2蛋白质

nullnull第二章 蛋白质化学 蛋白质的氨基酸组成肽的结构与功能蛋白质的结构蛋白质分子结构与功能的关系 蛋白质的性质蛋白质的分类null蛋白质 是由许多不同的α-氨基酸按一定的序列通过酰胺键（肽键）缩合而成的，具有较稳定的构象并具有一定生物功能的大分子。null蛋白质的元素组成C（50~55%）、H（6~8%）、O（20~23%）、N（15~18%）、 S（0~4%）… 有效蛋白质还含有：P、Fe、I、Cu、Zn、MoN的含量平均为16%——凯氏（Kjadehl）定氮法的理论基础 蛋白质系数：6.25即1g蛋白质的N相当于6.25g蛋白质 null一、蛋白质的分类1. 蛋白质形状球状蛋白 血清球蛋白、大豆球蛋白纤维状蛋白 角蛋白、胶原蛋白膜蛋白 近似球形蛋白质分类蛋白质分类结构伸展，呈纤维状，长/宽>10，不溶于水或稀盐溶液，机械强度高，在生物体充当结构的角色，如胶原蛋白和角蛋白球状蛋白质结构紧密，呈球状，长/宽≤3～4，溶于水，如血红蛋白和胰蛋白酶等膜蛋白则定位于各种生物膜上，其结构有限，到目前为止，只有全α-螺旋或全β-折叠结构，一般由多个结构域组成，但至少有一个结构域是脂溶性的，如细菌视紫红质null2. 分子组成 简单蛋白 结合蛋白核蛋白糖蛋白与蛋白聚糖脂蛋白色蛋白磷蛋白 血清清蛋白.卵清蛋白 血清球蛋白.大豆球蛋白玉米蛋白米.麦蛋白鱼精蛋白胸腺蛋白 角蛋白、胶原蛋白null3. 功能酶支架蛋白调节蛋白贮存蛋白质转运蛋白质运动蛋白质防御蛋白和毒蛋白受体蛋白质结构蛋白特殊蛋白null蛋白质的生物学意义1. 结构功能2. 催化功能3. 运输功能4. 运动功能5. 免疫功能6. 调节功能7. 贮藏功能8. 生物膜功能null二、蛋白质的组成单位—氨基酸氨基酸 是蛋白质的基本组成单位。从细菌到人类，所有蛋白质都由20种氨基酸（20 standard amino acids)组成。（一）氨基酸的结构通式：19种氨基酸具有一级氨基（-NH3+）和羧基（-COOH）结合到α碳原子（Cα），同时结合到（Cα）上的是H原子和各种侧链（R）；Pro具有二级氨基（α-亚氨基酸）nullCα如是不对称C（除Gly），则： 具有两种立体异构体 [D-型和L-型] 2. 具有旋光性 [左旋（-）或右旋（+）]null（二）氨基酸的分类根据R的化学结构 （1）脂肪族氨基酸：1）疏水性：Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Met、Cys；2）极性：Arg、Lys、Asp、Glu、Asn、Gln、Ser、Thr （2）芳香族氨基酸：Phe、Tyr （3）杂环氨基酸：Trp、His （4）杂环亚氨基酸：Pro根据R的极性 （1）极性氨基酸：1）不带电： Gly、Ser、Thr、Asn、Gln、Tyr、Cys；2）带正电：His、Lys、Arg；3）带负电：Asp、Glu （2）非极性氨基酸：Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Met、Pro、Trpnull2-2 蛋白质氨基酸的分类与结构（1）null表2-2 蛋白质氨基酸的分类与结构（2）null表2-2 蛋白质氨基酸的分类与结构（3）nullnullnullnullnullnull必需氨基酸VS非必需氨基酸必需氨基酸是指人体必不可少，而机体内又不能合成、必须从食物中补充的氨基酸。如果饮食中经常缺少它们，就会影响健康。必需氨基酸共有10种：Lys、Trp、Phe、Met、Thr、Ile、Leu、Val、Arg和His。人体虽能够合成Arg和His，但合成的量通常不能满足正常的需要，因此这两种氨基酸又被称为半必需氨酸。-Tip MTV Hall 余下的氨基酸则属于非必需氨基酸，动物体自身可以进行有效的合成，它们包括：Ala，Asn、Asp、Gln、Glu、Pro、Ser、Cys、Tyr和Gly。笨（苯丙氨酸）蛋（蛋氨酸Met）精（精氨酸）来（赖氨酸）宿（苏氨酸）舍（色氨酸）住（组氨酸）亮（亮氨酸）凉（异亮氨酸）鞋（缬氨酸） 非蛋白质氨基酸非蛋白质氨基酸这些氨基酸通常以游离的形式存在，具有特殊的生理功能或者作为代谢的中间物和某些物质的前体，它们并不能参入到多肽和蛋白质分子之中。