松科10属植物叶子内皮层具有凯氏带的新证据

松科10属植物叶子内皮层具有凯氏带的新证据 松科10属植物叶子内皮层具有凯氏带的新 证据 第23卷第5期 2004年l0月 电子显微 JournalofChineseElectronMicroscopySociety Vo1.23.No.5 2OO4.10 文章编号:1000.6281(2004)05-560—06 松科1O属植物叶子内皮层具有凯氏带的新证据 唐熙一,吴小琴,吕洪飞,林金星卜 (1中国科学院植物研究所,北京100093;2福建教育学院,福建福州350001) 摘要:本文应用荧光显微技术,结合检测凯氏带的特异染料小檗碱和甲苯胺蓝对染方法,对松科l0属l3种植物 叶子的冰冻切片进行了观察,确认在松科的l0属植物叶子中均有内皮层凯氏带加厚,纠正了前人关于在松科植物 某些属的叶子中不存在凯氏带的结论.根据内皮层细胞排列模式和凯氏带加厚程度,我们将松科的l0属分成两 大类.通过酶解分离我们得到典型的凯氏带网状结构,说明其能够抵御酶解,其原因可能是成份含木质素和木栓 质. 关键词:松科;叶子;内皮层;凯氏带;荧光显微镜;酶解技术 中图分类号i949.665;Q945;Q336文献标识码iA 内皮层是指包围在根部维管束和与之相连的薄 壁细胞外面的一层鞘细胞.在其细胞的径向壁和横 向壁上,通常具有木质化和栓质化的带状结构—— 凯氏带加厚.土壤水分进入根部通常有三种途径, 即离质体途径,共质体途径和跨细胞途径,凯氏带被 认为是水分从根部皮细胞进入中柱的重要障 碍….根部内皮层具有凯氏带是维管植物的重要特 征,而其他器官中是否具有凯氏带一直存在着争论. 特别是对于裸子植物叶子内皮层是否具有凯氏带更 是存在不同的看法,至于这个特征能否作为松科 的分类特征则缺乏系统的研究.由于凯氏带与内皮 层细胞质膜紧密相连,因而分离凯氏带十分困难.致 使凯氏带的研究进展缓慢.近年来,Brundrett等】 采用小檗碱和甲苯胺蓝染色技术,在根部内皮层凯 氏带的标记上获得了理想的结果;Karahara和 Shibaoka用纤维素酶和果胶酶的酶解方法.成功地 分离得到了根部凯氏带的网状结构?,这些技术的 改进为凯氏带的研究奠定了基础.本文应用荧光显 微技术,结合小檗碱和甲苯胺蓝对染技术系统地对 旨在 松科10属13种植物的叶子进行了比较观察,研究松科各属叶中是否都有凯氏带,并进一步说明 这个特征的生理学意义. 1材料与方法 1.1材料 按照《中国植物志》第七卷的分类系统],本文 共采集观察松科植物10属13种,其中4种采自北 京中国科学院植物研究所植物园内,并用FAA固定 保存;其余9种取自中国科学院植物研究所生殖室 已经固定的材料(见表1). 1.2方法 1.2.1组织切片及荧光显微镜 取每种松科植物的三片叶子用蒸馏水洗净后, 从叶子中部切取20—30mm的长度,置于冰冻切片 机中一30?快速冷冻后进行冷冻切片,厚度为20— 25ttm,在解剖镜下挑选透明,均匀,完整的切片,置 于染料小檗碱.甲苯胺蓝中进行双重染色,最后在 紫外光激发波长为365nm的荧光显微镜(Axioskop 40型)下观察并照相. 1.2.2酶解纯化细胞壁 取2—3年生的供试植物叶子洗净.切成0.5cm 左右的小段,水煮数分钟后,用刀片将针叶表皮及表 面角质层刮除干净,再放人含5%果胶酶和5%纤维 素酶的0.01mol/L柠檬酸缓冲液中,调节pH至3.0. 置室温下酶解,每隔3—5天更换酶液一次;2周 后在解剖镜下将具网状结构的凯氏带与维管组织以 及外部的其它组织分离,再经去离子水清洗数遍.在 去离子水中保存备用.观察时.用染料小檗碱.甲苯 胺蓝进行双重染色,在紫外激发的荧光显微镜下观 察并照相. 2实验结果 2.1松科植物叶子的一般结构 松科植物的叶子均为单脉序,主要有针形叶和 收稿日期i2004.02.02;修订日期i2004.04.10 基金项目i中国科学院创新重点项目基金资助项目(批准号:KSCXZ—SW.108) 作者简介:唐熙(1962一),女(汉族),福建人,副教授. *通讯作者:林金星(1961一),男(汉族),福建人,研究员. 第5期唐熙等:松科10属植物叶子内皮层具有凯氏带的新证据561 背腹扁平的线形或披针形叶两种形状,可分为上,下 表皮,皮下层,叶肉,维管组织和树脂道各部分.多 数属表皮细胞壁较厚,具角质层.气孔两面生或下 面生.在大多数属中,叶肉细胞无栅栏组织和海绵 组织的分化,其细胞壁均向内皱褶,在横切面上呈 "u","w"字形和梅花形等.部分属在维管束与叶肉 之间具有排列紧密,细胞大小相似的内皮层细胞,另 一 些属的内皮层细胞形状和大小差异比较大,排列 不规则.