决明子中黄酮类化合物提取方法 毕业论文

决明子中黄酮类化合物提取方法毕业摘要决明子是一种常用中药，富含黄酮，蒽醌和多糖，具有广泛的药理活性。现代药理学研究又明，决明子具有降血压、降血脂，保肝及抑菌等活性，被应用于多种降脂减肥的成方制剂中。同时，决明子又可作食用中药，是保健饮料的良好原料。实验过程中测定了决明子中黄酮类化合物的含量，采用乙醇回流水浴提取黄酮，对比研究提取时间、乙醇浓度、浸出温度和料液比等因素对提取效果的影响,再进行正交实验优化条件。含量测定应用紫外—可见分光光度法进行测定，并使用NaNO-Al(NO)-NaOH显色体系。233实验结果表明乙醇提取法效果最佳。在最佳提取条件75,乙醇为提取剂，80?下提取，提取时间3.5h，料液比1:30时。以芦丁为物质，绘制的标准标准曲线其2回归方程为C=96.838A-2.8675，相关系数R=0.9951。又测得提取液吸光度为0.428，黄酮浓度为37.0μm/mL，提取率为88.61%。关键词:决明子，黄酮类化合物，乙醇，提取工艺IAbstractSemenCassiaenatraditionalChineseherbalmedicine,whichisarichsourceofflavones,polysaccharidesandanthraquinone,havingawidespreadactivityinbiology.Modernpharmacologystudyalsoshowsthat,cassiaseedalsohavefallbloodpressure,fallhematicfat,protectliverandbacteriostasisactivities,beappliedtovariouscholesterol-loweringdietdrugsinpreparations.Meanwhile,cassiaseedandeatingChinesetraditionalmedicine,isthegoodhealthdrinkrawmaterial.Somechemicalseparationfactorswereadoptedtoextractflavonoids.Thisexperimentdeterminedthecontentofflavonoidsincassiaseed,andcassiaseedtheextractiontechnologyofflavonoidswerestudied.EthanolCondensingRefluxExtractionwereappliedtoextractflavonoids(Whenextracting，FiveextractionfactorsofflavonoidsfromSemenCassiaenwereinvestigatedandcompared,includingextractingtime，ethanolconcentration，extractingtemperatureandratioofliquidtosolid.Againtheoptimizationofprocessconditionsfororthogonalexperiment.QuantificationwasperformedbymeansofUV–VisspectrophotometrywithchromogenicsystemofNaNO–Al(NO)–NaOH.233Experimentsshowthatthattheethanolextractionwasbetterthantheother(Thefoundoptimumextractionconditionswerethattheethanolconcentrationwas75%(v/v),solid–liquidratiowas1:30,extractingtemperaturewas80?C,extractingtimewas3.5h.Usingtheconcentrationofrutinstandardsolutionasabscissaandtheabsorbencyasy-coordinate,thelinearchartwasconstructedandthestandardcurvetheregression2equationwasC=96.838A-2.8675(R=0.9951).Andmeasurementextractspectrophotometryfor0.428andtheyieldofflavonoidswas88.61%.Keywords:cassiaseed,flavonoids,ethanol,cxtractiontechnologyII目录第1章绪论...........................................................................................................-5-1.1研究背景与研究意义................................................................................-5-1.2研究进展...................................................................................................-5-1.2.1药用理作用研究.............................................................................-5-1.2.2化学成分研究.................................................................................