有髓 神经 纤 维 断 面 内边界 的交 图 3 在所 得到 的 电镜 照 片上 随机 叠 加 无 偏计 数 框 ， 根 据 禁 线 法 则 确 定 待测 有髓 神经 纤 维 断面 ， 然 后 再 随机 叠 加 等距 测 试 线 。 计数测 试 线与每个待测 有髓神经 纤 维断面髓鞘 内边 界 的交 叉 点数 (∑ ，)；计 数测 试线与每个待测有髓神经 纤 维 断面髓鞘外边界 的交 叉 点数 ． F ig 3 T he unbiased cou n tin g fram e and the equidistan t test lin es w ith a lin e separation ， w ere random ly pu t oil the random ly captu red im — age． F or those m yelin atedfibers sam pledw ith the u nbiased cou n t— in g fram e ， the n um ber ofin tersection s ， ∑ 1 ， betw een the inn er boundary as w ellas the ou ter bou ndary ofthe m yelin atedfiber an d test lines w ere c0 1J n ted． 点数 ，并计 算得 到髓 鞘 内周 长 。 可 根 据 所 得 的有 髓 神 经 纤维髓鞘 内 、 外周长 计算得 到两 者 间 比值或 内 、 外周 长差 以反 映髓 鞘 的改变 。 1 ． 4 ． 6 白质 内有髓 神经 纤 维 直 径 及 有 髓 神经 纤 维 轴 突的直径 在所 得 到 的 电镜 照 片 上 叠 加 无 偏 计 数 框 ， 测量落在计数框 内和 只 与计 数线 (虚线 )相 交 的有髓 神 经 纤 维断面 的直径 。 首先找 到有髓 神经 纤 维 断 面 的最 长轴 ， 与这个 最 长 轴 相 垂 直 的有 髓 神 经 纤 维 断 面 的横 径 中最 长 的 一 条便 是 这 一 有 髓 神经 纤 维 的 直 径 『】”一 (图 4 )。 同理 可 以测 量得 到轴突 的直径 (图 4 )， 有髓 神经 纤 维直径 与有髓 神经 纤 维轴 突直径 的差 值 除 以 2 即为髓 鞘平均厚度 的近似值 。 1．4 ． 7 白质 内有髓 神 经 纤 维 髓 鞘 厚 度 在 所 得 到 的 电镜照 片 上 同 时 随 机 叠 加 无 偏 计 数 框 以 及 等 距 测 试 线 。 将根 据禁线法所 确定 待测 有髓 神经 纤 维髓 鞘 断 面 内边 界与测试 线 的交点按顺 序编号 ， 总数 为 J ， 从 前 I／4 个 号码 中 随机 选 取 一 个 作 为 第 1 个 测 试 髓 鞘 厚 度 的 点 ，第 2 个 为 1 号 点位 置 + 1／4 ， 第 3 个 为 2 号 点 位 置 + I／4 ，第 4 个 为 3 号点位 置 + I／4 ， 在这 4 个 点 处分 别 测量从髓 鞘 的 内边 界 到外 边 界 最 短 的距 离 ， 则 其平 均 值为髓鞘 的厚度 _1’j (图 5 )。 1 ． 5 统 计 学处 理 经 过 正 态 分布检验后 ， 利用 f检验进行 两 种 不 同的 方法得 到 的 白质 内有髓 神经 纤 维髓鞘平 均厚 度 的差 异 性 比较 ， 以 P < O ． 05 为 检验 水 准 。 然 后 利 用 所 得 到 的 髓鞘 平 均 厚 度 ， 以 0 ～ 0． 1 5 肛m 、 0． 1 5 ～ 0． 3 肚IT I 、 0． 3 肚m 以 上 3 个分布范 围分 别计数每 一 只动物不 同髓 L 一 591 一～ ． 一一一一一一～一～ ～一一一～一～～一一一一 ～一 一一～一～一一～一～～～一一～一～一～一一一一一～一 卧一 ～慨一慨一一撇曲一一咖 L 血一一一一㈨一一一曲删一 ? 鞘厚度分布的有髓神经纤维占所有有髓神经纤维的百 分比，再利用这个百分比与所得到的每一只动物的有 髓神经纤维总长度相乘便得到不同直径范围的有髓神 经纤维总长度。同时进行了有髓神经纤维髓鞘厚度分 布规律在两种不同髓鞘厚度测试方法之间的比较。 2 结果 当运用体视学方法的原理于某一项具体研究时， 非常重要的一点就是如何决定抽样设计方案。在本研 究中，首先切取 2 mm厚的脑组织连续切片，系统随机 抽取脑组织切片。“球切法”包埋，做 60 nm超薄切片， 在20 000倍下从每张超薄切片上随机选取 8～12个视 野进行拍照。在获得的照片上，根据体视学抽样要求 确定测试点的疏密、测试框的大小、测试线的距离、厚 度测量时测试点位置的随机选择等抽样设计方案。最 后运用此抽样设计方案对 5例动物进行了初步的试点 研究，试点研究的结果见表 1。6～8月龄 Long—Evans 大鼠白质平均体积为(115±5．43)mill。，白质内有髓神 经纤维髓鞘总体积为(33．8±2．74)rnm。，有髓神经纤 维髓鞘平均断面面积为(0．32-4-0．02)／,m 。