分光光度法测定火龙果茎中黄酮类化合物的含量

分光光度法测定火龙果茎中黄酮类化合物的含量中国食品添加剂ChinaFoodAdditives测试分光光度法测定火龙果茎中黄酮类化合物的含量郭璇华,戴文娟,梁博,李智儒(华南理工大学化学与化工学院,广州510640)摘要:火龙果是仙人掌三角柱属多年生植物,其果具有丰富的营养价值,可作为水果直接食用,花也可以作为蔬菜,而火龙果茎却未被利用.本文研究了火龙果茎中黄酮类化合物的分离提取和测定.采用单因素实验和正交试验对黄酮类化合物的分光光度法测定条件和火龙果茎中黄酮类化合物的分离提取条件进行优化.实验结果明,以芦丁为标样,黄酮含量在6.64～44.8mg/L范围内服从比尔定律,回归方程为A=0.333p一5.14x10～,相关系数R=0.9999;火龙果茎中黄酮类化合物的分离提取条件为:70%的乙醇溶液为提取溶剂,料液比为1:40,提取温度为75℃,提取时间3h.方法回收率为96.1%～102.2%,相对标准偏差(RSD)为3.3%(n=5).火龙果茎干品中黄酮类化合物的含量为0.49%.关键词:火龙果茎;黄酮类化合物;分光光度法;检测中图分类号:TS207.3文献标识码:A文章编号:1006—2513(2010)02—021O一04AICI3spectrophotometricdetermination,r■i.●’OTTlaVonoidsInpitayastemsGUOXuan-hua,DAIWen-juan,LIANGBo,LIZhi-ru(SchoolofChemistryandChemicalEngineering,SouthChinaUniversityofTechnology,Guangzhou,510640)Abstract:Pitayaisaperennialplant也triangularcactusgenus.ofwhichfruitisrichinnutritionalvalueandcanbeatedirectly,flowemCallbeusedasvegetables,butthepitayastemsayenotbeingused.Inthispaper,theextractionandseparationofthetotalflavonesfrompitayastemswerestudiedbyusingsingle—factorexperimentsandorthogonaltesttooptimizeprocessconditions.RegressionequationisA=0.333p一5.14x10～.correlationcoefficientR=0.99986.Theabsorbance(A)waslinearwiththeconcentrationisintherangeof6.4—44.8mg/L.TherecoveriesandRSDare96.1%～102.2%and3.3%respectively(n=5).Theresultshowedthatthecontentoftotalflavonesfromarypitayastemis0.49%.Keywords:stemsofpitaya;flavonoids;spectrophotometry;analysis火龙果是仙人掌科三角柱属多年生植物,原产于墨西哥等中美洲沙漠地区,属典型的热带植物¨.由于火龙果具有丰富的营养价值和食用价值等特点,市场发展前景极为广阔.其花,果均是当地传统的食物来源和重要的经济作物,然而人们往往只注重火龙果果实的价值,而忽视了资源十分丰富的火龙果茎的应用.因此,分析火龙果茎中黄酮类化合物的含量对火龙果茎的开发和利用是很必要的.收稿日期:2009—05—04作者简介:郭璇华(1954一),女,汉族,副教授,研究方向为环境分析,食品分析,天然物分析.黄酮类化合物广泛存在于仙人掌科植物中,多数与糖结合成为黄酮苷类或以游离状态存在.黄酮类化合物的主要药理作用是治疗心脑血管疾病,而且还是一种天然的抗氧化剂,具有抗氧化作用和清除氧自由基作用J.目前国际上对黄酮类化合物的研究开发十分活跃,其产品的种类很多,是药物,植物化妆品开发和研究中的一个重要资源,有很大的开发利用前景.