MCF-7细胞的培养传代

MCF-7细胞的培养传代 1. MCF-7细胞的培养传代 细胞株购自武汉中国典藏物培养中心(美国ATCC株亚型)，培养基是MEM， 10, 的小牛血清(购自杭州四季青公司)。 传代要看细胞数的多少，一般来说10,的细胞，要5天左右，如果90,融合的细胞 一传2，3天子代细胞即可传代。传代:偶用的是25ml培养瓶，吸出培养基，6mlpbs冲洗 3次，加入0.25,的胰酶2,3ml，胰酶均匀盖满瓶壁，消化2,5min左右(可以同时振摇)， 细胞缩起变圆，浮起，加入培养基2,3ml，不用太精确，吹打成单细胞悬液分瓶即可。室 温下消化即可，因为是成纤维细胞，较为耐受胰酶，消化时间稍长亦可，要注意mcf-7细胞 是一种肿瘤细胞，生长规律性差，很容易不均匀，要注意吹打的充分性。 摘自ATCC Organ: mammary gland; breast Cellular products: insulin-like growth factor binding proteins (IGFBP) BP-2; BP-4; BP-5 Complete growth medium: The base medium for this cell line is ATCC-formulated Eagle's Minimum Essential Medium, Catalog No. 30-2003. To make the complete growth medium, add the following components to the base medium: 0.01 mg/ml bovine insulin; fetal bovine serum to a final concentration of 10% . Atmosphere: air, 95%; carbon dioxide (CO2), 5% Temperature: 37.0?C Subculturing: 1. Remove culture medium to a centrifuge tube. 2. Briefly rinse the cell layer with 0.25% (w/v) Trypsin - 0.53 mM EDTA (0.015%, w/v) solution to remove all traces of serum which contains trypsin inhibitor. 3. Add 2.0 to 3.0 ml of Trypsin-EDTA solution to flask and observe cells under an inverted microscope until cell layer is dispersed (usually within 5 to 15 minutes). Note: To avoid clumping do not agitate the cells by hitting or shaking the flask while waiting for the cells to detach. Cells that are difficult to detach may be placed at 37C to facilitate dispersal. 4. Add 6.0 to 8.0 ml of complete growth medium and aspirate cells by gently pipetting. 5. Transfer the cell suspension to the centrifuge tube with the medium and cells from step 1, and centrifuge at approximately 125 x g for 5 to 10 minutes. Discard the supernatant. 6. Resuspend the cell pellet in fresh growth medium. Add appropriate aliquots of the cell suspension to new culture vessels. 