例如在动物体内充当神经递质的-氨基丁酸（Gamma-aminobutyric acid，GABA）、作为维生素泛酸（pantothenic acid）组分的-丙氨酸和参与尿素循环的鸟氨酸（ornithine）和瓜氨酸（citrulline）。nullnull（三）氨基酸的重要理化性质一般物理性质 无色晶体，熔点极高（200℃以上），不同味道；水中溶解度差别较大（极性和非极性），不溶于有机溶剂。 2. 两性解离和等电点 氨基酸在水溶液中或在晶体状态时都以离子形式存在，在同一个氨基酸分子上带有能放出质子的—NH3+正离子和能接受质子的—COO-负离子，为两性电解质（两性离子、偶极离子)。3. 化学性质（1）与茚三酮的反应：Pro产生黄色物质，其它为蓝紫色。在570nm（蓝紫色）或440nm（黄色）定量测定（几μg）。null调节氨基酸溶液的pH，使氨基酸分子上的—+NH3基和—COO-基的解离程度完全相等时，即所带净电荷为零，此时氨基酸所处溶液的pH值称为该氨基酸的等电点（pI）。 特征常数 （当氨基酸相互连接成蛋白质时，只有其侧链基团和末端的α-氨基，α-羧基是可以离子化的。正离子 偶极离子 负离子null酸性氨基酸pI:2.8-3.2 中性氨基酸pI:5.0-6.3 碱性氨基酸pI:7.6-10.91）酸碱滴定（滴定曲线）2）根据pK值（该基团在此pH一半解离）计算： 等电点等于两性离子两侧pK值的算术平均数。 酸性氨基酸 碱性氨基酸氨基酸等电点的确定：nullnullAla、Lys和Asp的电泳分离null离子交换层析分离氨基酸的原理null所有氨基酸及具有游离α-氨基的肽与茚三酮反应都产生蓝紫色物质，只有脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应产生黄色物质。null（2）与甲醛的反应：氨基酸的甲醛滴定法中和滴定 羟甲基氨基酸 二羟甲基氨基酸 1.测量氨基酸含量 2.大体测定蛋白质合成或水解速度null（3）与2,4-二硝基氟苯(DNFB)的反应弱碱性DNP-氨基酸（黄色）测定多肽或蛋白质的N端氨基酸-Sanger法null丹磺酰氯法取代DNFB测定蛋白质N端氨基酸，灵敏度高null（4）与异硫氰酸苯酯（PITC）的反应（Edman降解）pH8.3无水HF重复测定多肽链N端氨基酸排列顺序，设计出“多肽顺序自动分析仪”null（5）与亚硝酸反应 氨基酸在室温下与亚硝酸反应生成氮气 计算氨基酸的含量——范斯莱克法（ Van Slyke） （6）与荧光胺反应： 根据荧光强度测定氨基酸含量（ng级）。激发波长λx=390nm，发射波长λm=475nm。（7）与5,5′-双硫基-双（2-硝基苯甲酸）反应：null硫代硝基苯甲酸测定Cys含量（pH8.0λ412nm的摩尔消光系数ε=13600）null三、肽（一）肽的结构 ——一个氨基酸的α-羧基和另一个氨基酸的α-氨基脱水缩合而成的化合物。 氨基酸之间脱水后形成的键称肽键（酰胺键）。 当两个氨基酸通过肽键相互连接形成二肽，在一端仍然有游离的氨基和另一端有游离的羧基，每一端连接更多的氨基酸。氨基酸能以肽键相互连接形成长的、不带支链的寡肽（25个氨基酸残基以下）和多肽（多于25个氨基酸残基）。多肽仍然有游离的α-氨基和α-羧基。肽链写法：游离α-氨基在左，游离α-羧基在右，氨基酸之间用“-”表示肽键。H2N-丝氨酸-亮氨酸-苯丙氨酸-COOHSer-Leu-Phe（S-L-F）null（二）肽的理化性质： ①肽键的酰氨氢不解离，肽的酸碱性质主要决定于肽键中的游离末端α-NH2、α-COOH及侧链R基上的可解离基团； ②肽中末端α-羧基的pKa值比游离氨基酸的大，末端 α-氨基的pKa值比游离氨基酸的小； ③游离的α-氨基、 α-羧基和R基可发生与氨基酸中相应的类似反应，如茚三酮反应等； 肽 键具有部分双键的性质肽键比一般碳-氮单键短与肽键相连的氢原子和氧原子呈反式构型肽键不可自由旋转null（1）谷光甘肽（GSH）2GSHGSSG①参与体内氧化还原反应。 （三）生物活性肽的功能②作为辅酶参与氧化还原反应保护巯基酶或含Cys的蛋白质中SH的还原性，使蛋白质或酶处在活性状态。