-7-1.3黄酮类化合物的性质................................................................................-8-1.3.1黄酮类化合物的结构.....................................................................-8-1.3.2决明子中黄酮类功效...................................................................-10-1.3.3决明子中黄酮类化合物提取方法................................................-11-1.3.4黄酮类化合物的常用分析侧定方法............................................-13-1.4研究的目的与内容..................................................................................-13-第2章实验部分..................................................................................................-15-2.1仪器与药品.............................................................................................-15-2.1.1实验仪器......................................................................................-15-2.1.2实验药品......................................................................................-15-2.2实验过程.................................................................................................-16-2.2.1实验流程及装置图.......................................................................-16-2.2.2实验方案......................................................................................-18-2.2.3实验过程中主要事项...................................................................-20-第3章结果与讨论..............................................................................................-21-3.1芦丁标准曲线的制作..............................................................................-21-3.2黄酮含量及提取率..................................................................................-22-3.3单因素实验结果.....................................................................................-22-3.3.1提取剂的影响...............................................................................-22-3.3.2提取剂浓度的影响.......................................................................-23-3.3.3提取温度的影响...........................................................................-25-3.3.4提取时间的影响...........................................................................-26-3.3.5料液比的影响...............................................................................-27-3.4正交实验结果.........................................................................................-28-第4章结论........................................................................................................-30-III参考文献.........................................................................................................