7. Incubate cultures at 37C. Subcultivation Ratio: A subcultivation ratio of 1:3 to 1:6 is recommended Medium Renewal: 2 to 3 times per week Freeze medium: Complete growth medium supplemented with 5% (v/v) DMSO Storage temperature: liquid nitrogen vapor phase 注(英文部分摘自ATCC): 1. 0.25% Trypsin-0.53 mM EDTA: 0.25% Trypsin/0.53 mM EDTA in Hanks Balanced Salt Solution without calcium or magnesium. For dissociation of cell monolayers. Trypsin-EDTA solution is suitable for most but not for all adherent cell lines. 2. Fetal Bovine Serum Storage: -70? Degerming Triple filtered through 0.1-um filters. Each lot of fetal bovine serum is tested for sterility and for the ability to support the growth of several different cell lines using both sequential growth curves and plating efficiencies. Fetal bovine serum is manufactured from fetal bovine blood collected in USDA-inspected abattoirs located in the United States. 3. EDTA-胰蛋白酶的配制 1)胰酶是0.25%,这是质量体积比，就是说0.25g胰酶溶于100ml PBS,注意，尽量不要用水 来溶，因为要保持渗透压。 2) EDTA的工作液溶度是0.02%,0.1%，根据细胞消化的难易程度自己调整。EDTA并不 是必须的，容易消化的细胞可不加。EDTA对细胞贴壁性有影响，因此使用时要甚重。如果 影响贴壁，但消化时必须要用，那么在用完全培养基终止消化后，可离心弃上清，再加完全 培养基培养，可去除EDTA。如果对贴壁没影响，那么可不离心。 3)EDTA的浓度也是质量体积比。和胰酶一起溶于PBS。 4)注意，血清可终止胰酶的作用，但不能终止EDTA的作用，对有些细胞来说，终止消化 后的离心是必要的。 5)胰酶和EDTA在pH 为8左右的时候最易溶解，在配制时可先滴几滴NaOH将pH调至 8，注意，胰酶可使溶液变酸，所以要边溶边测pH，随时调整。注意，不可加过量NaOH， 否则过碱，细胞会受不了。胰酶作用及溶解的最佳pH8-9，配制胰酶溶液应将液体调至pH8 左右，充分溶解。EDTA溶液也常用来解离细胞，它的作用是破坏细胞间的连接。对于一些 贴壁特别牢固的细胞，还可用EDTA和胰酶的混合液进行消化。 6)胰酶EDTA相对比较难溶，可用磁力搅拌器，或放入4度冰箱过夜，待溶解后过滤除菌。 7)可配2,3乘的胰酶，这样比较节约时间和滤器，用的时候对上灭菌PBS即可。 8)储存液放在,20度冰箱冻存，使用液放在4度，用的时候不要放在27度水浴锅温浴， 因为这样会让胰酶很快失效，使用前放在室温下一会，因为加的量很少，所以一般不会冻坏 细胞。 9)消化时，向培养瓶中加入适量胰酶，个人经验，一般10cm培养皿加入0.5ml足已，加入 后，立刻摇晃培养皿，使胰酶铺满，一旦铺满，立刻用负压吸引器吸去多余的胰酶，再放入 37度培养箱消化。 10)注意，过量的胰酶对细胞是有害的，而EDTA过多也会影响贴壁，所以没必要把细胞 泡在胰酶里面消化。 11)胰酶37消化效果最好，低于37度也有消化能力，有些容易消化的细胞在消化时甚至不 需要放入培养箱。注意，不可消化过久。 2. MCF-7细胞形态与特征:呈多边形，贴壁生长，繁殖速度快，一般情况下1.5即可满瓶 传代。但人雌激素受体阳性的乳腺癌细胞MCF-7的生长速度则比较缓慢。MCF-7细胞形态 图片如下: 另一网友:MCF-7细胞复苏后，隔日更换新鲜培养液，继续培养两天后10倍镜下观察:该细胞系生长迅速，约3-4天即可由20%的汇合长到80%的汇合程度，因此，培养是要实时观察，及时进行传代或收获细胞。 