在内皮层细胞的径向壁和横向壁上具有增 厚的凯氏带.维管束1条,单束或双束.多数属中 树脂道2,4个,在松属的双维管亚属中可多达12 个,在铁杉属中则只有1个树脂道,树脂道多为边生 或中生或同时兼有,极个别内生. 2.2松树叶子内皮层的基本结构 内皮层细胞沿中柱成环状排列,在黄杉属(图 3),银杉属(图6),云杉属(图7),雪松属(图10),松 属(图l1)中,内皮层细胞大小相似,排列紧密,而在 油杉属(图1),冷杉属(图2),铁杉属(图4和5),落 内皮层细 叶松属(图8),金钱松属(图9)的叶子中, 胞形状和大小差异比较大,排列不规则. 在紫外光激发波长为365nm的荧光显微镜下, 内皮层细胞的径向壁可见明显荧光,在横向壁上偶 见微弱荧光.在所观察的10属13种松科植物叶子 中,在它们的内皮层细胞上均可见到带状的荧光,表 明这些种类的内皮层细胞具有凯氏带加厚. 2.3酶解分离后凯氏带的结构 为了确定内皮层带状加厚的化学特性,我们应 用酶解技术对上述10属13种松科植物进行了酶解 分离.图12,图14表示经过酶解分离得到的网状 结构.从金钱松(图12)可以看出"网格"的形状和 大小不尽相同,而北美黄松(图13)和白扦(图14)看 到"网格"的形状和大小基本相同.从图l3,l4还可 以看到,"网格"上的纵向壁(内皮层的径向壁)上具 有初生纹孔场,而在"网格"的横向壁上则几乎没有 类似的结构. 3讨论 关于裸子植物叶子内皮层中是否具有凯氏带, 曾经有不同的结论.一些学者在针叶树叶子解剖分 析时,没有观察到凯氏带的存在.Napp—Zinn在 他的专着中列举了50余篇文献,其中只有3篇提到 凯氏带.姚璧君和胡玉熹认为,在松科的10属 中黄杉属,银杉属,云杉属,落叶松属,雪松属和松属 的6属具有凯氏带,而其余的油杉属,冷杉属,铁杉 属和金钱松属4属没有凯氏带.WuXiaoqin利用 荧光显微镜和小檗碱一甲苯胺蓝对染技术,确认在白 皮松叶子内皮层径向壁中有明亮的绿色荧光,利用 纤维素酶和果胶酶酶解后可以得到网状结构,经过 fvrIR分析证明其化学成分主要包括木质素,木栓质 和少量的纤维素,细胞壁蛋白等,在国际上首次证明 内皮层的加厚与根部的凯氏带在结构,化学成分等 方面基本相似u. 表1供观察植物的名称,采集地点及其凯氏带类型 Table1AlistofplantspeciesobservedandtheirlocalitytogetherwiththetypesofCasparianstr ips 属名种名内皮层凯氏带类产地 Keteleeria(油杉属)K.caleareaChengetLK.Fu黄枝油杉『】五南昆明 Abies(冷杉属)A.holophyUaMaxim辽东冷杉l1北京植物园 Pseudotsuga(黄杉属)P.gausseniiFlous华东黄杉l安徽黄山 T.1ongibracteataCheng长苞铁杉l1福建连城 Tsuga(铁杉属) r.ch#wnsisvat".tchekiangensis(Flous)ChengetI.K.Fu南方铁杉I1安徽黄IJJ Catha)n(银杉属)C.arg)TophyUaChunetKuang银杉上广西仡坪 Plikiangensis(Franch)Pritz.丽江云杉l云南昆叫 Picea(云杉属) P.me)eriRehdetWils.白扦l北京植物同 Lari(落叶松属)L.speriosaChengetLaw怒江红杉I1云南昆叫 Pseudolarix(金钱松属)P.amabilis(Nelson)Rehd.金钱松l1安徽黄11I Cedrus(雪松属)C.deodara(Roxb)G.Don雪松上北京植物同 PmassonianaLamb.马尾松l福建福州 Pinus(松属) P.por~erosaDough.北美黄松l北京植物同 562电子显微J.Chin.Electr.Microsc.Soc第23卷 本实验对松科10属进行了较为系统的分析,根 据荧光显微检测结果我们认为这10属植物叶子内 皮层均具有典型的凯氏带加厚.我们推测,早期的 学者没有观察到凯氏带加厚的原因可能是由于没有 采用特异的染色方法或观察手段不恰当,而近期的 学者也没有观察到的原因可能是选用叶子材料的年 龄不够理想,我们认为理想的观察材料应该选用2 , 3年生的叶子,最好不要选用尚未进入木质化的 嫩叶作为观察材料. 我们注意到,在所观察的松科10属植物中凯氏 带的加厚现象与内皮层细胞的排列模式紧密相关. 如果内皮层细胞排列紧密,凯氏带加厚明显,在荧光 显微镜下也就容易观察到.相反,如果内皮层细胞 排列不规则或内皮层细胞大小不一,则凯氏带加厚 现象不明显,也容易被忽视.