-31-致谢...................................................................................................................-32-附录A英文译文..............................................................................................-33-附录B英文原文..............................................................................................-44-IV第1章绪论1.1研究背景与研究意义决明子是我国传统中药，具有清肝明目、润肠遁便的作用，用于治疗各种眼科疾病。现代药理学研究又表明，决明子还具有降血压、降血脂，保肝及抑菌等活性，被应用于多种降脂减肥的成方制剂中。同时，决明子又可作食用中药，是保健饮料的良好原料。决明种子胶是又良好的悬浮剂和乳化剂，既可作甘汞、重质陶土的悬浮剂，亦可作橄榄油、液体石蜡和松节油的乳化剂(决明半乳甘露聚糖可作食品，药品和化妆品的增调剂及印染色素的载体，以上这些都使得决明予具有极其广泛的开发利用前途。但是，就目前情况来看，我国对中药有效成分的提取研究较少，许多生产企业还在采用陈旧的提取工艺，造成了资源的极大浪费，还导致环境污染，加工质量不稳定等因素，生产成木高，经济效益低。所以，本文选取决明子，对其有效成分黄酮类化合物进行提取研究。希望在中药高效提取和检测作一些可行性的探索，为开发利用我国中药材资源，提共一定借鉴。1.2研究进展决明子中黄酮成分在国内的研究起步相对较晚，其中的一些功能效用也只是在相应的文献中提及过，并未涉足深入的研究。上世纪九十年代以来，人们对中药材的综台利用价值产生了良好的兴趣，其存在广阔的开发前景。这当中，具有潜在价值的决明子中黄酮成分在医药、化妆品、食品保健中应用引起了人们的兴趣。1.2.1药用理作用研究决明子，叉名草决明、千里光、还瞳予、马蹄子、夜拉子等，为豆科植物决明的干燥成熟种子，早在《神农本草经》中就有―久服能益精光，轻身‖等记载，被列为120种―为君主养命以应天‖的上药之一。其性味甘、苦、咸、微寒，具有清肝明目，润肠通便之功效，是1国家卫生部公布的69种药食同源的物质之一。多年来国内外学者对决明子进行了大量的研究。(1)降血脂、降血压作用[2]决明子水、醇提取物对试验动物均有一定的降压作用。乙醇提取物可使自发遗传件高血压大鼠收缩压明显降低，给药前后收缩压、舒张压均明显降低(P<1.01)，作用的幅度和时间均优于利血平。其脂溶部分在1mg,kg对呈明显降压作用(P<0.05)，醇溶和水溶部分在-5-15mg,kg出观明显降压作(P<0.05)。[3]，决明子能抑制血清胆固醇升高和主动脉粥样硬化斑点潘正军等人所作动物试验表明形成。能明显增加血清HDL-C含量及提高HDL-C-TCM比值。改善体内胆固醇的分布状况。蒽醌糖苷是决明子降血脂的主要成分之一，其能减少肠道对胆固醇的吸收。增加排泄，通过反馈词节LDI(代谢，降低血清胆固醇水平，延缓和抑制动脉粥样硬化斑块的形成。(2)抑菌、免疫作用决明子水浸液、醇提液对大多数皮肤真菌和菌有不同程度的抑制作用。醋炙能增强决明子对金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、白色念珠菌的抗菌作用，还能增强决明子对大肠杆菌、福氏痢疾杆菌的抗菌作用。决明子蒽醌类对大肠杆菌金黄色葡萄球菌和青霉有较强的抑制[4]作用。竞争性抑制病原菌或肠道有害菌增殖，同时大大提高了机体的消化能力和抵抗力，有益宿主改善和恢复健康状态。另外，决明子乙醇、氯仿提取物对弯孢菌、金黄色葡萄球菌、镰刀菌、油菜菌核病菌、棉花炭疽病菌5种植物病原菌有一定抑制作用。其中对后两种病菌抑制效果最好。(3)减肥作用6,浓度的决明子水煎剂能明显抑制营养性肥胖大鼠体重增加，升高机体总抗氧化能力水平，且不影响食欲(无致腹泻作用。动物实验结果表明新决明内脂可减少大鼠的体重增加率;HepG2肝细胞基因表达图谱结果显示新决明内脂调节了46个与脂质代谢、蛋白代谢、[5]。细胞增生与凋亡等功能有关的基因(4)泻下和润肠通便目前普遍认为蒽醌类是决明子起泻下作用的主要成分。黎海彬,方昆阳等从决明子分离得到的红镰孢菌素、妥拉内酯、大黄酚糖苷3种泻下成分，前两种为萘的衍生物，后一种为[6]蒽醌类成分。决明子生品石油醚、正丁醇提取物和炒决明子正丁醇提取物，能明显缩短燥结便秘模型小鼠的首便时间，增加排便粒数及粪便重量，表明决明子泻下作用的有效成分主要集中于石油醚及正丁醇提取物中(可能是油脂类及苷类成分。决明子外壳(SCI)也具有通便润肠作用，其中蒽醌类物质通便作用主要体现为泻下，但伴随便秘，而多糖与纤维素的通便作用则平缓稳定(且两者结合后效果最佳。(5)保肝作用口服670mg,kg决明子水提取物对CCT、中毒小鼠肝脏有解毒保肝作用。其抗肝毒的主要成分为萘并吡喃酮类成分其中决明苷、红镰玫素-6-β-龙胆二糖苷和红镰玫素6a芹菜糖基[7](1-6)O-β-D-葡萄糖苷等萘井-吡喃酮苷具自显著的对抗半乳糖胺肝损伤作用。-6-1.2.2化学成分研究决明子为豆科植物决明(CassiaobtusifoliaL()和小决明(CassiatoraL()的干燥成熟种子，主要含蒽醌类、萘骈一吡咯酮类、脂肪酸类、氨基酸和无机元素等成分。(1)蒽醌类[8]决明中含有蒽醌类成分约为1.2,。