③ SH具有嗜核性，能与外源的嗜电子物质如致癌剂结合，阻断与DNA、RNA或蛋白质结合，保护机体免遭损害。null（3）促肾上腺皮质激素（ACTH） 39肽，活性部位为第4~10位的7肽片段： Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly。刺激肾上腺皮质生长和肾上腺皮质激素的合成和分泌。（2）催产素和升压素 均为9肽，第3位和第9位氨基酸不同。催产素使子宫和乳腺平滑肌收缩，具有催产和促使乳腺排乳作用。升压素促进血管平滑肌收缩，升高血压，减少排尿。null（5） 胰高血糖素 （6）胃肠道活性肽（4）脑肽脑啡肽具有强烈的镇痛作用（强于吗啡），不上瘾。Met-脑啡肽 Tyr-Gly-Gly-Phe-Met Leu-脑啡肽 Tyr-Gly-Gly-Phe-Leuβ-内啡肽（31肽）具有较强的吗啡样活性与镇痛作用。具有相似形状的分子能 够以相似的方式作用具有相似形状的分子能 够以相似的方式作用例如，吗啡、海洛因和其他鸦片类毒品在形状上与内啡肽相似，因此能够与内啡肽的受体结合，产生相似的效应（镇痛）。 null四、 蛋白质的结构 蛋白质是氨基酸以肽键相互连接的线性序列。在蛋白质中，多肽链折叠形成特殊的形状（构象）（conformation）。在结构中，这种构象是原子的三维排列，由氨基酸序列决定。蛋白质有四种结构层次：一级结构（primary），二级结构（secondary），三级结构（tertiary）和四级结构（quaternary）（不总是有）。（一）蛋白质的一级结构（化学结构）一级结构就是蛋白质分子中氨基酸残基的排列顺序，即氨基酸的线性序列。在基因编码的蛋白质中，这种序列是由mRNA中的核苷酸序列决定的。一级结构中包含的共价键（covalent bonds）主要指肽键（peptide bond）和二硫键（disulfide bond）蛋白质的结构层次蛋白质的结构层次一级结构 (1º) : 独特的氨基酸序列，由遗传物质决定。 二级结构 (2º) :多肽链的主链骨架本身（不包括R基团）在空间上有规律的折叠和盘绕，它是由氨基酸残基非侧链基团之间的氢键决定的。 三级结构 (3º) :是指多肽链在二级结构的基础上，进一步盘绕、卷曲和折叠，形成主要通过氨基酸侧链以次级键以及二硫键维系的完整的三维结构。 四级结构 (4º)具有两条和两条以上多肽链的寡聚蛋白质或多聚蛋白质才会有四级结构。其内容包括亚基的种类、数目、空间排布以及亚基之间的相互作用。 null蛋白质的四种结构层次nullnull蛋白质是氨基酸的线性多聚物（≥50aa ）胰核糖核酸酶null牛胰岛素的化学结构一种蛋白质的一级结构由编码 它的基因的核苷酸序列决定一种蛋白质的一级结构由编码 它的基因的核苷酸序列决定DNA: GGC ATT GTG GAA CAA TGC TGT ACC mRNA: GGC AUU GUG GAA CAA UGC UGU ACC 蛋白质: Gly- Ile- Val- Glu - Gln- Cys- Cys - Thrnull 由于羰基碳-氧双键的靠拢，允许存在共振结构（resonance structure），碳与氮之间的肽键有部分双键性质，由CO-NH构成的肽单元呈现相对的刚性和平面化，肽键中的4个原子和它相邻的两个α-碳原子多处于同一个平面上。氨基的H与羰基的O几乎总是呈反式（trans）而不是顺式（cis）。蛋白质构象数目受限制：1）酰胺平面；2）R的影响。（二）蛋白质的空间结构（构象、高级结构）——蛋白质分子中所有原子在三维空间的排列分布和肽链的走向。nullnull共价键次级键化学键 肽键一级结构氢键二硫键二、三、四级结构疏水键盐键范德华力三、四级结构1. 蛋白质分子中的共价键与次级键null图2-6 维持蛋白质构象的作用力null2. 蛋白质的二级结构——指蛋白质多肽链本身的折叠和盘绕方式（1）α-螺旋（α-helix） Pauling和Corey于1951年提出。①肽链骨架围绕一个轴以螺旋的方式伸展。②螺旋形成是自发的，每个肽键的羰基氧与远在第四个氨基酸氨基上的氢形成氢键（hydrogen bond），氢键的走向平行于螺旋轴，所有肽键都能参与链内氢键的形成。