【word】 HPLC—ELSD法测定肉苁蓉药材中半乳糖醇含量

【word】 HPLC—ELSD法测定肉苁蓉药材中半乳糖醇含量 HPLC—ELSD法测定肉苁蓉药材中半乳糖 醇含量 一 10o4一药物杂志ChinJPharmAnal2007,27(7) HPLC—ELSD法测定肉苁蓉药材中半乳糖醇含量 鲍忠,蔡鸿,姜勇,屠鹏飞 (北京大学药学院中医药现代研究中心,北京100083) 摘要目的:建立肉苁蓉药材中通便有效成分半乳糖醇的含量测定方法.方法:采用高效液相色谱分离,蒸发光散射检测器 (ELSD)检测,色谱柱为PrevailCarbohydrateES聚合凝胶柱(250mmx4.6mm,5),流动相为乙腈一水(77:23),流速为 0.7mL?min,;柱温为25?,检测器漂移管温度为40?,气体压力为240kPa.结果:半乳糖醇线性范围为0.25,10.00g, r=0.9992;平均回收率为99.42%.结论:本法简便,准确,可作为肉苁蓉药材的质控方法. 关键词:肉苁蓉;半乳糖醇;高效液相色谱法;含量测定 中图分类号:R917文献标识码:A文章编号:0254—1793(2007)07—1003一o3 HPLC-—-ELSDdeterminationofgalactitolinHerbaCistanches BAOZhong,CAIHong,JIANGYong,TUPeng—fei (CenterofTraditionalChineseMedicine,SchoolofPharmaceuticalSciences,Heal~Science CenterofPekingUniversity,Beijing100083,China) AbstractObjective:Toestablishamethodfordeterminationofgalactitol,thelaxativeconstituentofHerba Cistanches.Method:TheanalysiswasperformedonanHPLCchromatograph,detectedbyELSD.Thecolumnwasa CarbohydrateESpolymerizedgel(250mm×4.6mm,5txm),andthemobilep water(77: hasewasacetonitrile— 23),ataflowrateof0.7mL?min-1.Thecolumntemperaturewasmaintainedat25oC,andthetemperatureof theshifttubeindetectorwassetat40oC,andthegaspressurewas240kPa.Results:Thelinearscopeofthegalac— titolwasbetween0.25to10.00txg,andtheaveragerecoverywas99.42%.Conclusion:Thissimple,accurate methodcanbeutilizedforthequalitycontrolforHerbaCistanches. Keywords:HerbaCistanches;galactitol;HPLC;assay 肉苁蓉为常用中药之一,具有补肾阳,益精血, 润肠通便之功效,用于阳痿,不孕,腰膝酸软,筋骨无 力,肠燥便秘等症.大量的研究表明,肉苁蓉补肾阳 作用的有效成分为苯乙醇苷类成分,如松果菊苷 (echinacoside),毛蕊花糖苷(verbascoside)等?J,润 肠通便的主要有效成分为半乳糖醇(galactito1)I3J. 中国药典2005年版一部收载的肉苁蓉为列当科植 物肉苁蓉CistanchedeserticolaY.C.Ma和管花肉苁 蓉Cistanchetubulosa(Schrenk)Wight的干燥带鳞叶 的肉质茎,并且在肉苁蓉项下收载了松果菊苷和毛 蕊花糖苷的含量测定,在管花肉苁蓉项下收载了松 果菊苷的含量测定J,确保了肉苁蓉补肾阳作用的 疗效,但肉苁蓉通便作用的疗效无法控制.