种子含大黄酚、大黄素甲醚(physcion)、美决明子素(obtusifolin)、黄决明素(chryso—obtusin)、决明素(oblusin)、橙黄决明素(aruantioobtusin)、大黄索(emodin)、芦荟大黄素(aloe—emodin)、1-去甲基橙黄决明(1-desnxethvkllryso-obtusin)、黄决明索2-O-D葡萄糖苷。决明子中含有的蒽醌类化合物有导泻作用，能减少肠道对胆固醇等的吸收及增加其排泄。因此，决明子蒽醌苷可能是通过减少外源性脂质的吸收及增加排泄而降低血脂的。决明子蛋白质降脂作用的机理有待进一步研究。蒽醌另一重要功效是免疫功能的调节作用。通过对研究决明子蒽醌苷(SCAG)体外给药对小鼠细胞免疫功能的影响。结果SCAG体外给药可明显促进小鼠T及B淋巴细胞的增殖，增强巨噬细胞吞噬中性红的能力，提高NK细胞活性及分泌TNF活性，并可促进MLR，拮抗丝[6]裂霉素c对淋巴细胞增殖的抑制作用。结论SCAG体外给药可显著增强小鼠细胞免疫功能(2)多糖类目前对决明子的研究多针对其蒽醌类、吡酮类物质，而对决明子多糖的研究较少。多糖是由多个相同或不相同的单糖基以糖苷键相连而形成的高聚物，在自然界分布极广。60年代以来人们逐渐发现多具有复杂的、多方面的生物活性和功能，如免疫调节功能、[9]抗病毒、抗肿瘤、降血脂、降血糖等，且其在医药上是一种很好的佐剂。[10]决明子多糖效用抗氧化能力，体现在对HO诱导引起的红细胞溶血有较明显的抑制22作用，且在一定的浓度范围内随多糖浓度的增加，对红细胞溶血的抑制作用也增加，当多糖浓度达40.00,(即加入糖体积小于0.80m1)时，抑制率达45.31,。决明子多糖也抑制血清过氧化产物(MDA)的产生，加入糖浓度小于15.80,(即加入糖体积小于0.80m1)时，随着加入的糖浓度增加，吸光度值逐渐降低，即血清过氧化产物(MDA)浓度逐渐减小，氧化抑制率逐渐升高，可达50.00,;但当加入的糖浓度继续升高时，抑制血清被氧化的能力不再增加，表明糖抑制过氧化反应的作用是有一定限度的。(3)黄酮类决明中含有红镰玫素(rubrofu—sarunn)、决明子苷(casslaside)、决明内酯(toralactone)、决明-f-苷(eassiaslde)B及C、红镰攻素-6-O-龙胆二糖苷(rubro—fusarin6-O-gentle-bioside)。大决明中还有决明蒽酮(torosachryone)、异决明内酯(isororalactone)、决明于内(cassialactone)2,5-二甲氧基苯醌(2,5dimethoxybenzoquinone)、决明子苷(cassiaside)B2及C2小决明中还含有红镰攻素-6-O-芹糖葡萄糖苷{6-[α-D-apiofuranosyl(1-6)-O-β-D-glucopyranosyloxy-rubrofusarin}-7-及cassiToroside。黄酮类物质是本次研究的主要对象，其结构、性质、功效以及提取方法将在下节重点介绍。(4)其他物质据分析，每100g可食用部分的决明子含胡萝卜素6.58mg、核黄素0.14rag、抗坏血酸105mg。每克干品中含有含钾19.7mg、钙21.6mg，镁3.5rag、磷0.61rag、钠0.47rag，铁154微克、锰35微克、铜10微克。[11]，大决明种子含油脂4.65,,5.79,，其中主要成分为软脂酸、硬脂酸、油酸据报道和亚油酸。另外，大决明种子还含有十六烷,三十一烷，胆甾醇、豆甾酵、争谷簪醇、1,3-二羟基(3-甲基葱醌。小决明油中还含有少量锦癸酸(malvalicaeid)，及菜子甾酵(campester01)。不同种类的决明予还含有Fe，Zn，Mn，Cu等多种无机元素，以及胱氨酸，T一羟基精氨酸，组氨酸，葡萄糖，半乳糖，木糖，棉子糖和天门冬氨酸等多种糖类及氨基酸。1.3黄酮类化合物的性质黄酮类化合物多为结晶性固体，少数为无定形粉末。一般黄酮、黄酮醇及其甙类多显灰黄,黄色，查耳酮为黄一橙色，而双氢黄酮、双氢黄酮醇、异黄酮类不显色或微显黄色。一般游离甙元难溶或不溶于水，易溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯等有机溶剂及稀碱液中。由于分子中多有酚羟基，故黄酮类化合物一般显酸性。利用分子中的酚羟基和Y一毗喃环的性质，黄酮类化合物具有一些特征的显色反应H1:盐酸-镁粉反应，钠汞齐还原反应等还原显色反应，与金属盐类试剂的络合反应，与碱的反应等，其中有些反应可以作为其鉴定反应。1.3.1黄酮类化合物的结构常见的黄酮类物质有槲皮素、芦丁、儿茶素、毛地黄黄酮、白藜芦醇及其衍生物等,图1-1所示为具有代表性的一中黄酮结构。-8-图1-12-苯基色原酮(黄酮)目前黄酮类化合物其基本骨架具有C-C-C的特点，即由两个芳香环A和B，通过中央636三碳链相互连接而成的一系列化合物。其基本结构如图l-2。1-2C-C-C结构图636根据三碳链的氧化程度、B环(苯基)连接位置(2—或3—位)以及三碳链是否构成环状等特点，可将重要的天然黄酮化合物分类如表1-1所示。表1-1黄酮类化合物的主要结构名称三碳链部分结构名称三碳链部分结构黄酮类花色素类(续表)名称三碳链部分结构名称三碳链部分结构酮蠢异黄酮类二氢黄酮类查耳酮类-9-二氢黄酮醇橙酮类黄2烷-3-醇类黄烷一3,4-二醇类1.3.2决明子中黄酮类功效近几十年来随着生物学、生物化学、生理学的日新月异的发展，黄酮类化合物的生物活性的研究引起了国内外的重视。黄酮类化合物的研究发展很快，1950年发现104种(甙类除外)，1962年累计达到201种，1965年近400种，1973年约为750种，1965年至1973年的八年时间，就发现了新黄酮化合物约为350种(不包括甙类)。到2001年底，已鉴定的生物类黄酮有6400种。(1)抗氧化作用食物中丰富的黄酮类物质发挥强氧化作用，其作用是通过抑制和清除自由基和活性氧来避免氧化损伤，其抗衰老的作用机制主要与抗氧化作用有关。