3.613 (ns) 其它：310 4.416③每隔3.6个残基，螺旋上升一圈。每一个氨基酸残基环绕螺旋轴100 º，螺距为0.54nm，即每个氨基酸残基沿轴上升0.15nm。螺旋的半径为0.23nm。null④R侧链基团伸向螺旋的外侧。并不参与螺旋的形成。但其大小、形状和带电状态却能影响螺旋的形成和稳定。 ⑤Pro的N上缺少H，不能形成氢键，经常出现在α-螺旋的端头，它改变多肽链的方向并终止螺旋。⑥天然的蛋白质中的-螺旋几乎都是右手螺旋。同一个螺旋中的氨基酸必须是同一种构型。 存在：该结构在一些纤维蛋白中所占的比例很高。 -角蛋白几乎全是-螺旋结构。 不少球蛋白含有比例不等，肌红蛋白达80%。nullα-螺旋结构的几种表示氢键稳定螺旋结构 螺旋的肽平面 空间填充模型结构 带状结构null 维系α-螺旋的氢键nullα-螺旋的横截面（绿色圆圈表示R基团）（2）β-折叠（β-pleated sheet）（2）β-折叠（β-pleated sheet）β-折叠是肽链的一种相当伸展的结构，多肽链呈扇面状展开。其主要特征包括： ①肽段几乎完全伸展，肽平面之间成锯齿状； ②肽段呈现平行排列，相邻肽段之间的肽键形成氢键； ③侧链基团垂直于相邻两个肽平面的交线，并交替分布在折叠片层的两侧； ④肽段平行的走向有平行和反平行两种，前者指两个肽段的N-端位于同侧，较为少见，后者正好相反。由于反平行折叠所形成的氢键N-H-O三个原子几乎位于同一直线上，因此，反平行β-折叠更稳定。 null 不同蛋白质的二级结构不同。肌红蛋白质中约有75％是-螺旋结构， -角蛋白几乎全是-螺旋结构，蚕丝丝蛋白几乎全是β-折叠结构。nullβ-折叠的片层结构和氢键null平行β-折叠和反平行β-折叠的结构比较nullRaf蛋白和Rap蛋白通过β-折叠形成二聚体null自然界的球状蛋白质种类最多，多肽链必须经过弯曲和回折才能形成稳定的球状结构。 ①肽链骨架以180 º回折而改变了肽链的方向； ②由肽链上四个连续的氨基酸残基组成，其中n位氨基酸残基的-C=O与n＋3位氨基酸残基的-NH形成氢键； ③Gly和Pro经常出现在这种结构之中； ④β-转角经常出现在连接反平行β-折叠片的端头。有利于反平行β-折叠的形成，这是因为β-转角改变了肽链的走向，促进相邻的肽段各自作为β-股，形成β-折叠。（3）β-转角（β-turn）null 为了紧紧折叠成紧密的球蛋白，多肽链常常反转方向，成发夹形状。一个氨基酸的羰基氧以氢键结合到相距的第四个氨基酸的氨基氢上。β-转角经常出现在连接反平行β-折叠片的端头。nullnull图2-10 两种主要类型(Ⅰ和Ⅱ)β-转角（4）β-凸起（β-bugle)（4）β-凸起（β-bugle)β-凸起是由于β-折叠股中额外插入一个氨基酸残基，使原来连续的氢键结构被打破，从而使肽链产生的一种弯曲凸起结构。β-凸起主要发现在反平行β-折叠之中，只有约5%的β-凸起出现在平行的β-折叠结构之中。β-凸起也能改变多肽链的走向，但没有β-转角那样明显。（5）无规则卷曲（andom coil）（5）无规则卷曲（andom coil）在蛋白质分子中，除了上述四种有规则的二级结构以外，还有一些极不规则的二级结构，这些结构统称为无规则卷曲。一般说来，无规则卷曲无固定的走向，有时以环的形式存在。酶的活性部位。将相邻二级结构连结在一起的环结构（黄色）null2. 超二级结构和结构域 超二级结构 是指若干相邻的二级结构中的构象单元彼此相互作用，形成有规则的，在空间上能辨认的二级结构组合体。是蛋白质二级结构至三级结构层次的一种过渡态构象层次。结构域 是球状蛋白质的折叠单位。多肽链在超二级结构的基础上进一步绕曲折叠成紧密的近似球行的结构，具有部分生物功能。对于较大的蛋白质分子或亚基，多肽链往往由两个以上结构域缔合而成三级结构；对于较小蛋白质或亚基，结构域就是三级结构。null图2-12 蛋白质中的超二级结构ααβαβRossman折叠D β曲折E 希腊图案拓扑结构null3. 蛋白质的三级结构——指多肽链上的所有原子（包括主链和侧链）在三维空间的分布。肌红蛋白4. 蛋白质的四级结构——许多蛋白质由两个或两个以上相互关联的具有三级结构的亚单位组成，多肽亚基（subunit）的空间排布和相互作用。 