三极细胞有丝分裂中期纺锤体的激光共聚焦显微镜观察

三极细胞有丝分裂中期纺锤体的激光共聚焦显微镜观察 () 文章编号: 1001- 4616 199903- 0081- 04 三极细胞有丝分裂中期纺锤体的 Ξ 激光共聚焦显微镜观察 ????????陈彦, 李朝军, 毕春明, 戴谷, 沈维干, 张锡然 () 处理培养的 细胞, 抑制胞质分裂, 引起 细胞发生 用松胞素 , 摘要 B C y to ch a la sin B CB H e la H e la ( )不正常分裂, 可形成多极细胞 三极、四极等. 通过荧光免疫染色法显示多极细胞有丝分裂中期的 微管, 使用激光共聚焦显微系统观察三极细胞纺锤体和中期染色体的空间相对关系, 推测了纺锤 体微管的分布与有丝分裂后期染色体分离的相关性. 本还可用于研究有丝分裂期纺锤体微管 对胞质分裂分裂沟形成的影响. 关键词 有丝分裂, 纺锤体, 微管, 细胞, 激光共聚焦显微镜H e la 中图分类号 - 336Q 0 引言 1, 2 胞质分裂是细胞分裂的最后阶段, 受到严格的调控. 胞质分裂发生时, 环绕细胞赤道面 的质膜下方形成收缩环, 收缩环缢缩形成分裂沟, 分裂沟继续加深使细胞一分为二形成两子细 胞. 但分裂沟形成部位的决定因素仍不清楚. 3, 4 有证据表明, 分裂沟是由纺锤体两极发出的信号决定的, 但此信号的本质是什么、又是 如何决定分裂沟形成的有待进一步的研究. 有丝分裂细胞中存在一个纺锤体, 由两极发出的信 号决定分裂沟在纺锤体两极之间赤道板部位形成. 和 用微管抑制剂 W h ea t ly W an g co lcem id5 获得多极细胞, 我们利用具有解聚微丝作用的 抑制细胞的胞质分裂, 形成多核细胞. 多 , CB 核细胞恢复胞质分裂后, 可形成含多个纺锤体极的多极细胞. 对这些多极细胞的分析, 可研究 分裂沟的起始位置和发生时间, 及此过程中的信号调节. 1 与方法 111 材料 实验所用材料为 细胞诱导的多极细胞.H e la ()实验所用主要药品: 鼠单克隆抗 - 管蛋白抗体购自于 连 - , . ΒSe ra L ab Su ssex E n g lan d (接 有 德 克 萨 斯 红 的 羊 抗 鼠 二 抗 购 自 于 - . , ,C a lb io ch em N o vab io ch em Co rpL a Jo llaCA )( U SA . CB 购 自 于 S igm a 公 司. DA P I 购 自 于 Bo eh r in ge r M an n h e im 公 司 M an n h e im , Ge r2 Ξ 收稿日期: 1998- 04- 26. 作者单位: ?南京师范大学生命科学学院, 210097, 南京; ?徐州医学院生物教研室, 221002, 徐州; ?扬州大学扬州医 学院, 225001, 扬州. ). m an y 实验使用仪器为配置在 型显微镜的型激光共聚焦 100 - 1024 Ze iss A x io ve r t SM R C E S ()系统 - .B io R ad 112 方法 11211 细胞培养 细胞培养于含有 100 青链霉素、10% 小牛血清的中, 于 37 ?、5% 条件 ƒU mL M EM CO 2 下培养. 处理时, 将 细胞低密度单层培养于 35 培养皿中, 培养液中加入不同浓度 CB H e la mm 的 后, 弃除含药物培养液, 用 轻洗细胞 3 次, 换正常培养液, 继续培养细. 24 CBh PB S M EM 胞若干小时, 于不同时间进行微管荧光染色. 11212 微管的免疫荧光染色和染色体的荧光染色 微管的免疫荧光染色的具体方法如下: 培养于盖玻片上的细胞经漂洗后, 用含 015% T r i2 ( 100 to nX - 的 ƒƒƒ15 500 , 30 , 10 , 0PH EM P mm o lL P ip emm o lL H ep e smm o lL E GTA ) ƒ, 4% 处 理 细 胞 90 , 漂 洗 后, 在 含 317% 多 聚 甲 醛 和 011% 戊 二 醛 的 mm o lL M gC l2 P E G s ( ) () 含 1%固定液中固定 30 , 充分漂洗后与 1?100 浓度 体积比的一 PH EM D DM SO m in PB S 抗 37 ?下反应 4 . 充分漂洗后, 用含 1%的 处理细胞 40 , 降低非特异染色, 再 hB SA PB S m in (() )与二抗 1?100反应 3 , 漂洗后封片 ?