能够降低冠心病发病率和死亡率，日本、美国等国家的调查得出类似的结论。[12]关于衰老机理的自由基学说认为，机体内的自由基可在细胞代谢过程中产生，也可由环境因素促成。随年龄增长，体内自由基增多。自由基在体内可直接或间接地发挥强氧化剂作用而与机体内核酸、核蛋白和脂肪酸相结合，转变成氧化物或过氧化物使之丧失活性或变性，细胞功能发生障碍，引起机体逐渐衰老或病变已有实验证明多种黄酮类化合物具有抗衰老的作用，如茶多酚、木犀草素、芦丁等。(2)抗癌抗肿瘤作用许多黄酮类化合物具有抗肿瘤抗癌功能。方式之一是通过直接杀灭肿瘤细胞、阻止其分裂繁殖而达到抗肿瘤抗癌的作用;第二种抗肿瘤方式是通过增强其他物质的活性间接杀死肿瘤细胞;第三种方式主要是指能减小甚至消除一些化学致癌物的致癌毒性。(3)心血管功能黄酮类化合物是临床治疗心血管的疾病的良药，有强心、扩张冠状血管、增加冠脉血流量、抗心率失常、降压、降低血胆固醇并使其与磷脂比例趋于正常、降低毛细血管渗透性等作用。例如，葛根总黄酮能扩张冠状动脉，增加冠状流量、降低心肌耗氧量、改善急[13]性缺血心肌侧支循环啡。(4)抗心脑血管疾病黄酮类化台物具有扩张血管的作用，可以改善心肌平滑肌的收缩舒张功能，其作用机-10-2+2+[14]内流和细胞内Ca释放有关。甲基黄酮醇胺盐制与黄酮类化合物调节平滑肌细胞膜外Ca酸赫MFA前期研究表明:MFA有抗实验性心率失常、实验性心肌梗塞和实验性血栓形成的作用，可以抑制钾钙引起的兔主动脉条及平滑肌收缩。此外淫羊藿昔也具有扩张血管的作用。(5)免疫调节作用黄酮类化合物能增强机体的非特异免疫功能和体液免疫功能，其通过对巨噬细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞、自然杀伤细胞NK、LAK细胞、细胞因子以及影响胸腺来进j于免疫调节作用。(6)抑菌抗病毒黄酮类化合物抗菌抗病毒作用已经得到医药界的肯定。这方面进行的研究较多，如银杏黄酮、槲皮素、桑色素、山奈酚和杨梅黄酮等均有抗病原微生物和抗病毒的作用。黄芩素(BAI)是黄芩中抗菌的有效成分。研究表明，BAI对多种革兰染色阳性菌、革兰染色阴性菌及螺旋体等均有抑制作用。黄芩也具有抗真菌活性，对多种致病性真菌，如白色念珠菌，许兰毛癣菌等有一定抑制作用。近来研究显示，BAI还具有抗艾滋病病毒HIV的作用，能诱导感染HIV的细胞发生凋亡。(7)降血糖血脂作用动物实验证明葛根黄酮、飞蓟素等具有有降血脂和降低胆固醇的作用。它们可显著降低四氧嘧啶诱导的糖尿病大鼠的血糖和血清胆固醇水平，降低胰岛的MDA水平，升高血和胰岛的谷光甘肽(GSH)水平。麦胚黄酮卷柏黄酮可降低糖尿病大鼠血清过氧化脂含量，增强谷光甘肽过氧化酶的活力。其作用机制与清除自由基，抑制脂质过氧化反应，对抗四氧嘧啶所致的β-细胞损伤促进β-细胞修复和再生密切相关。此外枸杞黄酮等也有降血脂的作用。(8)黄酮类化合物在食品方面的应用除了作为药物使用以外，在食品工业上，也把它作为功能食品的添加剂、天然抗氧化剂、天然色素和天然甜味剂等等。近年来上市的保健产品中，大部分功效成分都属于黄酮类化合物。从加工过程看主要有两种形式，一种是用富含黄酮类的原料直接加工成食品，在加工过程中最大程度地保留有效成分;另一种是从原料中提取出黄酮类物质，再把他添加到其他原料中进行加工制成产品。1.3.3决明子中黄酮类化合物提取方法黄酮提取的方法很多，主要是根据黄酮化合物的结构与来源的不同，溶解性差异较大，因此，应根据其极性和水溶性的大小选择合适的溶剂进行提取。目前，对苷类和极性较大的苷元，常用某些极性较大的混合溶剂(如甲醇,水(1:1)、水、甲醇、乙醇、丙酮进行提取，而对大多数苷元则采用乙醚、氯仿、乙酸乙酯等极性小的溶剂进行提取。-11-决明子中黄酮类化合物为极性较大的甘元，所以主要用有机溶剂提取法、微波提取法15。等方法。生物酶法提取植物中黄酮的提取效果好、提取率高，已被广泛应用(1)水提法水提法仅限于黄酮苷类物质，在提取的过程中要考虑加水量、浸泡时问、搅拌速度、煎煮时间及煎煮次数等因素。此工艺成本低、安全、设备简单，适合工业化大生产，但是用水提取时，提取中杂质较多(如无机盐、蛋自质、糖类等)，后续分离麻烦。现在，很少单一使用本方法。(2)碱性水或碱性稀醇提取法黄酮类物质大多具有酚羟基，因此可以用碱水或碱性稀醇浸出，经酸化后得出黄酮类物质。主要用碱性溶液是吸氢氧化钠和石灰水(氢氧化钙水溶液)。氢氧化钠水溶液的浸出能力高，但杂质较多不利于纯化。石灰水可以使,些鞣质和水溶性杂质沉淀生成钙盐沉淀，但浸出效果不如氢氧化钠水溶液效果好，同时有些黄类化合物能与钙结合成不溶性物质，不被溶出。一般可以根据不同的原料使用不同碱性溶液。(3)有机溶剂提取法这是国内外使用最广泛的方法。有机溶剂主要用乙醇、甲醇、丙酮、正丁醇等。此方法主要用于提取脂溶性基团占优势的黄酮类物质，对设备要求简单，产品得率高，但成本较高，杂质含量也较高。常见的可以分为三种方法:冷浸法、渗漉法、回流法。有机溶剂提取中最常使用的溶剂是乙醇，乙醇的浓度对总黄酮的提取有较大的影响。一般来说，乙醇的浓度增高有利于总黄酮的提取，但也不是绝对的，有时还与黄酮类物质的结构有关，高浓度的乙醇适用于提取黄酮苷元类，的浓度乙醇适用于提取黄酮苷类。本方法经常与液——液萃取法、吸附洗脱法相结合，能得到更高纯度的精制物。(4)微波法微波技术在中草药的应用上越来越广泛，原理是利用磁控管所产生的每秒24(5亿次超高频率的快速震动，使药材内分子问相互碰撞、挤压，有利于药材有效成分的浸出。此法对黄酮类物质的提取也取得了不错的效果，具有反应高效性和强选择性等特点，操作简单、副产物少，产率高及产物易提纯等优点。浸出过程中中药材细粉不凝聚、不襁化，克服了热水法易凝聚、糊化的不足。(5)酶解法对于一些黄酮类物质被细胞壁包围不易提取的原料使用酶解的法比较实用。