聚乙二醇修饰重组人干扰素_1b的制备及其性质

中国生物制品学杂志 2010年 6月第 23卷第 6期 Chin J Biologicals June 2010，Vol. 23 No. 6 重组人干扰素 α1b（rhIFNα1b）是我国自行开发 的基因工程干扰素，是从健康人脐血白细胞中获得 基因，经转化大肠杆菌表达，作为我国第一个进入工 业化生产的基因工程药物批准上市，拥有自主知识 产权［1］。rhIFNα1b具有广谱的抗病毒作用，与国内 外同类产品相比，具有副作用较小、不易产生中和抗 体、成本低等优点，更适合中国人使用。但其也存在 着生物半衰期短、患者需反复长期用药等缺点。采用 聚乙二醇（PEG）修饰能增强蛋白质类药物的稳定 性，降低免疫原性，延长生物半衰期等［2］。然而 PEG 修饰程度的不同可导致各种修饰组分药理作用的不 同，而无法达到最佳治疗效果；另外，若修饰反应不 完全，残留的未修饰蛋白可能引发毒副作用或引起 免疫反应。我们前期对 3种 PEG进行了筛选［3］，本 实验采用筛选出的 PEG20000 修饰 rhIFNα1b，通过 离子交换层析分离纯化修饰混合物，单点修饰产物 经超滤浓缩后，对其部分性质进行。 1. 材料与方法 1. 1 干扰素 rhIFNα1b为本所生产，蛋白浓度：2. 173 mg ／ ml， 比活：8. 87 × 106 IU ／ mg，批号：2008试-1。 1. 2 细胞株与毒种 WISH细胞和 VSV均由本所保存。 1. 3 主要试剂及仪器 单甲氧基聚乙二醇-丙酸琥珀酰亚胺 20000 （SPA-mPEG20000，批号 KZ-M20SPA-080645）购自 北京凯正生物工程发展有限责任公司；HRP标记的 山羊抗小鼠 IgG购自北京鼎国生物技术发展公司； 小鼠抗 rhIFNα1b单克隆抗体由本所制备；OPD显色 底物购自 Sigma公司；其余试剂均为国产分析纯或 生化纯；Akta Explorer 层析仪和 CM Sepharose FF 5ml预装柱购自 GE Healthcare 公司；Labscale 超滤 器和超滤膜（截留相对分子质量 10 000）购自 Milli－ pore 公司；Fluorescent Tables Combi-Light 凝胶电泳 成像系统及配套软件购自 VILBER LOURMAT；Wa－ ters 2690 HPLC 仪及 RPC8，2. 1 mm × 50 mm 柱均 购自Waters公司。 基金项目：2007年国家 863资助项目（2007AA02Z100）. 作者单位：上海生物制品研究所（上海 200052）. 通讯作者：楼觉人，E-mail：youngyangyoung@yahoo.com.cn 中国图书分类号 R392-33 文献标识码 A 文章编号 1004-5503（2010）06-0615-04 【治疗制品】 聚乙二醇修饰重组人干扰素 α1b的制备及其性质 杨宇峰 路煜 石玮 马相虎 秦洁 朱威 楼觉人 【摘要 】 目的 制备聚乙二醇（PEG）修饰的重组人干扰素 α1b（rhIFNα1b），并分析其部分性质。方法 采用 PEG修饰 rhIFNα1b，通过离子交换层析分离纯化修饰混合物，单点修饰产物经超滤浓缩后，经 Lowry法检测蛋白的浓度，SDS-PAGE和 RP- HPLC检测蛋白的纯度，等电聚焦电泳检测蛋白的等电点，质谱法检测蛋白的相对分子质量，细胞病变抑制法检测蛋白的体外活 性，ELISA法检测蛋白的抗原性。结果 单点修饰产物的蛋白得率为 33%；SDS-PAGE分析纯度为 96. 1%，RP-HPLC分析纯度为 98. 1%；等电点为 6. 22；相对分子质量为 39 946；比活为 1. 28 × 106 IU ／ mg，活性保留率为 14. 4%；抗原性至少降至原来的 1 ／ 625。结论制备的单点修饰 rhIFNα1b药学性质获得改善，有望开发为安全、长效的新型干扰素。 