= 9?1.h V 甘油 V 水 细胞在二抗之后的漂洗过程中, 用 1 ΛgƒmL DA P I 处理 10 m in , 进行染色体染色. 11213 激光共聚焦显微镜观察 使用配置在 显微镜上的 激光扫描显微镜, 以 2- - 1024 Ze iss A x io skop B io R ad M R C K e 激光发生器和 激光发生器观察三极细胞有丝分裂中期纺锤体微管和染色体. A r U V T ex a s 标记的微管用 568 激光激发, 620 观察发射光. 标记的染色体用 359 激 R ed nm nm DA P I nm 光激发, 461 观察发射光. 图像经 软件处理, 形成两种荧光叠加效果表现在同nm L a se r sh a rp 一图片上, 以观察中期纺锤体微管与染色体分布的关系. 2 结果与讨论 211 三极细胞的诱导 和用培养的 上皮细胞作实验材料, 此类细胞在分裂时具良好的伸展 W h ea t ly W an g N R K 性, 因而用 处理, 可获得较高的三极细胞发生率, 我们用 处理 细胞, 发 co lcem id co ldem id H e la 现 细胞只停留在中期, 不进入下一次有丝分裂, 因而无法获得多极细胞, 这可能与 H e la H e la 5 细 胞 在 分 裂 期 呈 圆 球 形 与 细 胞 形 态 不 同 有 关. 细 胞 自 发 形 成 三 极 细 胞 率 是N R K H e la ()0116% 21232. 用 处理后三极细胞发生率增加, 但发生率与 浓度及药物释放后培养 ƒCB CB 时间有关. 图 1 所示用不同浓度 诱导三极细胞, 药物释放后培养 24 的三极细胞发生率. 4 ƒCB h Λg 组诱导率 2. 14% 明显高于其它浓度组. 1 、2 组浓度偏低, 抑制胞质分裂作ƒƒmL ΛgmL ΛgmL ( )用不强, 多核细胞的形成较少, 发生率为 0128% 、0143% , 略高于正常组 0116% . 6 ΛgmL 、8 ƒ ƒ组对细胞毒害过深, 使细胞处于非正常生理状态, 药物释放后, 细胞恢复胞质分裂能力ΛgmL 图 2 示 4 ƒ诱导三极细胞, 药物释放后培养不同时间的三极细胞发生率. 以培养ΛgmL CB 36 的诱导率为最高, 达 4. 84%. 释放 后培养时间低于 36 , 细胞处于从 抑制中逐渐 h CB h CB 恢复状态, 因而随释放后培养时间逐渐接近 36 , 多极细胞发生率逐渐增加. 若从 释放后 h CB 培养时间多于 36 , 因胞质分裂受阻而形成的多极细胞在恢复胞质分裂能力后已经经过一个h 多周期的分裂, 多核细胞量在减少, 多极细胞率因而也在降低. 图 1 用不同浓度 C y to B 诱导三极细胞, 图 2 4 m gƒmL 药物处理释放后培养不同 药物释放后培养 24 的三极细胞率 h 时间三级细胞诱导率 212 三极细胞有丝分裂中期纺锤体微管的观察 运用激光共聚焦系统可去除非聚焦平面的荧光干扰, 专一地对聚焦平面的荧光进行观察, 因而可得到清晰的图像. 另外通过 软件功能, 可对得到的图像进行后期处理, 研 L a se r Sh a rp 究其空间分布的关系. 图 3 三极细胞有丝分裂中期纺锤体和染色体相对空间关系的激光共聚焦显微镜观察 分别表示三极有丝分裂细胞的三个纺锤体极. 图 3示胞质分裂正常的三极 , , ab c A 细胞, 染色体呈 形状; 图 3示胞质分裂不正常的三极细胞, 染色体呈浅 形状Y B V 图 3 为两种不同有丝分裂中期三极 细胞的纺锤体和染色体的空间分布关系. 图 3H e la A 为中期染色体呈“”型排列的三极细胞, 三个纺锤体极微管丰富. 此三极细胞可能会等分为三Y 5 个子细胞. 图 3为中期染色体呈浅“”型排列的三极 细胞, 三个纺锤体极微管含量不 B V H e la 等, 极微管含量明显少于 极和 极. 而三个纺锤体极间染色体分布量也不同: , 间无染 b a c bc 色体分布, , 间有少量染色体分布, , 间有大量的染色体分布. 此三极细胞可能会不等分 ab ac 为 3 个子细胞, 两大一小; 或者也可能只分裂为 2 个子细胞, 极得到的染色体可能在其中一b 个细胞内形成微核. 在形成不同分裂类型的过程中, 由于纺锤体的不同造成分裂沟形成的差异, 因而, 利用不 同类型的三极中期细胞, 根据细胞胞质分裂时分裂沟形成的特性, 可以很方便地研究有丝分裂 5 分裂沟形成的调节. 进一步的研究将在以后报道. 