蛋白质的四级结构内容包括亚基的种类、数目、空间排布以及亚基之间的相互作用血红蛋白null图2-14 肌红蛋白的三级结构null图2-15 血红蛋白的空间结构null共价键次级键化学键 肽键一级结构氢键二硫键二、三、四级结构疏水键盐键范德华力三、四级结构血红素（铁卟啉 ）辅基的结构及其氧合部位血红素（铁卟啉 ）辅基的结构及其氧合部位肌红蛋白肌红蛋白（1）肌红蛋白的功能：哺乳动物肌肉中储存氧并运输氧的蛋白。 （2）肌红蛋白的结构特点：1963年，Kendrew肯德鲁 a .一条多肽链，153个氨基酸残基，一个血红素辅基，分子量17600。 b.肌红蛋白的整个分子具有外圆中空的不对称结构，肽链共折叠成8段较直的-螺旋体（A-H），最长的有23个氨基酸残基，最短的有7个氨基酸残基。拐弯处多由Pro、Ser、Ile、Thr等组成。 c.具有极性侧链的氨基酸残基分布于分子表面，而带非极性侧链的氨基酸残基多分布于分子内部，使肌红蛋白成为可溶性蛋白。 3.血红蛋白的结构与功能3.血红蛋白的结构与功能（1）血红蛋白的功能：存在动物血液的红细胞中，具有运输O2和CO2的功能；血红蛋白还能和H+结合，从而可以维持体内pH. （2）血红蛋白的结构特点： a.是四个亚基的寡聚蛋白，574个AA残基，分子量65000 b.成人的血红蛋白为22（HbA-96%）、22（ HbA2-2%）胎儿的血红蛋白为22（HbF） c.  链由141AA残基组成，    链由146AA残基组成。 四种肽链的三级结构与肌红蛋白相似，各自内部有一个血红素辅基。 null五、蛋白质分子结构与功能的关系 蛋白质分子具有多样的生物学功能，需要一定的化学结构，还需要一定的空间构象。（一）蛋白质一级结构与功能的关系1. 种属差异 蛋白质一级结构的种属差异十分明显，但相同部分氨基酸对蛋白质的功能起决定作用。根据蛋白质结构上的差异，可以断定它们在亲缘关系上的远近。2.分子病——蛋白质分子一级结构的氨基酸排列顺序与正常有所不同的遗传病。细胞色素c广泛存在于需氧生物细胞的线粒体中是一种与血红素辅基共价结合的单链蛋白质，在生物氧化反应传递电子。脊椎动物细胞色素c由104个氨基酸组成。35个氨基酸相同。氨基酸的差异不是随机的。氨基酸的差异由自然选择才保留下来。细胞色素c广泛存在于需氧生物细胞的线粒体中是一种与血红素辅基共价结合的单链蛋白质，在生物氧化反应传递电子。脊椎动物细胞色素c由104个氨基酸组成。35个氨基酸相同。氨基酸的差异不是随机的。氨基酸的差异由自然选择才保留下来。表2-3 不同生物与人的细胞色素c的氨基酸差异数目null镰状细胞贫血（sick-cell anemia）（血红蛋白574个AA） 从患者红细胞中鉴定出特异的镰刀型或月牙型细胞。β-链 1 2 3 4 5 6 7 Hb-A Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Lys… Hb-S Val-His-Leu-Thr-Pro-Val-Lys…蛋白质结构与功能关系的一般原则蛋白质结构与功能关系的一般原则每一种蛋白质都具有特定的结构，也具有特定的功能。一旦结构（特别是高级结构）破坏，其功能随之丧失。 蛋白质的高级结构决定蛋白质的功能。 蛋白质的一级结构决定其高级结构，因此，最终决定了蛋白质的功能。 一级结构相似的蛋白质具有相似的功能。 功能相似的蛋白往往能显示它们在进化上的亲缘关系，这是研究分子进化的基础。 许多疾病是蛋白质三维结构异常引起，属于构象病。（例如囊性纤维变性，镰状红细胞贫血和疯牛病）null（二）蛋白质构象与功能的关系 别（变）构作用：含亚基的蛋白质由于一个亚基的构象改变而引起其余亚基和整个分子构象、性质和功能发生改变的作用。因别构而产生的效应称别构效应。血红蛋白是别构蛋白，O2结合到一个亚基上以后，影响与其它亚基的相互作用。Mb的结构与功能Mb的结构与功能一级结构：由一条肽链组成，含有153个氨基酸残基；非共价结合一分子血红素辅基。血红素由原卟啉和Fe2+组成。Fe2+可以形成6个配位键，其中4个是与原卟啉上的吡咯环的N原子形成的，1个是与肽链F螺旋上的His的咪唑基（HisF8）形成的。O2可以通过第六个配位键可逆地与Fe2+结合。 