【关键词】 聚乙二醇；生物，基因修饰；重组人干扰素 α；性质 Preparation and Properties of PEGylated Recombinant Human Interferon α1b YANG Yu-feng, LU Yu, SHI Wei, et al（Shanghai Institute of Biological Products, Shanghai 200052, China） 【Abstract】 Objective To prepare PEGylated recombinant human interferon α1b（PEG-rhIFNα1b）and analyze its properties. Methods Recombinant human IFNα1b was modified by PEG, and the modified mixture was separated and purified by ion exchange chromatography, based on which PEG-rhIFNα1b was concentrated by ultrafiltration, and determined for concentration by Lowry method, for purity by SDS-PAGE and RP-HPLC, for isoelectric point by isoelectric focusing electrophoresis, for relative molecular mass by mass spectrography, for in vitro activity by cytopathic inhibition assay, and for antigenicity by ELISA. Results The yield of PEG- rhIFNα1b was 33%. The purity of PEG-rhIFNα1b was 96. 1% by SDS-PAGE and 98. 1% by RP-HPLC. The isoelectric point, rela－ tive molecular mass, specific activity and activity reservation rate of PEG-rhIFNα1b were 6. 22, 39 946, 1. 28 × 106 IU ／ mg and 14. 4% respectively, while the antigenicity decreased by at least 625 folds. Conclusion The pharmacological properties of prepared PEG- rhIFNα1b were improved. PEG-rhIFNα1b might be developed to a novel safe and long-acting interferon. 【Key words】 PEG; Biology, gene modification; Recombinant human interferon α; Property 615· · 中国生物制品学杂志 2010年 6月第 23卷第 6期 Chin J Biologicals June 2010，Vol. 23 No. 6 1. 4 PEG单点修饰 rhIFNα1b的制备 取 rhIFNα1b 5 ml，调 pH 至 9. 0，加入 PEG 固 体 100 mg，溶解，4℃反应 2 h，用醋酸缓冲液（pH 5. 0） 稀释 10倍终止反应。稀释反应产物上经醋酸缓冲 液（pH 5. 0）平衡的 CM Sepharose FF 5 ml预装柱， 流速 2 ml ／ min，用含 1 mol ／ L NaCl的醋酸缓冲液 洗脱，收集各修饰组分。取单点修饰产物 20 ml， 经超滤器浓缩至 10 ml，换入 PBS缓冲液，-20℃保 存。 1. 5 PEG单点修饰产物的鉴定 1. 5. 1 蛋白浓度的测定及蛋白得率的计算：按《中 国药典》三部（2005版）要求，采用 Lowry 法测定单 点修饰产物的蛋白浓度，并按下式计算蛋白得率。 蛋白得率（%）= 单点修饰产物蛋白总量 ／ 原料蛋白总 量 × 100% 1. 5. 2 SDS-PAGE分析：取 rhIFNα1b、修饰混合物、 各洗脱组分 20 μl，按 Laemmli［4］的方法 进行 SDS- PAGE分析，采用凝胶成像系统配套软件对凝胶图 谱进行扫描分析，计算总修饰率、单点修饰率和单点 修饰产物的纯度。 1. 5. 3 纯度分析：采用反相高压液相色谱法（RP- HPLC），流动相：A：含 0. 1%三氟乙酸水溶液，B：含 80%乙腈的 A液，梯度：0 ～ 5 min 0％ B液，6 ～ 66 min 30%～80％B液，67～70min100%B液，流速：1ml ／min， 检测波长：280 nm，柱温：25℃，进样体积 40 μl。 1. 5. 