根据内皮层细胞的排 列模式和凯氏带加厚的程度,我们可以将松科的10 属分成两大类:l类为内皮层细胞排列紧密,凯氏带 加厚现象明显,包括黄杉属,银杉属,云杉属,雪松 属,松属;II类为内皮层细胞排列不规则,凯氏带加 厚现象不明显,包括油杉属,冷杉属,铁杉属,落叶松 属,金钱松属.至于内皮层凯氏带加厚能否作为松 科系统分类特征仍有待于观察更多的种类,再做进 一 步的论证. 细胞壁主要由纤维素,半纤维素,木质素,木栓 质,果胶质和细胞壁蛋白等组成,经过纤维素酶和果 胶酶酶解以后,细胞壁的基本骨架已经分解,残余部 分则基本上是木质素和木栓质.本实验着重对金 钱松,北美黄松和白扦植物的叶子进行了酶解分离, 获得了与大多数植物根部内皮层凯氏带相似的典型 网状结构,表明这一网状结构能抵御上述酶解,主要 成分可能是木质素和木栓质. 凯氏带是根部的重要特征,它位于皮层和中柱 中间,被普遍认为是根系吸收养分的"过滤网"_2j. 过去的研究结果表明,从表皮到皮层,土壤的养分可 以以质外体途径进入到内皮层.同样,一旦养分进 入到中柱以后,也可以随蒸腾流进入导管,以质外体 途径被运送到各个部位.只有内皮层的凯氏带四面 加厚,且加厚部分由于栓质化和木质化,对养分的跨 皮层运输具有调控作用.本实验通过荧光检测和酶 解分离,证实了在所观察的松科l0属13种植物叶 片内皮层均具有凯氏带.根据凯氏带在根部的作 用,我们可以推测,松科植物叶片的内皮层凯氏带对 养分的分泌与释放同样具有调控作用.现在我们正 在进行根部内皮层凯氏带与叶子内皮层凯氏带的化 学成分分析和水分渗透实验,结果将另文报道. 致谢:本论文是第一作者在中国科学院植物研究所 进修期间完成的工作.在本实验进行过程中,得到 了胡玉熹研究员和母锡金研究员以及实验室其他成 员的指导和帮助,在此一并致谢. 参考文献: SchreiberL.ChemicalcompositionofCaspafianstrips isolatedfromCliviaminiataroots:evidenceforlignin[J]. 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O一?一 CS 0OXl目 XI 圆—— 黧一一一一一 第5期唐熙等:松科l0属植物叶子内皮层具有凯氏带的新证据565 OccurrenceofCasparianstripsintheleaf endodermisof10generaofpinaceae TANGXi一,WUXiao—qin,LuHong—fei,LINJin.xing (1InstituteofBotany,ChineseAcademyofSciences,Bering100093; 2FujianInstituteofEducation,FuzhouFujian350001,China) Abstract:Crosssectionsofleavesfrom13speciesbelongingto10generaofPinaceaewerepreparedbycryo-microtomeandcounter—stainedby berberine/anilineblue,thenwereobservedunderthefluorescencemicroscope.Itwasdeterminedthattheendodermisofallgenerapossessed Casparianthickening,incontrasttosomeoftheearlierconclusionsthatCasparianstripsdidnotoccurintheendodermisofseveralgenera.In termsofarrangementpatternsofendodermalcellsandthickeningmodeofCasparianstrips,twotypescouldbeidentifiedamongtheleavesof tengenera.Inaddition,typicalnet— likestructuresofCasparianstripswereisolatedfromtheleavesafterincubatingwithenzymes,indicating thattheycouldstandenzymedegradationandweremainlycomposedofligninandsuberin. Keywords:pinaceae;leaf;endodermis;Casparianstrips;fluorescencemicroscope;enzyma ticisolation