有髓神经 纤维髓鞘平均外周长为(3．394-0．32) m，有髓神经纤 维髓鞘平均内周长为(2．6O±0．30)ban。 大脑白质内有髓神经纤维平均直径为(0．67 4- 0．03),um，有髓神经纤维轴突平均直径为 (0．43-4- 0．03)“1TI，以有髓神经纤维直径与轴突直径差值的二分 之一方式求得的髓鞘平均厚度为(0．12_4-0．00)／zm，直 接测得 的有髓神经纤维髓鞘平均厚度为 (0．12-4- 0．00)“In，两种方法所得到的有髓神经纤维髓鞘平均厚 度没有显著性差别(P>0．05)。在比较两种不同方法 得到的有髓神经纤维髓鞘厚度分布的有髓神经纤维的 总长度时，两种方式得到的髓鞘厚度分布趋势一致，同 时髓鞘厚度在 0．15／,rn以下的有髓神经纤维占了绝大 多数(图6)。两种方法得到的髓鞘厚度分布趋势一致 提示，将来研究白质有髓神经纤维髓鞘厚度时，可运用 直接测量法或简单、易行的间接测量法。 体视学研究的一个重要特点就是可以通过对研究 结果的统计来检验抽样设计是否合适。运用本研 究的抽样设计方案使得到的各项数据的 CE值大多在 1O％以下或接近 lO (表 1)。在大多数生物医学研究 中，以CE值小于 lO 作为抽样设计合适的标志。同 时，由于有体视学抽样方法的保证，在本研究中，仅需 在每只动物计数 200个左右的测试点、交叉点，计数 200个左右的有髓神经纤维断面以及测量 200个左右 的平均厚度等。因此，本研究描述的定量研究大脑白 质有髓神经纤维髓鞘超微结构的体视学方法达到了准 确、高效。 表 1 大鼠白质内有髓神经纤维髓鞘的体视学结果 Tab 1 Stereological results of myelin sheaths of myelinat~ fibers in the white matter of rat 1 2 3 4 5 Mean SEM CE( ) V(t￡ )(rnFll ) Lv(mJ)(km／mm。) L(mf)(km) Vv(ms) (m )(mm3) A(mf)(“m ) A(ms)(um ) A(a)(“m ) Oh(ms)(um) Ib(ms)(um) Db(ms)(um) D(mf)(“m) D(口)(um) [D(m厂)--D(a)]／2(“m) tons)(“m) V(wm)，the mean volume of white matter；Lv(mf)，length density of myelinated fibers；L(mr)，total length of myelinated fibers：Vv(ms)。volume density of myelin sheaths；V (ms)，total volume of myelin sheaths；A(mr)，mean area of myelinated fiber profiles：A (ms)，mean area of myelin sheaths；A(a)，mean area of axonal profiles；Ob(ms)，outer perimeter of myelin sheaths；Ib(ms)，inner perimeter of myelin sheaths：Db(ms)，the difference between outer perimeter and inner perimeter of myelin sheaths；D(mf)，arithemic mean diameter of nerve fibers；D(a)，arithemie mean diame— ter of axons；t(ms)，thickness of myelin sheaths． 一 592 ～ 0 ∞ n 0 曲 站 娼 & & L 躬 ∞ ∞ 眦 ∞ ∞ ∞ ∞ ∞ ∞ C； n C； 0 _。 弘 ∞ ∽ 蝎 妞 文 n ∞ ∞ u 盯 C； 0 盯 鸥 心 L 互 船 0 阳 船 ∞ 骼 文 C； M ∞ ∞ ∞ 鹳 ¨ ∞ 坞 L ∞ c； 强 互 n 加 ¨ L L C； 图 5 在所得 到 的 电镜照 片 上 同时 随 机 叠 加 无 偏计数框 以 及 等 距 测 试 线 。 将根据禁线法所 确定待测 有 髓神 经 纤 维 髓鞘 断 面 内边 界 与 测 试 线 的 交点按顺 序编 号 ， 总数 为 J ， 从前 I／4 个 号 码 中 随 机 选 取 一 个 作为第 1 个 测 试 髓 鞘厚度 的点 ， 第 2 个 为 1 号点位置 + J ／ 4 ，第 3 个 为 2 号点位置 + I／4 ，第 4 个 为 3 号 点位置 + U 4 。 如 图 所 示 ， 这 里 一 共 有 1 2 个交点 ， 我 们随 机 选 择 2 号 为开 始测 量髓鞘 厚 度 的地 方 ， 则其后 在 5 、 8、 li号 位测 量 髓 鞘厚 度 ， 测 量 从 髓 鞘 的内边 界 到 外边 界 最 短 的距 离 tl 、 t2 、 t3 、 t。 ， 则其平均值为髓 鞘 的厚 度 ． F ig 5 A llm yelinated fiber profiles com pletely in side the cou nting fram e or partly in side it bu t n ot touching or in tersectin g the fu ll— draw n 1in es w ere sam pled． T he n um ber ofin tersection s， ∑ I ， betw een the in ner boundary m yelinatedfiber profile and the equidistan t test lin es w ere co un ted (in this illu strated figure ， there w ere 12 in ter～ section s betw een inn er bou ndary an dtest lin es)． In this illu strated figu re ， the shortestdistan ces from the in ner boundary to the ou ter boundary at fo ur position s w ere m easu red， w hich w ere indicated by tl， t2 ， t3 and t4 ． T he m ean thickn ess ofm yelin sheathequ aled to the m ean value oftl， t2 ， t3 an d t4 ． T he first positio n w as ran — dom ly chosen in the firstI／4 - in tervalfin the giv en ex am ple 。 】is 12 S O thatthe firstposition shouldbe cho sen from random num ber be— tw een 1 an d 3 )． In the illustrated figure ， in tersectio n 2 w as ran — dom ly chosen as the first position ， the second po sition should be in tersection 5 ， the thirdposition in tersection 8andthe fou rthposi tion in tersection 】l_ 3 讨 论 迄 今为止 ， 国 内 、 外 尚未见 对 大脑 白质有 髓 神 经 纤 维髓鞘结 构进 行 准 确定 量 研 究 的 研 究 报 道 。 因此 ， 根 据新 的体视 学 方 法 的最 基 本 原 理 设 计 了本 研 究 项 目 。 在方法学上 ， 本研 究 所 描 述 的方 法 比 以 往 的相 关研 究 60 4 5 30 15 0 l5 30 T hickness ofm yelin sheath(vim ) 图 6 不 同髓鞘厚 度 的有髓神经 纤维 总长 度分 布 图 F ig 6 A bsolute fiber distribution ofthe totallength ofthe m yelinated nerve fibe rs in the w hite m atter ofyoung m ale rat 使用 的方法 具有更 多优势 。 3 ． 1 均 匀 系统 随机 抽 样 体视学 的基 本抽样 原 则是要 让 所研 究 的整 个 区 域 内的各个 部分 有 均 等 的机 会 被抽 取 。 因此 ， 在设 计 本 研 究方 案时严格贯 彻 均匀 随机 抽样 原 则 。 将 随机 选 取 的 一 侧半球按 照 冠 状 面 切取 2 m m 厚 的连 续 等距 脑组 织 切 片 ， 第 1 片切 取 的位 置 从 额 极 开 始 随机 选 取 。 在 切取 12 片 白质脑 片 中每 3 张脑组 织 薄 片抽 取 1 张 ， 即 每隔 2 张抽取 1 张脑 组 织薄片 ，第 1 片则 由前 3 片 中随 机确定 。 在 抽 取 的脑 组 织 薄 片上 随机 叠 放 等距 测 点 ， 在测 点击 中 白质 的地 方 抽 取 组 织 块 送 电镜标 本 ， 每 只 动物抽取 电镜标本 4 块 。 这 样 的抽样方 式保证 在 整 个 白质 内均匀随机 的抽样 ， 因此 ， 在 白质 中走行 的所 有有 髓神经 纤 维都 有 均 等 的 机 会 被 抽 样 ， 最 终 的抽 样 也 很 好地 代表 了整 个 白质 区域 。 3 ． 2 三 维 空 间 内的 均 匀抽 样 在本次研 究 中在三 维 空 间 内均匀抽 样 原 则 的应 用 也 保证 了白质 内有 髓 神经 纤 维 以及 髓 鞘的 各项 指标 被 无偏估计 。 走行 于 白质 中的 长 管状 的有髓神经 纤 维 被 一 个平 面截 断 时 ， 在 这 个 横 截 面 上 有 髓 神 经 纤 维 断 面 的多少 便 反 映 出有 髓 神经 纤 维 的 总 长 度 。 