蓝山投资投资总监梁刚(下) —— 趋于公司制的有限合伙制基金

实验四、马铃薯块茎多酚氧化酶（PPO）活性测定及酶学性质一、???实验目的1掌握分光光度法测定多酚氧化酶活性的一般原理及操作技术方法。2了解酶的活性与植物组织褐变以及生理活动之间的关系。二、???实验原理马铃薯不耐储藏，在加工过程中去皮切分后非常容易发生酶促褐变，使外观品质和营养价值大为降低，制约着马铃薯的开发利用。酶促褐变是马铃薯加工产业必须解决的难题。其中多酚氧化酶是导致马铃薯等果蔬发生酶促褐变的重要酶类。多酚氧化酶活性大小直接影响酶促褐变程度。多酚氧化酶(polyphenoloxidase，PPO)又称酪氨酸酶、儿茶酚酶、酚酶等．是自然界中分布极广的一种含铜氧化酶．普遍存在于植物、真菌、昆虫的质体中。植物受到机械损伤和病菌侵染后，PPO催化酚与O2氧化形成醌，使组织形成褐变．以便损伤恢复，防止或减少感染，提高抗病能力。研究多酚氧化酶的特性对食品的加工与保藏工艺有非常重要的意义。因此，检测食品中多酚氧化酶具有重要意义。多酚氧化酶是一种含铜的氧化酶，在一定的温度、pH条件下，有氧存在时，能使催化邻苯二酚氧化生成有色物质，单位时间内有色物质在410nm处的吸光度与酶活性强弱成正相关，在分光光度计410nm处使反应体系的OD值产生变化，通过OD值的变化确定PPO的酶活大小。?????????????????????????????多酚氧化酶?邻苯二酚（儿茶酚）＋1∕2?O2??——————→?邻醌?＋?H2O?三、试验材料、试剂及试验用品1．材料：马铃薯块茎。?2．仪器：分光光度计；离心机；恒温水浴；研钵；试管；移液管；容量瓶3．试剂：0.1mmol/L磷酸缓冲液（pH=7.0）；0.01mol/L邻苯二酚；0.1mol/L磷酸氢二钠；0.1mol/L磷酸二氢钠；10mmol/L柠檬酸；10mmol/L抗坏血酸；10mmol/L乙二胺四乙酸二钠（EDTA）；10mmol/L亚硫酸钠四、实验方法：1.多酚氧化酶的提取　取0.5g马铃薯块茎样品，加入预冷的磷酸缓冲液（pH7.0）3ml，研磨匀浆，转移到离心管中，再用7mL磷酸缓冲液冲洗研钵，合并提取液，在４℃下离心（8000r/min）5min，取上清液为多酚氧化酶提取液，并量取粗酶液体积。2.多酚氧化酶活性测定采用比色法测定。将0.5ｍl邻苯二酚加入2ｍl磷酸缓冲液（ｐＨ7.0）中，加入0.5ｍl酶提取液，立即于波长410nm下测定吸光值，2min后再计吸光值，以不加酶提取液的反应液做对照(注意空白为：2.5ml缓冲液和0.5mL邻苯二酚溶液)。以每分钟吸光度变化0.01为1个多酚氧化酶活性单位。表1多酚氧化酶活性测定 磷酸缓冲液（mL） 邻苯二酚（mL） 粗酶液（mL） OD410 2min后OD410 △OD410 酶活力（U） 空白组 2.5 0.5 0 试验组 2.0 0.5 0.5 3.多酚氧化酶酶活的计算公式：以每克样每分钟内A410增加0.01为1个酶活力单位U。?????????????????????????????△A410×酶提取液总量（ml）酶活力（0.01A/gmin）＝—————————————————?—?—??????????????????0.01×反应时间(min)×样品鲜重(g)×测定时酶液用量(ml)4酶学特性4.1PH对多酚氧化酶活性的影响室温下在试管中加入已配好的不同pH值的缓冲溶液2.0mL，邻苯二酚0.5ml，多酚氧化酶粗酶液0.5mL，混匀后迅速测定吸光度，转换为多酚氧化酶的活性。以缓冲液pH值为横坐标，多酚氧化酶活性为纵坐标，作出酶活—pH曲线，以确定最适pH值。表2pH对多酚氧化酶活性的影响 组号 不同pH的磷酸缓冲液（mL） 邻苯二酚（mL） 粗酶液（mL） OD410 2min后OD410 △OD410 酶活力（U） 1 pH=4，2.0mL 0.5 0.5 2 pH=5，2.0mL 0.5 0.5 3 pH=6，2.0mL 0.5 0.5 4 pH=7，2.0mL 0.5 0.5 5 pH=8，2.0mL 0.5 0.5 4.2温度对多酚氧化酶活性的影响试管中加入pH7.0的磷酸盐缓冲溶液2.0mL,以邻苯二酚溶液0.5mL为底物,在不同温度（常温、40、60℃的温度条件)下保温5min后，加入多酚氧化酶粗酶液0.5mL，混匀后在室温下测定多酚氧化酶的活性。以温度为横坐标，多酚氧化酶活性为纵坐标，作出酶活—温度曲线，以确定最适温度。表3温度对多酚氧化酶活性的影响 温度 磷酸缓冲液（mL） 邻苯二酚（mL） 粗酶液（mL） OD410 2min后OD410 △OD410 酶活力（U） 室温 2.0 0.5 0.5 40℃ 2.0 0.5 0.5 60℃ 2.0 0.5 0.5 4.3抑制剂对多酚氧化酶活性的影响将抑制剂抗坏血酸（VC）、柠檬酸、亚硫酸钠、EDTA分别用pH7.0的磷酸盐缓冲溶液配制成10mmol/L的溶液，在室温下分别取上述抑制剂2.0mL，以邻苯二酚溶液0.5mL为底物，加入多酚氧化酶粗酶液0.5mL，混匀后在室温下测定多酚氧化酶的活性。以抑制类型为横坐标，多酚氧化酶活性为纵坐标，绘制抑制剂对酶活影响的图形，分析抑制剂对酶活性影响。表4抑制剂对多酚氧化酶活性的影响 抑制剂 磷酸缓冲液（mL） 邻苯二酚（mL） 粗酶液（mL） OD410 2min后OD410 △OD410 酶活力（U） 抗坏血酸 2.0 0.5 0.5 柠檬酸 2.0 0.5 0.5 亚硫酸钠 2.0 0.5 0.5 EDTA 2.0 0.5 0.5 五、注意事项?1、反应混合液必须现配现用，否则会因邻苯二酚自动氧化而失效；2、在试验中加入一种酚结合剂--聚乙烯吡咯烷酮（PVPP），它能与酚类化合物强烈地发生缔合作用，从而消去酶反应体系中的底物，使PPO活性的测定更接近其真值。3、使用分光光度计时要求动作快速、熟练。4、加样时，先加缓冲溶液，再加底物邻苯二酚，摇匀，在测量之前最后加酶提取液。六、思考题1.本试验中使用到磷酸缓冲液，请问磷酸缓冲液在本试验中的作用？2.试分析不同温度、pH对马铃薯多酚氧化酶的影响？3.谈谈你对多酚氧化酶活性性质的认识。参考文献：曹建康，姜微波，赵玉梅编着.果蔬采后生理生化实验指导.中国轻工业出版社,2007.9.毛丽梅，邓红，马安德，卢晓翠。食品安全综合实习指导.科学出版社,2013.02.104-105李彩霞张芬琴张喜峰赵金梅白生文