培养四天20倍镜下的图片: 经验: 1) 必须加入胰岛素的。MCF-7刚复苏时长得很慢很慢，主要看贴壁的细胞是不是已经舒展开来(三角形或多边形)，其次，看贴壁细胞是否开始分裂，形成一个一个的细胞群(MCF-7具上皮细胞的性质)。如果开始增殖，就是好现象。 恢复后，会长得快一点，但和其他的乳腺癌细胞没得比，还是不快，传代时比例不要太大。还有，这个细胞恢复时贴壁比较慢，但贴得很牢，消化时胰酶处理要适合，免得大量的细胞仍在皿上不下来。 1)最好在细胞长到瓶底80%的时候就传代，还有就胰酶消化时间缩短(直接拿EDTA看能不能消化下来)。还有就是血清质量,国产四季清的很好用的， 2)在培养液中出现黑色颗粒,颗粒逐渐增多,，再传一代就不行了.而且细胞贴壁明显不牢,用枪头很容易就可吹下，出现此情况初步判断是污染。建议重新复苏。如果种子也是污染了的，就只好再找新的种子了。 3) 要注意mcf-7细胞是一种肿瘤细胞，生长规律性差，很容易不均匀，要注意吹打的充分性 3. MTT法:四唑盐(MTT)商品名为噻唑蓝， 四唑盐比色法的原理:活细胞中脱氢酶能将四唑盐还原成不溶于水的蓝紫色产物(formazan)，并沉淀在细胞中，而死细胞没有这种功能。二甲亚砜(DMSO)能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物，溶液颜色深浅与所含的formazan量成正比。再用酶标仪测定OD值。 MTT的使用步骤 (一)细胞 1.选择适当的细胞接种浓度。一般情况下，96孔培养板的一内贴壁细胞长满时约有105个细胞。但由于不同细胞贴壁后面积差异很大，因此，在进行MTT试验前，要进行预实验检测其贴壁率、倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线，确定试验中每孔的接种细胞数和培养时间，以保证培养终止致细胞过满。这样，才能保证MTT结晶形成酌量与细胞数呈的线性关系。否则细胞数太多敏感性降低，太少观察不到差异。 2.药物浓度的设定。一定要多看文献，参考别人的结果再定个比较大的范围先初筛。根据自己初筛的结果缩小浓度和时间范围再细筛。切记～否则，可能你用的时间和浓度根本不是药物的有效浓度和时间。 3. 时间点的设定。在不同时间点的测定OD值，输入excel表，最后得到不同时间点的抑制率变化情况，画出变化的曲线，曲线什么时候变得平坦了(到了平台期)那个时间点应该就是最好的时间点(因为这个时候的细胞增殖抑制表现的最明显)。 4.培养时间。200ul的培养液对于10的4,5次方的增殖期细胞来说，很难维持68h，如果营养不够的话，细胞会由增殖期渐渐趋向G0期而趋于静止，影响结果，我们是在48h换液的。 5.MTT法只能测定细胞相对数和相对活力，不能测定细胞绝对数。做MTT时，尽量无菌操作，因为细菌也可以导致MTT比色OD值的升高。 6.理论未必都是对的。要根据自己的实际情况调整。 7.实验时应设置调零孔，对照孔，加药孔。调零孔加培养基、MTT、二甲基亚砜。对照孔和加药孔都要加细胞、培养液、MTT、二甲基亚砜，不同的是对照孔加溶解药物的介质，而加药组加入不同浓度的药物。 8.避免血清干扰。用含15,胎牛血清培养液培养细胞时，高的血清物质会影响试验孔的光吸收值。由于试验本底增加，会试验敏感性。因此，一般选小于10,胎牛血清的培养液进行。在呈色后，尽量吸净培养孔内残余培养液。 (二)实验步骤 贴壁细胞: 1.收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100ul,铺板使待测细胞调密度至1000-10000孔，(边缘孔用无菌PBS填充)。 2.5%CO2，37?孵育，至细胞单层铺满孔底(96孔平底板),加入浓度梯度的药物,原则上，细胞贴壁后即可加药，或两小时，或半天时间，但我们常在前一天下午铺板，次日上午加药.一般5-7个梯度,每孔100ul,设3-5个复孔.建议设5个，否则难以反应真实情况 3.5%CO2，37?孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。 4.每孔加入20ulMTT溶液(5mg/ml，即0.5%MTT)，继续培养4h。若药物与MTT能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再加入含MTT的培养液。 5.终止培养，小心吸去孔内培养液。 6.