二级结构：共有8段α-螺旋，它们约占全部序列的75%，按照N-端到C-端的次序，被依次编号为A、B、C、D、E、F、G、H。螺旋之间是短的小环。有四个螺旋终止于Pro残基。某些螺旋为两亲螺旋。 三级结构：折叠成紧密球状，疏水侧链大都在分子内部，极性、带电荷的侧链则在分子表面。其分子表面形成一个深的疏水口袋，口袋的侧面由E螺旋和F螺旋组成，底部由G螺旋和H螺旋组成。血红素通过与周围氨基酸残基的次级键以及血红素铁与近端的His F8形成的配位键而“藏”在洞中。该口袋允许O2进入而阻止H2O的进入，既保证了Fe2+结合O2又可防止Fe2+被氧化成Fe3+。如果Fe2+被氧化成Fe3+则氧气不能再与血红素结合。CO与O2差不多大，因此也能与血红素结合。CO的毒性是因为它与血红素的亲和力更大，从而阻止O2与血红素的结合。null血红蛋白的与氧气结合前后的构象变化null六、蛋白质的性质与分离、分析技术1 .蛋白质的相对分子量 蛋白质相对分子量在10 000~1 000 000之间。测定分子量的主要方法有渗透压法、超离心法、凝胶过滤法、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。最准确可靠的方法是超离心法（Svedberg于1940年设计）：蛋白质颗粒在25~50×104 g离心力作用下从溶液中沉降下来。沉降系数（s）：单位（cm）离心场里的沉降速度。 v =沉降速度（dx/dt） ω=离心机转子角速度（弧度/s） x =蛋白质界面中点与转子中心的距离（cm）沉降系数的单位常用S，1S=1×10-13（s）（一）蛋白质的性质null蛋白质分子量（M）与沉降系数（s）的关系null2. 蛋白质的两性电离及等电点 蛋白质在其等电点偏酸溶液中带正电荷，在偏碱溶液中带负电荷，在等电点pH时为两性离子。电泳：带电颗粒在电场中移动的现象。分子大小不同的蛋白质所带净电荷密度不同，迁移率即异，在电泳时可以分开。1. 自由界面电泳：蛋白质溶于缓冲液中进行电泳。2. 区带电泳：将蛋白质溶液点在浸了缓冲液的支持物上进行电泳，不同组分形成带状区域。（1）纸上电泳：用滤纸作支持物。 等电点时蛋白质的溶解度、粘度、渗透压、膨胀性、导电能力最低。null（2）凝胶电泳：用凝胶（淀粉、琼脂糖、聚丙烯酰胺）作支持物。1）圆盘电泳：玻璃管中进行的凝胶电泳。2）平板电泳：铺有凝胶的玻板上进行的电泳。紫外吸收：最大吸收峰为280nmnull等电聚焦电泳：当蛋白质在其等电点时，净电荷为零，在电场中不再移动。通电null等电聚焦需要在凝胶中加入两性电解质，以在阳极和阴极之间建立递增的pH梯度，处在其中的蛋白质分子在电场的作用下迁移，最后各自移动到并聚焦于与其pI相当的pH位置上。于是通过等电聚焦，不仅可以实现pI不同的蛋白质之间的分离，而且还可以测定出各种蛋白质的pInull3 蛋白质的变性 天然蛋白质受物理或化学因素的影响，其共价键不变，但分子内部原有的高度规律性的空间排列发生变化，致使其原有性质发生部分或全部丧失，称为蛋白质的变性。 导致蛋白质变性的物理因素有：加热、冷却、机械作用、流体压力和辐射；化学因素有强酸、强碱、高浓度盐、尿素、重金属盐、疏水分子和有机溶剂 变性蛋白质主要标志是生物学功能的丧失。分子形状改变，肽链松散。物性：溶解度降低，易形成沉淀析出，结晶能力丧失，粘度增加；化性：反应基团增加，易被酶消化。 变性蛋白质分子互相凝集为固体的现象称凝固。 有些蛋白质的变性作用是可逆的，其变性如不超过一定限度，经适当处理后，可重新变为天然蛋白质。null4 蛋白质的胶体性质布郎运动、丁道尔现象、电泳现象，不能透过半透膜（羊皮纸），具有吸附能力蛋白质溶液稳定的原因：1）表面形成水膜（水化层）； 2）带相同电荷。透析法：分离纯化蛋白质null核糖核酸酶S 的变性- 复性实验null5 蛋白质的沉淀反应（非变性沉淀和变性沉淀） （1） 加高浓度盐类（盐析）：加中性盐（硫酸铵、 硫酸钠、氯化钠）使蛋白质沉淀析出。分段盐析：调节盐浓度，可使混合蛋白质溶液中的几种蛋白质分段析出。血清球蛋白（50%(NH4)2SO4饱和度），清蛋白（饱和(NH4)2SO4)。 （2）加有机溶剂：酒精、丙酮。低温时，蛋白质一般不变性，且比盐析法好。