目前对于火龙果茎的开发利用较少,火龙果茎中提取黄酮类化合物的分析研究未见报道.1实验部分1.1实验1.1.1样品与试剂火龙果茎(广西火龙果种植园);芦丁(国药集团化学试剂有限公司生化试剂);石油醚(沸程:30～60~C),无水乙醇,甲醇,乙酸乙酯,NaNO2,NaOH,A1C13,AI(NO3)3),以上试剂均为分析纯.芦丁标准溶液(0.3200mg/mL):称取0.0800g经120~C减压干燥至恒重的芦丁样品;用50%(v/v)乙醇溶液加热溶解,冷却后移入250mL容量瓶中,用50%乙醇溶液定容.1.1.2实验仪器BS124S精密电子天平(德国塞多利斯天平公司);LG10型台式高速离心机(北京京立离心机有限公司);RE一52CS型旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂);U3010紫外可见分光光度计(日本HITACHI公司).1.2试验方法1.2.1火龙果茎样品的预处理将火龙果茎去刺,洗净,并用滤纸擦干,将其切成片状后放入搅拌机内搅碎成糊状,然后均匀涂抹于表面皿中,在80℃下烘至恒重,研磨成粉末状,得到火龙果茎干品.将火龙果茎干品用滤纸包好后,放入索氏提取器中加热提取6h,置于通风处晾干溶剂.1.2.2黄酮的分离和提取称取1.50g经石油醚提取处理后的火龙果茎干品,置于100mL圆底烧瓶中,按不同的料液比分别加人一定浓度乙醇溶液,在一定温度条件下,加热回流分离提取一段时间,将提取液离心后取上清液,定容至50mL.1.2.3黄酮的测定准确移取一定量的芦丁标准溶液或火龙果茎黄酮提取液于25mL容量瓶中,分别加入l%A1CI溶液3mL,以8%(v/v)乙醇定容,摇匀,静置20min后,在415.0nm处测量吸光度.2结果与讨论2.1显色方法的选择采用A1C13显色法和NaNO2,A1(NO3)3,NaOH显色法进行试验,不同显色方法的吸收光谱见图1,由图1一a和图1一b可见,A1C1显色法在420nm处有较明显的吸收峰,而NaNO,,Al(NO),NaOH显色反应在510nm左右的吸收峰相对于A1CI显色反应的吸收峰较弱.火龙果茎提取液中所含成分较多,在碱性条件下,许多物质在510nm左右产生吸收卜.综合考虑了两种显色方法对吸收光谱的影响,选用A1C1显色法作为火龙果茎中黄酮类化合物的显色方法.1.5A1.00.5O.O20o3004005006OO/nm3.02.5A2.01.51.00.50.01一a.Ala3显色法3004O0500600/nm1一b.NaNO2,Al(NO3)3,NaOH显色法图1不同显色方法吸光度图F喀1Absorptionspectraofdifferentmethods坌堑篓口凡,Adfffv:=:::二:=2.2AICI显色条件的选择2.2.1显色剂用量的影响移取5.OOmL芦丁标准溶液于7个25mL容量瓶中,分别加入1.00,2.00,3.00,4.00,5.00,6.00,7.00mL1%AIC1溶液,用50%(v/v)乙醇溶液定容至25mL,摇匀,显色20min,在415.0nm处测量吸光度.由图2一a可见,吸光度随A1C1的用量增大而递增,但不同用量增加程度有所不同.当1%AIC1溶液用量从1.00mL增大到3.00mL,吸光度增加了0.102,而当1%A1C1溶液用量从3.00mL至4.00mL吸光度基本不变,增大到7.00mL,对吸光度的影响幅度相对较小.2.2.2乙醇浓度的影响移取5.00mL芦丁标准溶液8份于8个25mL容量瓶中,各加入1%A1CI溶液3.00mL,再分别加,/020040060080010.00,120014.00mL无水乙醇,以蒸馏水定容,摇匀,显色20min后,在415.0nm处测量吸光度.由图2一b可见,乙醇浓度对该显色反应的影响较大,在乙醇加人体积为2mL时有较高的吸光度值.2-22.12.OI.91.81.7l234567VA1Q3/mL2一AICl3用量一吸光度图2一PlotofabsorbanceversusmountofAICI32.22.12.01.91.81.7024?6lUlZVC2H50HImL2一b.