原理是没能够充分破坏以纤维索为主的细胞壁结构及其细胞间相连的果胶，使植物中的果胶完全能够分解成小分子物质，减小提取的传质阻力，是植物中的黄酮类物质能够充分地释放出来。(6)超临界萃取法-12-萃取技术是以液态C0为溶剂进行提取的，是一种不同于传统黄酮类物质提取超临界C022的新工艺，它的提取率与提取温度、提取压力、C0消耗量等因素有关。与其它工艺相比较，2该技术具有提取率高、无残留溶剂、无污染，活性成分和热不稳定成分不易被分解破坏而保持天然特征，此技术为中草药有效成分的热敏性物质的提取研究开辟一条新路。同时，还可以通过控制临界温度和压力达到选择性提取和分离纯化的目的。缺点是超临界提取所需设备价格昂贵、生产成本高、提取物中烷基酚含量较高、对极性大的物质提取不理想。目前还难以进行规模化生产，但本法在生产银杏黄酮的技术上取得了重大突破.1.3.4黄酮类化合物的常用分析侧定方法(1)比色法[16]这是分析提取物总黄酮含量最普遍的方法。通常采用的显色方法有以下两种:亚硝酸钠-硝酸铝显色法以芦丁为标样，将一定量提取液置25mL比色管中，用30,(v/v)乙醇补充至12.5mL，加入0.7mL5,NaNO，摇匀，静止5min后加入0.7mL10,Al(NO)，6min233后再加入5mL4,NaOH，摇匀，用30,(v/v)L醇稀释至刻度，10rain后于510nm进行比色。AlCl显色法以芦丁为标样，在测定液中加入AlCl摇匀，室温放置10min，按分光光33度法，在200-500nm范围内迸行扫描，寻找二者重叠最吸收波长，测定。两种方法机理不同，亚硝酸钠-硝酸铝显色原理文献认为是芦丁NaNO-Al(NO)-NaOH2333+试剂在芦丁B环的3’,4-邻二酚羟基部位反应产生红色物质。AlCl显色法原理是Al与3-或3-fE基与4-羟基，或者B环的3’,4二邻二酚羟基络合显色。5(2)紫外法采用标准品与提取液在紫外区扫描，确定最大吸收波长，制标准曲线测定总黄酮含量(3)HPLC法在银杏、花生壳的黄酮定量中，由于黄酮苷较多，多采用酸水解成苷元，在测定总黄酮的方法中，大多采用榭皮素作对照品，也有用懈皮素、山奈酚和异鼠李素三种作为对照品。1.4研究的目的与内容本文的研究目的是应用有机溶剂萃取方法，提取决明子中黄酮类化合物。重点研究不同提取条件对黄酮提取效率的影响，确定其影响程度的大小，寻找最佳提取工艺条件。本论文的研究包括以下内容:(1)芦丁标准曲线的绘制。(2)决明子中黄酮总含量的测定。(3)不同提取剂对决明子中黄酮浸提效果的影响。-13-(4)乙醇浓度对决明子中黄酮浸提效果的影响。(5)提取温度对决明子中黄酮浸提效果的影响。(6)提取时间对决明子中黄酮浸提效果的影响。(7)料液比对决明子中黄酮浸提效果的影响。(8)进行正交实验确定最佳提取条件。-14-第2章实验部分黄酮类化合物的溶解度与黄酮苷元的结构及其配基的不同而有很大的差异，一般游离苷元难溶于水，易溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯、乙醚等有机溶剂中。黄酮类苷元分子中引入的羟基越多，其溶解度越大。黄酮类化合物的羟基糖苷元化后，水溶解度较大，而在一些较低极性的有机溶剂中溶解度较低。黄酮苷一般易溶于水、乙醇、甲醇等强极性的溶剂中;难溶于或不溶于苯、氯仿等有机溶剂中。糖链越长，则水溶解度越大。2.1仪器与药品2.1.1实验仪器表2-1实验仪器名称型号生产厂家循环水式多用真空泵SHB—?郑州长城科工贸有限公司HHS—2S电子恒温不锈钢水浴锅上海市南阳仪器有限公司722N可见分光光度计上海精科电子有限公司DZHW调温电加热套河北省黄骅市中兴仪器有限公司AW220电子天平慈溪市天东衡器厂QE—100大功率粉碎机武汉县工具有限公司-天津北辰区光明仪器厂索氏提取器M22型中量天津玻璃仪器厂蒸馏装置202—3北京金北德工贸有限公司电热干燥箱2.1.2实验药品选用决明子在北吉大药房购得，产地为广西省。-15-表2-2实验药品名称分子式纯度生产厂家芦丁标准物质CHOA.R西安旭煌生物技术有限公司27301695%乙醇CHCHOHA.R天津永晟精细化工有限公司32无水甲醇CHOHA.R天津光复精细化工研究所3丙酮CHCOCHA.R天津风船化学试剂科技有限公司3石油醚-A.R天津永晟精细化工有限公司亚硝酸钠NaNOA.R天津永晟精细化工有限公司2硝酸铝Al(NO)?9HOA.R天津永晟精细化工有限公司2332氢氧化钠NaOHA.R天津永晟精细化工有限公司。2.2实验过程2.2.1实验流程及装置图实验流程如图2-1所示。中药决明子粉碎乙醇蒸馏1黄酮水溶液决明子粉末提取液回流提取回收乙醇加脱入色石除油脂醚测定吸光度加入显色剂黄酮水溶液2吸光度A黄酮标准溶液30%乙醇图2-1黄酮提取实验流程实验所用仪器装置见图2-2.、2-3-16-数显恒温水浴锅设定测量图2-2提取装置图2-3蒸馏装置-17-2.2.2实验方案1.标准溶液的配制和标准曲线制作将芦丁于120?下干燥至恒重，准确称取芦丁标准样品0.0200g，用30,乙醇溶解，定溶于100mL，得浓度为0.200mg/mL芦丁标准液。准确吸取芦丁标准液0mL、0.5mL、1.0mL、1.5mL、2.0mL、2.5mL、3.0mL于10mL容量瓶中，加入5%NaNO液0.3mL，摇匀，放置6min2后加入10%Al(N0)溶液0.3mL，摇匀，放置6min后加入4%NaOH溶液4.0mL，再用30%乙醇33定容，摇匀，以30%乙醇为空白参比，l0min后用lcm比色皿于510nm测定吸光度A，得到芦[17]丁标样含量Y(μg/mL)与吸光度A间的关系，画出标准曲线。2.决明子中黄酮平均含量的提取及测定决明子中总黄酮平均含量的测定。分3次分别准确称取3.0决明子粉末，用滤纸包住并用棉线捆好，置于索氏提取器中，用100mL甲醇体积浓度75,，80?