参考文献 () 1 , . . , 1992 4: 43, 52 Sa t te rw h ite L L Po lla rd T DC y to k ine sisC u r r O p in C e ll B io l () 2 ,. . , 1995 7: 23, 31F ish k ind D J W ang Y LN ew ho r izo n s fo r cy to k in sisC u r r O p in C e ll B io l () 3 . . , 1986 101: 175, 213M abuch i IB io ch em ica l a sp ec t s o f cy to k ine sisIn t R ev C y to l () . . , 1961 148: 814 R app apo r t RE xp e r im en t s co nce rn ing th e c leavage st im u lu s in sand do lla r egg sJ E xp Zoo l , 89 ,. 5 W h ea t ley P W ang Y LM idzo ne m ic ro tubu le bund lle s a re co n t inuo u sly requ ired fo r cy to k ine sis in () . , 1996 135: 981, 989 cu ltu red ep ith e lia l ce llsJ C e ll B io l The O bserva t ion of M e ta pha se Sp in d le s of Tr ipo la r M ito s is Ce lls by a L a ser Scann in g Con f oca l M icro scope ?? ? ? ? , , , ,C he n Ya n L i C ha o jun B i C hunm ing D a i G u ??, ?S he n W e ig a n Zha ng X ira n A bstrac t T h e cu ltu red H e la ce lls w ill becom e m u lt ipo la r m ito t ic ce lls becau se cy to k ine sis is b lo ck ed and ab2 . , no rm a l ce ll d iv isio n w h en t rea ted w ith C y to ch a la sin BIn th is studyw e u sed imm uno f luo re scence sta in ing . m e tho d to show th e m ic ro tubu le a r ray o f m u lt ipo la r m ito t ic m e tap h a se ce llT h e sp a t ia l d ist r ibu t io n re la t io n2 sh ip be tw een sp ind le m ic ro tubu le s and th e sep a ra t ing anap h a se ch rom o som e s w a s exam ined u sing la se r co nfo 2 . ca l m ic ro scop y m e tho dT h e re su lt s m igh t sugge st th a t th e m ito t ic sp ind le m ic ro tub le s co u ld affec t th e p ro 2 .ce ss o f cy to k ine sis , , , Keywords m ito t icsp ind le m ic ro tubu leH e la ce llsla se r scann ing co nfo ca l m ic ro scop e 1999- 04- 26. Rece ived da te ??, 210097, , ; A uthor’ s addre ss L ife Schoo l o f N an jing N o rm a l U n ive r sityN an jingPR CB io lo g ica l D ep a r t2 ?, 221002, , ; , 225001, m en t o f X uzho u M ed ica l Co llegeX uzho uPR CM ed ic ine Schoo l o f Yangzho u U n ive r sity , .Yangzho uPR C