为了有 效地控制肉苁蓉药材的质量,建立与传统药材功能 主治相关的多指标质量评价体系,我们首次对肉苁 蓉药材中半乳糖醇的含量测定方法进行了研究,采 用HPLC—ELSD法建立了定量分析方法,并对20 多批不同产地的肉苁蓉药材进行了分析,结果表明 该方法简便,准确,重现性好,可用于肉苁蓉药材的 质量评价. 1仪器与试药 美国Agilent1100系列HPLC(G1322A在线真 空脱气机,G1311A四元梯度泵,G1313A自动进样 器,G1316A柱温箱),法国SEDEX75型蒸发光散 射检测器(ELSD).半乳糖醇对照品由肉苁蓉饮 片经回流提取,醇沉,浓缩后过大孔吸附树脂,反 复结晶所得,经光谱数据与文献比较,确定 为半乳糖醇(galactito1),经HPLC检测(面积归一 十通讯作者Tel/Fax:(010)82802750;E—mail:pengfeitu@bjmu.edu.en 药物分析杂志ChinJPharmAnal2007,27(7)一1005一 化法)纯度大于99.0%.乙腈(色谱纯),甲醇(色 谱纯),水(二次蒸馏).肉苁蓉药材收集于内蒙 古,新疆各产地,由北京大学药学院屠鹏飞教授鉴 定. 2溶液的制备 2.1对照品溶液取半乳糖醇对照品适量,加 水制成浓度为每1mL含0.5mg的溶液,摇匀, 即得. 2.2供试品溶液取肉苁蓉药材粉末(过5号筛) 约1.0g,精密称定,置100mL锥形瓶中,精密加入 60%甲醇50mL,密塞,摇匀,称定重量,浸泡0.5h, 超声(功率:250W,频率:35kHz)处理40min,取 出,放冷,再称定重量,用60%甲醇补足减失重量, 摇匀,静置,精密吸取上清液5mL置25mL量瓶中, 用60%甲醇稀释至刻度,摇匀,用0.2m微孔滤膜 滤过,即得. 3色谱条件 PrevailCarbohydrateES聚合凝胶柱(250mm× 4.6mm,5m);流动相为乙腈一水(77:23);流速 为0.7mL?min,;柱温为25?;法国SEDEX75型 蒸发光散射检测器(ELSD):漂移管温度为40?,气 体压力为240kPa,检测灵敏度设置为8;进样量为 5L. 在上述色谱条件下,半乳糖醇色谱峰与相邻色 谱峰的分离度大于1.5,理论塔板数按半乳糖醇峰 计算不低于3000,拖尾因子应处于0.95—1.05之 间.见图1. 1O15 A B 图1对照品(A)和肉苁蓉样品(批号:ghtls43,B)的HPLC色谱图 Fig1HPLCchromatogramsofreferencesubstance(A)andsampleof HerbaCistanches(No.ghtls43,B) 1.半乳糖醇(galactito1) 4测定方法 分别精密吸取对照品溶液5及25L,供试品 溶液5L,注入液相色谱仪,峰面积,按外标二 点法对数方程计算. 5线性关系的考察 精密吸取半乳糖醇对照品溶液0.5,1.0,2.0, 5.0,10.0,20.0IxL,注入液相色谱仪,在上述色谱条 件测定,记录峰面积,以峰面积积分值的对数Y为 纵坐标,半乳糖醇进样量(Ixg)的对数x为横坐标, 绘制曲线并进行回归计算.结果表明,半乳糖 醇在0.25一l0.00g范围内呈良好线性关系.回 归方程为: Y=1.5488X+2.9l84r=0.9992 6精密度试验 取”2.2”项下的供试品溶液,在上述色谱条件 下,重复进样6次,测定峰面积,平均值为857.9,计 算精密度RSD为1.9%. 7重复性试验 取肉苁蓉样品,按”2.2”项下的方法,平行制备 6份供试品溶液,按上述色谱条件分别测定峰面积, 计算,得平均含量为3.65%.RSD为1.3%,结果表 明,方法重复性良好. 8稳定性试验 取肉苁蓉样品1份,按”2.2”项下的方法制备 供试品溶液,分别在0,2,4,8,l6,24h测定,其峰面 积平均值为888,RSD为1.5%,结果表明,供试品溶 液在24h内稳定. 9回收率试验 分别取批号为050316肉苁蓉样品(半乳糖醇的 含量为5.70%)0.5g共9份,3份为一组,分别精密 加入另配制的半乳糖醇对照品溶液(浓度为3.925 mg?mL)1,2,3mL,按”2.2”项下方法制成低, 中,高3个浓度的溶液,按上述色谱条件测定,计算 回收率.