4 等电点测定：按 Stuart等［5］的方法，采用等 电聚焦电泳测定修饰产物的等电点。 1. 5. 5 相对分子质量测定：采用质谱法测定单点修 饰产物的相对分子质量，由复旦大学医学院蛋白质 组中心采用 MALDI-TOF-MS进行测定。 1. 5. 6 体外活性保留率分析：按《中国药典》三部 （2005版）要求，采用细胞病变抑制法检测单点修饰 产物的体外活性，并与原料蛋白活性比较，计算其活 性保留率。 1. 5. 7 抗原性检测：采用 ELISA法［6］检测原料蛋 白与单点修饰产物的抗原性。抗原起始浓度 100 μg ／ ml，5倍系列稀释至 0. 16 μg ／ ml，一抗、二 抗稀释浓度均为 1 ∶ 1 000，酶标仪读取 A490值。 2. 结果 2. 1 单点修饰产物的蛋白浓度和蛋白得率 经 Lowry 法测定单点修饰产物的蛋白浓度为 0. 36 mg ／ ml，总体积 10 ml，蛋白总量 3. 6 mg，原料 蛋白总量 10. 87 mg，经计算，单点修饰产物的蛋白 得率为 33%。 2. 2 单点修饰产物的 SDS-PAGE分析 经 SDS-PAGE和软件分析，PEG对 rhIFNα1b的 总修饰率为 71%，其中单点修饰产物占 43. 1%。修 饰混合物经离子交换层析分离纯化，产生 3个洗脱 组分，依次为多点修饰混合物、单点修饰产物和未修 饰干扰素，单点修饰产物纯度可达 96. 1%，见图 1和 图 2。 图 1 修饰混合物的离子交换层析图谱 Fig 1. Ion exchange chromatographic profile of modi－ fied mixture 1：蛋白质 marker；2：rhIFNα1b；3：空白对照；4；修饰混 合物；5:流穿峰；6:多点修饰产物；7：单点修饰产物；8：未修饰 的 rhIFNα1b 图 2 单点修饰产物的 SDS-PAGE分析 Fig 2. SDS-PAGE profile of PEG-rhIFN α1b 2. 3 单点修饰产物的 HPLC纯度 经 RP-HPLC法分析，单点修饰产物的保留时间 为 47. 95 min，纯度为 98. 1%，见图 3。 2. 4 单点修饰产物的等电点 经等电聚焦电泳检测，rhIFNα1b 的等电点为 5. 20，单点修饰产物的等电点为 6. 22，见图 4。 2. 5 单点修饰产物的相对分子质量 经 MALDI-TOF-MS检测，rhIFNα1b的相对分子 质量为 18 940，单点修饰产物的相对分子质量为 39 946，与理论值 38 940 的误差为 2. 5%，见图 5和 图 6。 Mr 1 2 3 4 5 6 7 8 96 000 66 000 43 000 31 000 20 000 14 400 0 10 20 30 40 50 0 20 40 60 80 12010 30 50 70 90 110100 m A U 体积（ml） 多点修饰混合物 单点修饰产物 未修饰干扰素 流穿峰 616· · 中国生物制品学杂志 2010年 6月第 23卷第 6期 Chin J Biologicals June 2010，Vol. 23 No. 6 图 3 单点修饰产物的 RP-HPLC图谱 Fig 3. RP-HPLC profile of PEG-rhIFN α1b 1：rhIFNα1b；2：蛋白质 marker；3：单点修饰产物 图 4 单点修饰产物的等电聚焦电泳分析 Fig 4. Isoelectric focusing electrophoretic profile of PEG-rhIFN α1b 图 5 rhIFNα1b的质谱分析 Fig 5. Mass spectrum of rhIFNα1b 图 6 单点修饰 rhIFNα1b的质谱分析 Fig 6. Mass spectrum of PEG-rhIFNα1b 2. 6 单点修饰产物的体外活性保留率 经细胞病变抑制法检测，rhIFNα1b 的比活为 8. 87 × 106 IU ／ mg，单点修饰产物的比活为 1. 28 × 106 IU ／ mg，活性保留率为 14. 4%。 2. 7 单点修饰产物的抗原性 经 ELISA检测，rhIFNα1b与单抗在浓度不低于 0. 8 μg ／ ml时反应均呈阳性，随着抗原浓度的降低，结 合程度也下降，而单点修饰产物在最高浓度 100 μg ／ ml 下，A490值与 rhIFNα1b最低浓度 0. 16 μg ／ ml 下的 A490值相近，表明其抗原性至少降至原来的 1 ／ 625， 见表 1。 