每孔加入150ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。 7.同时设置调零孔(培养基、MTT、二甲基亚砜)，对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜) 悬浮细胞: 1.收集对数期细胞，调节细胞悬液浓度1×106/ml，按次序将?补足的1640(无血清)培养基40ul ;?加Actinomycin D(有毒性)10ul用培养液稀释 l?g/ml，需预试寻找最佳稀释度，1:10-1:20);?需检测物10ul;?细胞悬液50ul(即5×104cell/孔)，共100ul加入到96孔板(边缘孔用无菌水填充)。每板设对照(加100?(储存液100 1640)。 2.置37?，5%CO2孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。 3.每孔加入10 ul MTT溶液(5 mg/ml，即0.5%MTT)，继续培养4 h。(悬浮细胞推荐使用WST-1，培养4 h后可跳过步骤4)，直接酶联免疫检测仪OD570nm(630nm校准)测量各孔的吸光值) 4.离心(1000转x10min)，小心吸掉上清，每孔加入100 ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD570nm(630nm校准)测量各孔的吸光值。 5.同时设置调零孔(培养基、MTT、二甲基亚砜)，对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜)，每组设定3复孔。 注意事项: (1)选择适当得细胞接种浓度。 (2)避免血清干扰:一般选小于10,的胎牛血清的培养液进行试验。在呈色后尽量吸尽孔内残余培养液。 (3)设空白对照:与试验平行不加细胞只加培养液的空白对照。其他试验步骤保持一致，最后比色以空白调零。 MTT实验吸光度最后要在0-0.7之间，超出这个范围就不是直线关系， IC50是半抑制率，意思是抑制率50,的时候药物的浓度。把药品稀释成不同的浓度，然后计算各自的抑制率，以药品的浓度为横坐标，抑制率为纵坐标作图，然后得到50,抑制率时候的药品浓度，就是IC50。要点:药品2倍稀释，多做梯度，做点线图即可～ 举个例子:各组浓度0.1、0.01、0.001、0.0001、0.00001、0.000001，稀释倍数为10，最大浓度为0.1，抑制率为0.95、 0.80、0.65、0.43、0.21，0.06。代入 计算公式: Pm=0.95 Pn=0.06 P=0.95 0.80 0.65 0.43 0.21 0.06=3.1 Xm=lg0.1=-1 lgI=lg0.1/0.01=1 lgIC50=-1-1*(3.1-(3-0.95-0.06)/4)=-3.6025 IC50=0.00025 有一个公式可供参考; lgIC50=Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4) Xm:lg 最大剂量 I:lg(最大剂量/相临剂量) P:阳性反应率之和 Pm:最大阳性反应率 Pn:最小阳性反应率 抑制率=1-加药组OD值/对照组OD值 公式中的最大最小阳性反应率就是最大最小抑制率 4. PBS和Hanks PBS可以为三种溶液的英文缩写，分别是 1.磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffered solution)、 2.磷酸盐缓冲盐水(phosphate buffered saline)及 3.磷酸盐缓冲钠(phosphate buffered sodium)， 其配制方法不同，pH值不同，发挥的生物学作用亦不完全相同。 如无特殊说明，生物学上常用的PBS是中性磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffered solution)。 Hanks液是常见的平衡盐溶液(BSS)之一。D-Hanks液则是无钙镁离子的Hanks液。BSS与细胞生长状态下的pH值、渗透压及无菌状态一致，且配方简单，是组织培养基本用液，常用于配制培养基及其他用液，或洗细胞等，细胞在BSS中可生存几个小时。 胰蛋白酶(胰酸)溶液是一种常用的细胞消化液，原代培养时用于处理组织块，使细胞分离下来。