乙醇体积一吸光度图2一b.Plotofabsorbanceversusratioofethanol图2显色条件的影响Fig.2Effectsofconditionsonabsorbance2.2.3显色时间的影响移取5.00mL芦丁标准溶液按显色方法显色不同时间,在415.0nm处测量吸光度.实验结果表明,显色时间10min至60min范围内吸光度稳定.根据以上三个单因素实验,选择A1C1,显色法的显色条件为:加入1%A1C1溶液3.00mL,以8%(v/v)乙醇溶液定容,显色时间20min.2.3标准吸收曲线的绘制准确移取0.50,I.00,I.50,2.00,2.50,3.oo,3.50mL芦丁标准溶液于7个25mL容量瓶中,分别加入1%A1C1溶液3mL,以8%(v/v)乙醇定容,摇匀,静置20min后,在415.0nm处测量吸光度,以吸光度(A)为纵坐标,芦丁浓度(P)为横坐标作图得标准曲线,见图3,回归方程为:A=0.0333p一5.14×10一,相关系数R:0.99986.1.61.41.21.0《0.80.60.4O.251O152O253O35404550p/(rag/L)图3芦丁标准曲线图Fig.3Rutincalibrationc~uve2.4黄酮分离提取条件的选择2.4.1溶剂的选择称取2.OOg经石油醚提取处理后的火龙果茎干品四份,分别用水,乙酸乙酯,甲醇,无水乙醇提取,提取液显色后用紫外一可见分光光度计在250～600nm扫描.实验结果显示,乙酸乙酯提取物在400～600nm吸光度均较强,说明提取物中存在较多的干扰物质.而甲醇和无水乙醇的提取物在420nm处的吸收峰较明显,考虑到乙醇毒性小,价格低廉,所以本实验采用乙醇作为黄酮的分离提取溶剂.2.4.2正交实验火龙果茎中黄酮类化合物的提取主要受提取液浓度,提取温度,提取时间,料液比的影响,本文采用四因素三水平Lq(3)正交试验选择其提取条件,见表1.表1正交实验设计表Tab.1TheL9(3’)orthogonaltestdesign正交实验结果表明,影响黄酮分离提取的各因素主次顺序为:乙醇浓度>料液比>提取时间>提取温度.由方差分析得知,乙醇浓度对黄酮分离提取的影响显着,火龙果茎黄酮的最佳分离提取条件为A]BCD,即乙醇浓度为70%(v/v),料液比为1:40,提取温度为75~C,提取时间为3h.2.5火龙果茎中黄酮含量的测定称取1.500g火龙果茎干品3份,置于3个圆底烧瓶中,各加人70%(v/v)乙醇60.OmL,75cI=加热回流3h,将提取液离心分离,分别取上清液于3个50mL容量瓶中,以70%(v/v)乙醇定容.分别移取2.OOmL溶液于3个比色管中,加入1%A1C1溶液3.00mL,以8%(v/v)乙醇定容至25mL,摇匀,静置20min后,于415nm处测量吸光度.计算火龙果茎的黄酮含量(%),结果见表2.表2火龙果茎黄酮含量(n=3)Tab.2Determinationresultsofsamples(n=3)2.6回收率实验取1.5Og经石油醚索氏提取处理的火龙果茎干品5份,置于5个圆底烧瓶中,分别加人10.OOmL芦丁标准溶液,按2.5的方法分离提取黄酮并测定吸光度,计算回收率,结果见表3.表3火龙果茎黄酮回收率(n=5)Tab.3De~rminafionresultsofrecovery(n=5)(下转第228页)降约4.3%;20d后,该生物传感响应下降约20%;50d后,传感器的响应下降为最初的50%,说明该生物传感器具有较好的稳定性.考察了6种物质对H0传感器的干扰情况.当溶液中H0浓度为0.1mmol/L时,20倍的葡萄糖,乙醇,乙酸,柠檬酸,甘氨酸均无明显干扰,5倍的抗坏血酸存在一定的干扰.3结论本文以聚乙烯醇缩丁醛为固酶基质,将多壁碳纳米管与辣根过氧化物酶固定在电极表面制备了一种响应灵敏度高,稳定性好的过氧化氢生物传感器.该传感器固定酶的方法简单,易行,有较好的电流响应和较低的检测下限,是一种可行的过氧化氢测定方法.参考文献:[1]林倩,张菊,王晓芳,等.食品级过氧化氢的应用及其净化技术[J].食品科学,2006,27(10):626—629.[2]江国虹,杨溢,白世基,等.一起过氧化氢污染学生奶事件的调查报告[J].中华预防医学杂志,2003,37(5):391.[3]潘勇军,谢洪泉,谭晓明,等.