表 1 ELISA 法检测 rhIFNα1b 与单点修饰产物的抗原性 （A490） Tab 1. ELISA of antigenicities of rhIFNα1b and PEG- rhIFN（A490） 抗原浓度（μg ／ ml） 100 20 4 0. 8 0. 16 rhIFNα1b 2. 792 1. 924 1. 161 0. 585 0. 518 单点修饰产物 0. 519 0. 531 0. 461 0. 495 0. 597 3. 讨论 Malik 等［7］的研究表明，PEG 修饰蛋白质的纯 化难度大，且纯化产物的得率通常较低。由于本实验 采用的 PEG修饰剂通过活化基团与 rhIFNα1b表面 的氨基（主要为赖氨酸的 ε-氨基）结合，而氨基在酸 性环境下带正电荷，因此修饰产物的正电荷数会减 少。另外，PEG自身不带电荷，当 PEG覆盖于蛋白质 表面时，可能会阻碍蛋白质与离子交换树脂侧链的 结合，所以修饰产物上结合的 PEG分子越多，其带 电荷数越少，越易被盐溶液洗脱。因此，我们推测，采 用 CM弱阳离子交换层析可以简便地对修饰产物进 行分离纯化，层析结果和等电点试验证实了这种推 测。 PEG修饰的蛋白质与天然状态相比，许多理化 性质均发生了改变，如等电点、相对分子质量、溶解 度、沉降系数等，这些变化导致了修饰蛋白的药学性 质改善，主要包括：物理和热稳定性增强，在体内循 环半衰期、清除时间延长，免疫原性和抗原性降低， 体内活性提高而体外活性降低等。单点修饰产物的 抗原性较未修饰前大幅降低，有利于减少临床毒副 作用的产生。单点修饰产物的体外活性降低，活性保 留率为 14. 4%，这可能主要是由于 PEG遮蔽了干扰 素与其受体结合的特定位点，而阻碍了干扰素与受 体的结合。在以细胞为基础的体外活性检测时，由于 培养时间相对较短，修饰产物与受体间的亲和力较 低，往往导致测定的体外生物活性降低［8］。但在体 内，由于修饰蛋白相对分子质量增大，降低了肾脏清 除率，免疫原性和抗原性降低，抗酶降解能力增强， 因此体内循环半衰期延长，活性提高。 1 2 3 4. 55 5. 20 5. 85 6. 55 6. 85 7. 35 8. 15 8. 45 8. 65 0. 00 0. 02 0. 04 0. 06 0. 08 0. 10 10 20 30 40 50 60 70 时间（min） A U 样品 0 20 40 60 80 100 19 983. 0 26 030. 8 32 068. 6 38 106.4 41 144. 2 相对分子质量 强 度 （ % ） 0 20 40 60 80 100 9 998. 0 14 021. 4 18 044. 8 22 098. 2 相对分子质量 强 度 （ % ） 617· · 中国生物制品学杂志 2010年 6月第 23卷第 6期 Chin J Biologicals June 2010，Vol. 23 No. 6 （上接第 614页） 图 3 两种容器培养的病毒抗原含量比较 Fig 3. Antigen contents of viruses harvested in cells cultured on Cell-Stack apparatus and in rolling bottle 表 1 两种容器培养的病毒原液检定结果比较 Tab 1. Control tests on virus bulks cultured on Cell-Stack apparatus and in rolling bottle 原液批号 S20081001B S20081102B S20081103B 细胞 细胞 细胞 工厂 工厂 工厂 抗原含量 1 ∶ 512 1 ∶ 512 1 ∶ 1 024 1 ∶ 512 1 ∶ 512 1 ∶ 512 蛋白含量 2. 95 2. 80 2. 80 3. 70 3. 06 5. 30 （μg ／ ml） 残留牛血清含 3. 5 0 2. 8 0 3. 0 1. 0 量（ng ／ ml） 无菌试验 符合 符合 符合 符合 符合 符合 标准 标准 标准 标准 标准 标准 3. 讨论 转瓶是目前国内培养细胞生产疫苗的主要容 器，由于转瓶为旋转培养，要使细胞尽快贴壁并长满 致密单层，需要接种大量细胞，因此生产成本较高， 占用厂房空间较多，劳动强度大，生产规模不易扩 大。细胞工厂是一种新型的细胞培养容器，材质为符 合《美国药典》规定的聚苯乙烯，采用静止培养方式， 培养表面经特殊处理，大大提高了细胞的吸附性和 生长速度。由于细胞工厂培养表面积相对较大，可以 节省操作时间与培养厂房空间。