传代时用胰蛋白酶使培养细胞离开所贴附的培养瓶表面，并分散成单个细胞。胰蛋白酶主要采自牛或猪的胰脏，呈白色粉末状，易潮解，应在低温干燥处保存。胰酶在pH 8.0、37?时消化能力最强。溶液中的Ca2+、Mg2+和血清会降低胰酶活力，所以配制胰酶时须用无Ca2+、Mg2+的D-Hanks液。当消化结束时，可加入少量血清或含血清的培养基以终止胰酶作用。 细胞传代使用的胰酶浓度是0(25,或0(2,。用于原代细胞培养消化组织块则为0(1,或0(125,。 细胞培养具体操作 1. 进入细胞房前必须穿上已消毒的实验服，换拖鞋，并将实验服袖口向内卷起， 将其它衣服袖口包于其内。 2. 进入细胞房，戴上丁腈手套，开紫外灯半小时。半小时后，用酒精棉将工作 台擦拭一遍，并喷洒酒精，对工作台及其内物品内进行消毒;点燃酒精灯。 3. 依次放入装培养液的试剂瓶，培养瓶，小牛血清瓶，胰酶离心管，DMSO瓶，双抗瓶，PBS瓶，50ml烧杯两个，100-1000ul移液器，一次性滴管若干，空离心管两个(15ml)。 注意:1)所有放入超净工作台或细胞培养箱内的物品，如手套，记号笔，离心管，试剂瓶，滴管，冻存管，培养瓶，试管架，枪头盒，移液器，烧杯，96孔板等需先75%酒精消毒后，方可放入工作台或培养箱内。 2)所有放入工作台内的试剂瓶或离心管均需过火三次:打开瓶盖前，打开后，取液毕关上瓶盖前均需在酒精灯火焰上过一下火。 3)任何取液过程均不能让一次性滴管触及瓶口，试剂瓶或离心管开盖后，瓶盖 应侧放。 4. 细胞复苏:取出细胞冻存管，立即放入到40?的温水浴中，使其2-3分钟内复苏。此即快复苏。 5. 细胞培养:用1ml移液器移6ml已事先配好的培养液(组成:培养基+小牛血清+双抗，90:10:1)入培养瓶;用移液器吸出已经复苏的细胞，加入到培养瓶中，吹打;然后将培养瓶放入到细胞培养箱中，进行培养。1.5天后换液或分瓶。换液操作见下述8。分瓶操作见下述7。 6. 细胞冻存:用滴管吸去培养液，加入PBS，吹打;滴管吸去PBS, 加入胰酶0.3-0.4ml，消化3分钟;加入纯的培养基(组成:DMEM培养基。注意:此处与上述5不同)，吹打;在1000rpm下离心5分钟;小心倾倒出上清，保留细胞;加入DMEM 700ul， 小牛血清200ul， DMSO 100ul(注意:此处与上述5不同)，吹打。将上混合液用移液器移入冻存管。冻存细胞宜慢降温:冻存管应先置于冰箱上层30分钟，再移入下层30分钟，然后移至-78?低温冰箱过夜，最后移至液氮中保存。此即慢冻存。 7. 分瓶操作:当细胞由20%长满至80%的培养瓶瓶底时，需进行分瓶操作。用滴管吸去培养液，加入PBS清洗;滴管吸去PBS，吹打, 加入胰酶0.3-0.4ml，消化3分钟;加入6ml已事先配好的培养液(组成:培养基+小牛血清+双抗，90:10:1)，吹打;移液器取出3ml如另一个培养瓶;对两培养瓶，分别再加入3ml培养液(组成:培养基+小牛血清+双抗，90:10:1)，吹打;喷洒酒精后放入培养箱内。 8. 换液操作:如果细胞并未铺满至80%，但是培养液已发黄，此时应进行换液。用移液器吸去发黄的培养液，直接加入新鲜的培养液(组成:培养基+小牛血清 +双抗，90:10:1)。 9. 计数操作:用滴管吸去培养液，加入PBS清洗;滴管吸去PBS，吹打, 加入胰酶0.3-0.4ml，消化3分钟;加入6ml已事先配好的培养液(组成:培养基+小牛血清+双抗，90:10:1)，吹打;吸取一定量，滴加到血球计数板上，在显微镜下观察，通过16个方格中细胞数目得出每毫升中含有的细胞数，从而得出大致的稀释倍数;加入若干体积已事先配好的培养液(组成:培养基+小牛血清+双抗，90:10:1)，进行稀释，吹打;用酒精棉擦净血球计数板;再次滴加培养 5液于计数板上，在显微镜下观察。重复上操作，直至计数为5×10个/ml，即16个方格(相当于0.01ul)中含5个细胞时，方可进行铺板操作。 10. 铺板操作:在96孔板上，每孔加入90ul含细胞的培养液;喷洒酒精;放置于细胞培养箱中培养12-24小时。取出96孔板，加入6个浓度梯度(具体浓度需摸索)的含药溶液，每孔10ul;每个浓度复孔，即每个浓度加入到相邻的两个孔中。也就是说:每个药物占据一排孔，每个96孔板可加8个药物。 附: 一些浓度要求: MTT: 5mg/ml的PBS溶液，并用锡纸包裹，4?下避光保存。用前必须过0.22µm的滤膜。 培养液:培养基+血清+双抗， 90:10:1。 冻存管:培养基+血清+DMSO， 700u:200u:100u