水浴加热回流，当索氏提取器中的溶液由黄色接近无色时，取出用滤纸包住的决明子粉末，蒸馏回收甲醇至近干，加水约80mL溶解，加入20mL石油醚脱色2次，弃去醚层。加水于100mL容量瓶中定容，作[17]为待测液。取待测液10mL于50mL容量瓶中，用30,乙醇定容，取2.0mL于10mL容量瓶中，[18]以下按照测定芦丁标准液吸光度的方法测定吸光度A。重复3次，结果取平均值。从决明子中提取的黄酮含量可按下列公式计算:-6M(%)=[Y×(100/10)×(50/2)×10×10×100]/w式中:100/10和50/2—稀释倍数;w—决明子重(g)。提取率(%)=(提取黄酮含量/决明子[18]中总黄酮的平均含量)×100。3.决明子中总黄酮的提取及测定准确称取3.0g决明子粉末置于磨口三颈烧瓶中，按照的配方加入一定量的提取剂，在一定温度下回流提取一定时间，趁热减压抽滤，滤渣加适量水洗涤、过滤(合并清液后得提取液，再蒸馏，回收溶剂至近干，再按照2中的步骤配置待测液，以下按照测定芦丁标[19]准液吸光度的方法测定吸光度A，计算黄酮提取率。4.提取溶剂的选择[16]分别用沸水、碱性水溶液(pH值9.0)、75,乙醇溶液、75,甲醇溶液、75,丙酮溶液，80?水浴下，回流浸提3.0h，料液比为1:20分别提取，测定其吸光度，计算其提取率分别。5.影响提取效果的因素(1)乙醇浓度对浸提效果的影响分别采用65%、75%、80%、85%、95%的乙醇浓度按3的操作步骤进行试验，在80?下，回流提取时间为3.0h，料液比为1:20，提取决明子中黄酮类化合物的试验，得出乙醇浓度对提取效果的影响。(2)提取温度对浸提效果的影响[16]分别采用50?、60?、70?、80?、90?、的提取温度按3的操作步骤进行试验，以-18-浓度为75%的乙醇为提取剂，回流提取时间为3.0h，料液比为1:20，提取决明子中黄酮类化合物的试验，得出提取温度对提取效果的影响。(3)料液比对浸提效果的影响1:20、1:25、1:30、1:35(g:mL)的料液比例按3的操作步骤进行试验，以分别采用1:10、浓度为75%的乙醇为提取剂，回流提取时间为3.0h，提取温度为80?时，提取决明子中黄酮类化合物的试验，得出料液比对提取效果的影响。(4)提取时间对浸提效果的影响分别采用1.0h、2.0h、3.0h、3.5h、4.0h的提取温度按3的操作步骤进行试验，以浓度为?，料液比为1:20，提取决明子中黄酮类化合物的试验，75%的乙醇为提取剂，提取温度为80得出提取时间对提取效果的影响。单因素实验条件见表2-3所示。表2-3单因素实验条件表乙醇浓度提取温度料液比提取时间恒温水浴80?75%浓度乙醇75%浓度乙醇75%浓度乙醇提取时间3.0h提取时间3.0h提取时间3.0h恒温水浴80?料液比1:20g:ml料液比1:20g:ml恒温水浴80?料液比1:20g:ml165%60?1:101.0h275%70?1:202.0h380%80?1:253.0h485%90?1:303.5h595%60?1:354.0h6.正交试验确定提取的最佳条件4为了全面考查影响因素，设计了4因素3水平的正交试验，试验因素水平见表2-4，L(3)9正交表见表2-5。表2-4正交实验因素水平表水平因素-19-乙醇体积分数(A)%温度(B)?料液比(C)g:mL浸提时间(Dh165701:202.5275801:253.0385901:303.54表2-5L(3)正交表9ABCD1111121222313334212352231623127313283213933212.2.3实验过程中主要事项(1)决明子粉碎粒度要均匀，使用前要经过一定的干燥处理。(2)提取过程中，保持提取温度稳定，一定不能使溶剂挥发。(3)蒸馏回收乙醇过程中，温度上升到90?左右是，停止加热，防止过热使黄酮分解。(4)脱色除脂过程中，要待分层结束，醚层上部出现澄清液时，再分液。(5)配置黄酮标准液时，加入显色剂后，需静止一段时间，再加下一种药品。-20-第3章结果与讨论3.1芦丁标准曲线的制作本实验过程中，黄酮类化合物检测以标准物质，应用亚硝酸钠-硝酸铝显色法，通过测定吸光度来确定黄酮类物质的含量。可见分光光度计的波长选取510nm。其结果见表3-1表3-1标准工作曲线的测定结果VC吸光度A芦丁溶液()芦丁标准溶液()mLμg/mL1000.00020.510.11031.020.23241.530.34852.040.46062.550.57373.060.684由上表，以吸光度值——芦丁浓度作图得，807060m/mLμ/50403020芦丁标准液浓度1000.00.10.20.30.40.50.60.70.8吸光度A图3-1芦丁标准工作曲线图-21-用最小二乘法作线性回归，得芦丁浓度C与吸光度A的标准曲线回归方程式:2=0.9951C=96.838A-2.8675，相关系数R3.2黄酮含量及提取率黄酮总含量的测定应用索氏提取器，测定3次，求的平均含量。(0.492+0.477+0.480)/3=0.483，由图3-1的，黄酮的浓度为44.1μg/mL。-6M(%)=[Y×(100/10)×(50/2)×10×10×100]/w。-6M(%)=[44.1×10×25×10×10×100]/3=3.675%。3.3单因素实验结果3.3.1提取剂的影响通常按极性化合物易溶于极性溶剂，非极性化合物易溶于非极性溶剂，同类分子或官能团相似的彼此互溶的一般规律来选择，溶剂选择适当，就可以比较顺利地将需要的成分提取出来。选取溶剂的要求是:(1)溶剂对所需成分的溶解度要大，对杂质的溶解度要小，或反之。(2)溶耕不能与植物成分产生化学反应，即使反应亦属于可逆性的。(3)溶剂要经济易得，并具有一定的安全性((4)沸点应适中，便于回收反复使用。本实验中选取沸水、PH=9的碱性水溶液、75,乙醇溶液、75,甲醇溶液、75,丙酮溶液实验结果如图3-2。