目前，国内外已有应 用细胞工厂培养传代细胞生产甲肝疫苗的报道［2］， 而未见大规模培养原代细胞生产疫苗的报道。 由于两种培养容器的材质和培养方式不同，原 代沙鼠肾细胞的生长速度和病毒表达量也各不相 同。细胞生长有一种“密度依赖”［3］，即当接种较少 量细胞时，细胞的生长和增殖也会受到影响。单个细 胞比群落更难培养，因为任何一种细胞既要从培养 液中获取营养物质，同时也会向外释放一些物质（包 括生长因子），以将环境调节至有利于自身生长的状 态。单个细胞所释放的物质达不到众多细胞对周围 环境的调节能力，不易长成致密单层，这在转瓶培养 中尤为明显。而细胞工厂表面经过特殊处理，且为静 止培养，不存在“密度依赖”，因此同等面积只需接种 转瓶细胞量的 1 ／ 3，即可在同一时间长成致密单层。 本实验结果表明，接种病毒后，转瓶内的细胞在第 5 次收获病毒后，大部分因病变而脱落，无法继续表达 病毒；而细胞工厂中，病毒液在第 9次收液后细胞才 明显脱落。按出血热疫苗制检规程规定的病毒液收 获次数（4次）计算，相同面积用细胞工厂生产疫苗 的产量可比转瓶提高 3倍。该方法不仅适用于原代 细胞培养，也适用于传代细胞培养，是病毒类疫苗大 规模生产的一种简便、快速、高效的方法。 参考文献 ［1］张延龄，张晖. 疫苗学［M］. 1版. 北京：科学出版社，2004：1364- 1400. ［2］Hagen AJ, Aboud RA, Dephillips PA, et al. Use of a nuclease en－ zyme in the purification of VAQTA誖 , a hepatitis A vaccine［J］. Biotechnol Appl Biochem, 1996, 23: 209-215. ［3］兰蓉，周珍辉. 细胞培养技术［M］. 北京：化学工业出版社，2007： 17-18. （收稿日期：2009-10-11） 1 2 3 4 5 6 7 8 90 50 100 150 200 250 300 细胞工厂 转瓶 病 毒 抗 原 含 量 （ 1∶ x） 收获次数 转瓶转瓶转瓶 检测项目 本实验表明，PEG单点修饰 rhIFNα1b制备方法 简便可行，制备的产物药学性质得到改善，下一步将 对其进行更深入的研究，以期开发出安全、长效的新 型干扰素。 参考文献 ［1］张海霞，孙桂珍，张文静. 我国基因工程药物的研究动态［J］. 山 东农业大学学报（自然科学版），2008，39（4）：661-663. ［2］Delgado C, Francis GE, Fisher D. The uses and properties of PEG- linked proteins［J］. Crit Rev Ther Drug Carrier Syst, 1992, 9（3-4）: 249-304. ［3］杨宇峰，黄静，徐帆洪，等. 聚乙二醇修饰重组人干扰素-α1b条 件的优化［J］. 中国生物制品学杂志，2008，21（4）：329-332. ［4］Laemmli UK. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4［J］. Nature, 1970, 227（5259）: 680- 685. ［5］Stuart JE, Daniel MB, Michael DR. Protein Methods ［M］. New York: Wiley-Liss, 1991: 174-187. ［6］徐宜为. 免疫检测技术［M］. 北京：科学出版社，1997: 150-189. ［7］Malik F, Delgado C, Knüsli C, et al. Polyethylene glycol（PEG）- modified granulocyte-macrophage colony-stimulating factor（GM- CSF）with conserved biological activity ［J］. Exp Hematol, 1992, 20（8）:1028-1035. ［8］ Jose R, Vivian S, Reynier B, et al. PEGylated interferon-α2b: a branched 40K polyethylene glycol derivative ［J］. Pharmaceutical Research, 2005, 22（8）: 1374-1386. （收稿日期：2009-09-21） 618· ·