间接免疫荧光——甲醇固定法

间接免疫荧光——甲醇固定法 1、弃培养基,用PBS洗盖玻片。(一定要洗干净将死细胞除尽,否则影响观察采图) 2、把盖玻片投入到-20度预冷的100%甲醇中,-20度冰箱10min(可以盛在用过的六孔板 或60mm的皿里,非常好用,建议用六孔板,空深不会溅出液体/面积小省试剂) 3、用PBST(含0.1%Tween20)洗固定的盖玻片,5-10min/次*3次(Tween20起到透化的 作用,以利于抗体进入细胞内与抗原结合) 4、然后用10%NGS或BSA(PBST配置)温育10-30min。(此步后,玻片可暂存于4度的 70%乙醇中,一星期后仍可获得理想的结果。封闭血清推荐用与二抗同种来源的血清,不可用与一抗同源的血清,以避免抗体交叉反应) 5、弃blocking buffer,室温加一抗(用1%BSA的封闭液稀释)温育1h或37度温育30min; 6、用含PBST室温洗,5-10min/次*3次; 7、二抗(用1%的封闭液稀释)室温温育至少30min;注意避光; 8、用PBST室温洗,10min/次*3次 9、DAPI复染,50uL室温静置5min 10、细胞面朝下放在一滴10uL anti-fade的载玻片上,用指甲油或Gelvetol(封片剂) 等封片,显微观察。 Reference: 《分子克隆实验指南系列:细胞实验指南》科学出版社2001.2月第一版p1006-1007