（3）加重金属盐：氯化高汞、硝酸银、醋酸铅。蛋白质变性，除去杂质蛋白质。 （4） 加某些酸类：单宁酸、苦味酸、钼酸、钨酸、三氯乙酸。蛋白质变性，除去蛋白质杂质。 （5） 加热：大多数蛋白质变性沉淀。null  6 蛋白质的颜色反应—OHN7 蛋白质的含量测定7 蛋白质的含量测定考马斯亮蓝染色法 紫外吸收法 最大吸收峰为280nm 蛋白质质量含量（mg/mL）=1.45A280nm-0.47A260nm 凯氏定氮法 其他方法 胶体金法、免疫学法 null（二）蛋白质的分离和分析技术1. 蛋白质溶解度盐析等电点沉淀法低温有机溶剂沉淀法2. 蛋白质分子大小3. 蛋白质带电性质透析和超滤（离心力）凝胶过滤法电泳法离子交换法4. 根据配体特异性nullAla、Lys和Asp的电泳分离null离子交换层析分离氨基酸的原理（三）蛋白质一级结构的测定（三）蛋白质一级结构的测定蛋白质氨基酸顺序的测定是蛋白质化学研究的基础。自从1953年F.Sanger测定了胰岛素的一级结构以来，现在已经有上千种不同蛋白质的一级结构被测定。 1.测定蛋白质一级结构的1.测定蛋白质一级结构的要求a、样品必需纯（>97%以上）； b、知道蛋白质的分子量； c、知道蛋白质由几个亚基组成； 2. 测定步骤 2. 测定步骤（1）多肽链的拆分 由多条多肽链组成的蛋白质分子，必须先进行拆分 可用8mol/L尿素，或6mol/L盐酸胍，或高难度盐（硫酸铵）处理，即可分开多肽链(亚基)，再根据大小和电荷的不同分离各肽链。 蛋白质一级结构的测定 2. 测定步骤 2. 测定步骤（2）二硫键的断裂 几用过量的-巯基乙醇(还原法)处理，使二硫键还原为巯基，然后用烷基化试剂（ICH2COOH）保护生成的巯基，以防止它重新被氧化。 蛋白质一级结构的测定SH-CH2-CH2-OH 2. 测定步骤 2. 测定步骤应用过甲酸氧化法拆分多肽链间的二硫键。蛋白质一级结构的测定ssHcoooHSO3HSO3HnullSSSSSS胰岛素HO-CH2-CH2-SHSHSHSHSHSHSHSCH2C00HSCH2C00HSCH2C00HSCH2C00HSCH2C00HSCH2C00HICH2COOH 2. 测定步骤 2. 测定步骤（3）氨基酸组成的分析。 常用6mol/L盐酸水解蛋白质，经过PITC和色谱法，得出氨基酸的百分含量。再通过与蛋白质分子量之间的关系，可确定多数每种氨基酸的数目。 另外，Trp被破坏，在碱水解或酶水解实验。Gln和Asn分别水解为Glu和Asp，测序后才能区别Gln和Glu、 Asn和Asp。蛋白质一级结构的测定 2. 测定步骤 2. 测定步骤 （4）N-端和C-端测定 多肽链端基氨基酸分为两类：N-端氨基酸(amino-terminal)和C-端氨基酸。 在肽链氨基酸顺序分析中，最重要的是N-端氨基酸分析法。 蛋白质一级结构的测定nullDNFB法（Sanger法）：2,4-二硝基氟苯在碱性条件下，能够与肽链N-端的游离氨基作用，生成二硝基苯衍生物（DNP）。 在酸性条件下水解，得到黄色DNP-氨基酸。该产物能够用乙醚抽提分离。不同的DNP-氨基酸可以用色谱法进行鉴定。 末端基氨基酸测定（4）N-端测定null在碱性条件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯）可以与N-端氨基酸的游离氨基作用，得到丹磺酰-氨基酸。 此法的优点是丹磺酰-氨基酸有很强的荧光性质，检测灵敏度可以达到110-9mol。 末端基氨基酸测定丹磺酰氯法nullEdman （苯异硫氰酸酯法）氨基酸顺序分析法实际上也是一种N-端分析法。此法的特点是能够不断重复循环，将肽链N-端氨基酸残基逐一进行解离。 Edman氨基酸顺序分析法null氨肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的N-端逐个的向里水解。 根据不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，按反应时间和氨基酸残基释放量作动力学曲线，从而知道蛋白质的N-末端残基顺序。 最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶，水解以亮氨酸残基为N-末端的肽键速度最大。