结果表明,在浓度为3.925mg?mL时, 方法的平均回收率为102.0%(n=3),RSD为 1.3%;在浓度为7.850mg?mL时,方法的平均回 收率为98.51%(n=3),RSD为3.0%;在浓度为 11.775mg?mL时,方法的平均回收率为97.79% (/7,=3),RSD为2.4%.通过低,中,高3个浓度,计 算所得方法的回收率在95.15%一103.4%之间,平 均回收率为99.42%(n=9). 1O样品测定 按照供试品溶液的制备方法和测定方法,对20 多批的肉苁蓉样品进行了测定,结果见表1. --—— 1006--——药物分析杂志ChinJPharmAnal2007,27(7) 表l肉苁蓉样品的来源及含量测定结果(n=2) TablTheSOUl~eSofHerbaCistanchesand theresultsofde~rminafion n讨论 11.1半乳糖醇为一种多元醇,在普通的c,.柱中不 能保留,一般1—2min即出峰,与其他单糖类成分 难以分离,我们分别对适合于糖和多元醇分离的氨 基柱WatersBONOAPARNH2(300mm×4.6mm,10 I.Lm),PhenomenexBondclone10NH2(300film×3.9 mm,10m)以及聚合凝胶柱PrevailCarbohydrateES (250mm×4.6mha,5m)进行了考察,结果表明, 聚合凝胶柱能够有效地对单糖类和多元醇类成分实 现分离,为其他单糖类成分和多元醇类成分的分析 提供参考. n.2在供试品溶液的制备方法优化中,我们分别 对不同的提取溶剂包括水,20%甲醇,40%甲醇, 60%甲醇,80%甲醇,甲醇等进行了比较,结果表明, 以60%甲醇提取效果最佳;对提取方法包括冷浸, 加热回流提取,超声提取等进行了比较,结果表明, 超声提取提取率高,且简便.在色谱条件优化中,我 们分别对流动相,流速,柱温,ELSD检测器的漂移 管温度,气体压力和灵敏度等进行了考察,优化了色 谱条件. l1.3半乳糖醇只有末端吸收,用紫外检测器检测, 灵敏度很低,溶剂干扰很大,采用HPLC—UVD法无 法进行含量测定,但采用蒸发光散射检测器(ELSD) 检测,灵敏度较高,本文采用HPLC—ELSD法首次 成功地建立了半乳糖醇的含量测定方法.结果表 明,该方法灵敏度高,重现性好,准确度高,可用于肉 苁蓉药材及其他含半乳糖醇或单糖类成分的药材的 质量控制. 参考文献 1SONGZhi—hong(宋志宏),LEILi(雷丽),TUPeng—fei(屠鹏 飞).Advancesinresearchofpharmacologicalactivityinplantsof CistancheHoffing.etnk(肉苁蓉属植物的药理活性研究进展). ChinTraditHerbDrugs(中草药),2003,34(9):16 2ZHANGBai—shun(张百舜),ZHAOXue—wen(赵学文),CHEN Shuang—hou(陈双厚),eta1.Laxativeactionofseparatedpartsfrom HerbaCistanches(肉苁蓉分离部位通便作用的实验研究).ChinJ InfTraditChinMed(中国中医药信息杂志),2003,10(11):31 3ZHANGBai—shun(张百舜),CHENShuang—hou(陈双厚), ZHAOXue—wen(赵学文),eta1.Studyonthedosage—effectrela. tionshipoflaxativeactionofgalactitolfromCistanche(肉苁蓉提取物 半乳糖醇通便作用的量效研究).ChinJInfTraditChinMed(中国 中医药信息杂志),2003,10(12):28 4ChP(中国药典).2005.VolI(一部):90 5TuPeng—fei(屠鹏飞),HEYan—ping(何燕萍),LOUZhi—cen (楼之岑).Studiesonchemicalconstituentsofthecultivatedde. seldivingCistanche(Cistanchedeserticola)(栽培肉苁蓉的化学成 分研究).NatProdResDev(天然产物研究与开发),1997,9(2):7 (本文于2006年4月11日收到)