然 而 ， 当在 一 张二 维切 片上 计 数纤 维 长度 时有 一 个 必 须 存在 的先 决条件 ， 即每 一 个 断面 必 须 在 一 张 各 向 同性 切 片 上 被 计数或者神经 纤 维 自身是各 向同性 。 同样 当测 量 有 髓 神经 纤 维 直 径 ， 髓 鞘 内 、 外 周 长 及 髓 鞘平 均 厚 度 时 ， 均 要 求在各 向同性 切 片上 进 行 测 量 。 在本 次研 究 中各 向 同性 、 均 匀 随 机 切 片 的 取 得 用 “ 球 切 法 ” 予 以 保 证 18j。 将抽取 的组 织块放在 一 个 5 in lT l球形 腔 内 ， 注 入 树脂进 行包埋 ， 待树脂 干 燥 后 将包 裹有 组 织 块 的树 脂 小 球 取 出 ，任意滚 动小球后 再 将小球 进 行 常规 电镜 包 埋 ， 然后 进行 电镜超 薄切 片 的切取 。 以 这 种方 式得 到 的各 向 同 性 、 均匀 随机 切 片保 证 了 神 经 纤 维 在 三 维 空 间 内的各 个方 向上 有均等的机 会被抽取 。 3 ． 3 计 算总量 而 非 密度值 以往 的定 量研 究 多是 基 于 对 二 维 切 片 观 察 ， 以 密 — — 5 93 — — 度值或者存在髓鞘改变的有髓神经纤维百分比来反映 定量信息__】 "]，但密度值或百分比值是无法准确反 映总量变化趋势的。这是因为如果参照空间的体积在 样本制备过程中产生皱缩，那么参照空间内特征物的 密度增加是显而易见的，而不论这时特征物的总量是 没有改变还是有所下降。因此，密度值的估算仅是得 到总量的一个中间步骤，计算总量的另一个关键因素 便是对于参照空间总体积的估算。在本研究中，这种 由仅计算密度值会产生的参照空间“陷阱”问题因卡瓦 列里原理的应用而得到解决。本研究运用卡瓦列里原 理计算出了整个白质的体积，用白质的体积乘以白质 内有髓神经纤维长度密度和髓鞘体积密度便得到白质 内有髓神经纤维的总长度和髓鞘总体积。因此，本研 究结果清晰地反映了白质内有髓神经纤维及髓鞘的 总量。 3．4 两种髓鞘平均厚度测量方法的比较 在本次研究中设计了两种得到髓鞘平均厚度的方 法，并且比较了这两种得到髓鞘平均厚度方法间是否 存在着差异。利用这两种方法得到髓鞘平均厚度并不 存在显著性差异，不同髓鞘厚度的有髓神经纤维长度 分布图显示通过两种测量髓鞘厚度的方法获得的有髓 神经纤维长度分布趋势是一致的。在各向同性切片 上，利用无偏计数框抽取有髓神经纤维，然后随机叠加 测试线，再随机选择测试点，最后在这些随机选择的测 试点上测量有髓神经纤维髓鞘的平均厚度，称这种方 法为直接测量法。这种直接测量法完全满足了体视学 的基本原理，也应是今后定量研究髓鞘厚度的首选方 法。有髓神经纤维直径与轴突直径差值除以 2来获得 髓鞘平均厚度的方法为近似测量法。近似测量法简 单、易行，但通过这种方法获得的值是髓鞘厚度的近似 值。所测的髓鞘厚度越不规则，近似测量法与直接测 量法获得的值差别越大。在本研究 中，两种方法获得 的髓鞘平均厚度没有显著性差异，这一结果提示所测 量的髓鞘厚度变异程度不是很大。 总之，本次研究严格遵循无偏体视学的各种抽样 原则，建立了进行白质内有髓神经纤维总长度和髓鞘 总体积、髓鞘断面面积、髓鞘内外周长、髓鞘平均厚度 测量的研究方法，为以后的相关研究提供了更为可靠 - - -— — 594 ·—— 有效的方法依据。 参 考 文 献 [1] Peters A，Moss M B，Sethares C．Effects of aging on myelinated nerve fibers in monkey primary visual cortex[J3．J Comp Neurol， 2000，419(3)：364 376． [2] Skripuletz T，Lindner M，Kotsiari A，et a1．Cortical demyelina— tion is prominent in the murine cuprizone mode1 and is strain-de— pendent[J]．Am J Pathol，2008，172(4)：1053—1061． [3] Chang L w．The neur0to xjcoJogy and pathology of organomereu— ry，organolead，and organotin[J]．J Toxicol Sci，1990，Suppl 4： 125—151． [4] Blakemore W F Observations on remyelination in the rabbit spi— nal cord following demyelination induced by lysoleeithin[J~．Neu— ropathol Appl Neurobiol，1978，4(1)：47—59． [5] 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