末端基氨基酸测定氨肽酶(amino peptidases)法null肼解法是多肽链C-端氨基酸分析法。多肽与肼在无水条件下加热，C-端氨基酸即从肽链上解离出来，其余的氨基酸则变成肼化物。肼化物能够与苯甲醛缩合成不溶于水的物质而与C-端氨基酸分离。 末端基氨基酸测定（5）C-端测定null羧肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的C-端逐个的水解AA。根据不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，从而知道蛋白质的C-末端残基顺序。 目前常用的羧肽酶有四种：A,B,C和Y；A和B来自胰脏；C来自柑桔叶；Y来自面包酵母。 羧肽酶A能水解除Pro,Arg和Lys以外的所有C-末端氨基酸残基；B只能水解Arg和Lys为C-末端残基的肽键。末端基氨基酸测定羧肽酶(carboxypeptidase)法2. 测定步骤2. 测定步骤（6）多肽链断裂成多个肽段，可采用两种或多种不同的断裂方法将多肽样品断裂成两套或多套肽段或肽碎片，并将其分离开来。 蛋白质一级结构的测定多肽链断裂法：酶解法和化学法null 酶解法: 胰蛋白酶，糜（胰凝乳）蛋白酶，胃蛋白酶，嗜热菌蛋白酶 多肽链的选择性降解水解位点胰蛋白酶： R1=Lys或Arg 糜蛋白酶： R1=Phe, Tyr,Trpnull 化学法：可获得较大的肽段 溴化氰(Cyanogen bromide)水解法，它能选择性地切割由甲硫氨酸的羧基所形成的肽键。 多肽链的选择性降解null 化学法：可获得较大的肽段 羟胺（NH2OH）：选择性不强，断裂-Asn-Gly-之间的肽键（弱碱）。也能部分裂解-Asn-Leu-之间的肽键以及-Asn-Ala-之间的肽键（弱酸）。 多肽链的选择性降解2. 测定步骤2. 测定步骤（7）分离肽段测定每个肽段的氨基酸顺序。 Edman法 色质联用法蛋白质一级结构的测定nullEdman（苯异硫氰酸酯法）氨基酸顺序分析法实际上也是一种N-端分析法。此法的特点是能够不断重复循环，将肽链N-端氨基酸残基逐一进行解离。 Edman氨基酸顺序分析法null 测定每条多肽链的氨基酸组成蛋白质一级结构的测定null 2. 测定步骤 2. 测定步骤(8)肽段的拼接 利用两套或多套肽段的氨基酸顺序彼此间的交错重叠，拼凑出整条多肽链的氨基酸顺序。 蛋白质一级结构的测定 2. 测定步骤 2. 测定步骤（9）二硫键位置的确定 蛋白质一级结构的测定采用胃蛋白酶水解：切点多，二硫键稳定。将所得的肽段利用对角线电泳技术进行分离。null+-+-第二向第一向 对角线电泳图解pH6.5 图中a、b两个斑点是 由一个二硫键断裂 产生的肽段nullSSHCOOOHSO3HSO3Hnull+-+-第二向第一向a b对角线电泳图解pH6.5 图中a、b两个斑点是 由一个二硫键断裂 产生的肽段null 从下列信息求八肽的序列。 (a)酸水解的Ala,Arg,Leu,Met,Phe,Thr,2Val； (b)Sanger试剂处理得DNP-Ala； (c)胰蛋白酶处理得Ala,Arg,Thr和Leu,Met,Phe, 2Val，当以Sanger试剂处理时分别得DNP-Ala，DNP-Val； (d)以溴化氰处理得Ala,Arg,高丝氨酸内酯，Thr,2Val和Leu,Phe，当以当以Sanger试剂处理时分别得DNP-Ala和DNP-Leu。 氨基端 2 3 4 5 6 7 羧基端 由(b)知 Ala 由(b)，(c) Ala Arg Val 由(b)，(c)和(d) Ala Arg Val Met Leu Phe 综合考虑 Ala Thr Arg Val Val Met Leu Phe。作业作业教材p61—p62页: 第1、4、5、6、7 补充题 1. 名词解释null本章较全面地介绍了蛋白质化学的基本知识，重点阐述了氨基酸和蛋白质的结构、性质和功能间的依存关系。在学习氨基酸的结构时应联系有机化学的羧酸结构，在学习氨基酸的化学性质时应联系氨基与羧基的性质，再将氨基酸的结构和特性与蛋白质的结构和特性联系起来。认识蛋白质的重要生物学意义。提要