碘量滴定法测定过氧化氢溶液浓度的改进[J].理化检验一化学分册,2003,39(7):404—405.[4]陈亚红,刘红梅,田丰收,等.酶催化分光光度法测定过氧化氢[J].理化检验一化学分册,2009,45(4):401—4O3.[5]MatsubaraC,KawamotoN,TalamuraK.Ultra—hig}lsensitivi.tyspectrophotometricreagentforhydrogenperoxide[J].Ana—lyst,1992,117:1781—1786.[6]NakashimaK,MakiK,KawaguchiS,eta1.Super—Dynamic—RangeMeasurementofFT—IRSpectrabyDelta—SigmaModu?lation[J].Ana1.Sci.,1991,7(1):709—713.[7]陈易晖,刘艳,周建立,等.高效液相色谱一紫外检测法测定食品中的过氧化氢[J].光谱实验室,2009,26(2):414—417.[8]ZhijuanWang,MeiyeLi,PingpingSu,et81.Directelectrontrans~rofhorseradishperoxidaseanditselectrocata1),sisbasedoncarbonnanotube/thionine/goldcomposites[J].Eleetrochemis—tryCommunications,2008,10(2):306—3l0.[9]ZhuoY,YuanR,ChaiYQ,eta1.Areagenflessamperometficbasedongoldnanoparticles/thionine/nafion—membrane—modifiedgoldelectrodefordeterminationofa一1一fetoprotein[J].Electrochem.Commun,2005,7(4):355—360.[10]ZenJM,LoCW.AGlucoseSensorMadeofallEnzymaticClayModifiedElectrodeandMethylViologenMediator[J].A—ha1.Chem.,1996,68(15):2635—2640.(上接第213页)由表3可见,加标平均回收率为98.0%,RSD=3.3%,表明本方法稳定,准确.3结论3.1A1C1,显色法适合于火龙果茎中总黄酮含量的测定.显色条件为:1%A1C1溶液3.00mL,以8%(v/v)乙醇溶液定容,显色时问20min;3.2火龙果茎中黄酮类化合物的最佳分离提取条件为:乙醇浓度为70%,料液比为1:40,提取温度为75℃,提取时间为3h;3.3火龙果茎中总黄酮含量为0.494%.加样平均回收率为98.0%,RSD=3.3%,表明本方法稳定,准确.参考文献:[1]马立安,江涛,汤钦林.仙人掌的营养保健价值与开发[J].食品研究与开发,2002,23(2):50—51.[2]FlorianCStintzing,AndreasSchieber,ReinholdCarle.Betaey—mainsinfruitsfromred—purplepitaya,Hylocereuspolyrhizus(Weber)Britton&Rose[J].FoodChemistry,2002(77):101—106.[3]周丽屏,郭璇华.火龙果茎的生物活性成分及其开发应用前景[J].食品研究与开发,2007,7(11):169—172.[4]郭璇华,周丽屏.火龙果茎化学成分的GC—MS/ICP—MS分析[J].分析试验室,2007,(11):104—107.[5]孙艳梅,徐雅琴,杨林.天然物质类黄酮的抗氧活性的研究[J].中国油脂,2003,28(3):54—56.[6]姚新生.天然药物化学[M].北京:人民卫生出版社,2002:167.[7]郭亚健,范莉,王晓强,等.关于NaNO2一AI(N03)3一NaOH比色法测定总黄酮方法的探讨[J].药物分析杂志,2002,22(2):97—99.[8]赵大洲,徐本明,刘河.三氯化铝络合分光光度法测定淫羊霍中总黄酮含量[J].中草药,2004,35(2):13—14.