图3-2提取剂的影响提取剂种类吸光度A提取率(%)黄酮浓度(μg/mL)0.09319.38.2沸水0.14329.613碱性水溶液(PH=9)0.37577.632.875%乙醇0.37076.532.075%甲醇0.35474.331.875%丙酮提取溶剂种类对黄酮的提取率的影响效果见图3-2-22-8010090708060黄酮浓度70/%50605040/μ4030m/mL黄酮提取率30黄酮提取率/%20黄酮浓度/μm/mL20101000沸水碱性水溶液乙醇甲醇丙酮提取剂种类图3-2提取剂种类的影响从图2-1以看出，在提取时间，提取料液比和一定的情况下，以水为提取剂的提取效果最差。碱性水溶液的提取效果略好，但是提取液颜色偏灰色，杂质较经石油醚脱色，提取效率与沸水相比提取并不多。以甲醇、乙醇和丙酮作为提取剂时效果较好，三种提取剂提取效率相差不大，综合考虑沸点、分子极性、化学性质、毒性、成本等因素选择提取剂。其中乙醇具有溶解性能好，对植物细胞的穿透能力强的优点，除了蛋白质、粘液质、果胶、淀粉和部分多糖等外，大多数有机化合物都能在乙醉中溶解;乙醇虽然易燃，但毒性小、价格便宜、来源方便、沸点适中，也可回收反复使用，本身还具有杀菌作用，不易发霉变质。考虑到提取效果、提取溶剂成本以及残留等因素，以乙醇提取剂为最佳。3.3.2提取剂浓度的影响实验过程中选取乙醇提取浓度分别为65%、75%、80%、85%、95%，提取条件保持，在80?下，回流提取时间为3.0h，料液比为1:20，结果见表3-3。图3-3提取剂浓度的影响乙醇体积浓度(%)吸光度A提取率(%)黄酮浓度(μg/mL)-23-650.32767.728.2750.37577.632.8800.36776.032.0850.34972.330.4950.33368.928.7提取溶剂浓度对黄酮的提取率的影响效果见图3-34010095353090黄酮浓度2585/%黄酮提取率/%8020黄酮浓度/μm/mL/μ1575m/mL黄酮提取率70105650606065707580859095100乙醇体积浓度/%图3-3提取剂浓度的影响由图3-3从65,到75,随着提取时乙醇浓度的增加，黄酮的提取率明显增加，乙醇浓度为80,时，黄酮提提取率与75%变化不大，当浓度升到85,时黄酮提提取率随着乙醇浓度的继续增加，黄酮提取率下降。原因是当乙醇浓度为75,时，溶液的极性与决明子中黄酮的极性最为接近，另一原因是当乙醇体积浓度超过75,，由于脂溶性物质的溶出显著增加，会给提纯带来麻烦。因此，确定乙醇的体积浓度以75,为好因此，以浓度为75,的乙醇作为提取剂时，决明子中黄酮类化合物的提取率达到最高。-24-3.3.3提取温度的影响实验中选取60、70、80、90?，4个不同提取温度，其他提取条件选取75%的乙醇为提取剂，回流提取时间为3.0h，料液比为1:20，结果见下表3-4图3-4提取温度的影响提取温度(?)吸光度A提取率(%)黄酮浓度(μg/mL)600.30863.826.4700.34771.830.1800.37577.632.8900.36976.431.8提取温度对黄酮的提取率的影响效果见图3-4100403595黄酮浓度9030黄酮提取率/%/%2585黄酮浓度/μm/mL/μ2080m/mL1575黄酮提取率107065506050556065707580859095100提取温度/?图3-4提取温度的影响根据图3-4可知提取温度在60?到80?之间，决明子中黄酮的提取率随着温度的升高呈现明显的增大的趋势，分析其原因可能是因为提取温度越高，分子扩散速度加快，有利于细胞内黄酮的溶解浸出，故认为80?为最佳提取温度。但温度达到90?，提取率略有下降。-25-其原因是达的90?时提取剂呈现沸腾状，提取剂有一定损失。或者是在此温度下，黄酮发生氧化分解。3.3.4提取时间的影响实验过程中分别选取提取时间1.0h、2.0h、3.0h、3.5h、4.0h，提取剂浓度为75%，提取温度为75?，料液比为1:20，结果如表3-5。图3-5提取时间的影响提取时间(h)吸光度A提取率(%)黄酮浓度(μg/mL)1.0.0.24350.320.92.00.31164.427.03.00.37577.632.83.50.38980.533.74.00.40183.035.0提取时间对黄酮的提取率的影响效果见图3-340100359030黄酮浓度/%80252070/μ15m/mL黄酮提取率/%黄酮提取率黄酮浓度/μm/mL601055000.00.51.01.52.02.53.03.54.04.55.0提取时间/h图3-5提取时间的影响-26-根据图3-5可知，提取时间在1.0h至3.0h黄酮提取率明显增大，3.0h后提取率继续增大但幅度不明显。原因是随着提取时间增加，黄酮提取量随之增加，时间增加到一定程度后，黄酮的浸出量几乎达到饱和，因此提取液中黄酮含量在3.0h后无明显变化。所以认为提取时间在3.0h为宜。3.3.5料液比的影响实验过程中应用1:10、1:20、1:25、1:30、1:35(g:mL)，5种不同的料液比，提取条件为75%的乙醇为提取剂，回流提取时间为3.0h，提取温度为80?，结果见表3-6图3-6料液比的影响料液比(g:mL)吸光度A提取率(%)黄酮浓度(μg/mL)1:10.0.27356.524.51:200.37577.632.81:250.39080.733.81:300.40383.434.9(续表)料液比(g:mL)吸光度A提取率(%)黄酮浓度(μg/mL)1:350.41185.135.710040359030黄酮浓度/%258020/μm/mL7015黄酮提取率黄酮提取率/%黄酮浓度/μm/mL106050501:101:201:251:301:35料液比/g:mL图3-6料液比的影响-27