作物抗逆性的基因工程研究进展

目录 摘要    1 关键词    1 Abstract    1 Key words    1 一、国内外植物抗逆性研究进展    1 1.1、多胺与植物抗逆性关系研究进展    2 1.2、海藻糖在提高植物抗逆性方面的研究进展    2 1.3、多效唑提高植物抗逆性的研究进展    3 二、各种抗逆机制及其基因工程进展    3 2.1、耐重金属机制及相关基因工程进展    3 2.2、抗旱机制及相关基因工程进展    3 2.3、抗冻机制及相关基因工程进展    3 2.4、抗氧化机制及相关基因工程进展    4 三、分离和鉴定的抗逆基因作用机理    4 3.1、mtID基因和gutD 基因    4 3.2、ImtI基因    4 3.3、otsBA 基因和TPS 基因    4 四、转录因子与植物抗逆性研究进展    4 4.1、MYB/MYC转录因子    4 4.2、ERF类转录因子    5 4.3、bZIP类转录因子    5 五、展望    5 致谢    6 参考文献    7 作物抗逆性的基因工程研究进展 摘要 植物作为生态系统的重要组成部分，无时无刻不在自身所处环境中进行着物质，信息和能量的交换。研究逆境对植物造成的伤害以及植物对此的反应，是认识植物与环境关系的一条重要途径，也是为人类控制植物的生长条件提供了可能性。近年来,由于DNA技术的发展,从基因等分子水平对植物抗逆性的研究已取得一定的进展。本文对在植物受不同逆境胁迫(如:重金属、冻害、氧化等)情况下的分子机制及植物抗逆性基因工程研究的进展进行综述。并对抗性生理领域中的一些学说和国内外一些研究结果作了介绍,并指出相生相克现象也可作为抗逆生理的一个方面加以研究,对于作物抗逆性的基因工程的应用前景进行了展望, 以便为进一步研究和应用提供一些相关信息。 关键词  植物  能量  抗逆性  基因工程   Advances in genetic engineering for Crops resistance Abstract  Plants as an important part of the ecosystem, All the time in itself and carry out a physical environment, information and exchange. Plants in stress and plant damage caused in this reaction is an important way to the plant environment and understanding of the relationship, but also for controlling the growth of human conditions offers the possibility of the plant. In recent years, due to the development of DNA technology, researchers from the molecular level of plant resistance genes has been some progress made??. In this paper, subject to different environmental stress on plants: progress (such as heavy metals, damage, oxidation, etc.) and the circumstances of the molecular mechanisms of plant resistance gene engineering studies were reviewed. And some of the theory and the results of several studies in the field of physiology confrontational introduced abroad, noting that allelopathy phenomenon can also be studied as an aspect of physiological stress resistance, resistance to the prospect of genetically engineered crops were prospected, in order to provide some information for further research and applications. Key words  Plants  energy  resistance  Genetic Engineering 自然生态系统中与植物相关的因子多种多样，且处于动态变化之中，植物对每自然界中的一个因子都有一定的耐受限度，即阈值。一旦环境因子的变化超越了这一阈值，就形成了逆境。因此，在植物的生长过程中，逆境是不可避免的。植物在长期与自然界相抗争的进化过程中，形成了相应的自我保护机制，从感受环境条件的变化到调整体内新陈代谢， 直至发生有遗传性的根本改变，并且将抗性遗传给后代。 一、国内外植物抗逆性研究进展 1.1、多胺与植物抗逆性关系研究进展 在逆境条件下,植物会改变生长和发育类型以适应环境。许多研究表明,在各种逆境协迫下,植物体中多胺水平及其合成酶活力会大量增加,以调节植物生长、发育和提高其抗逆能力,这种反应对逆境条件下的植物可能有意义。就目前的来看,多胺之所以能提高植物的抗逆性其机制可能是:①通过气孔调节和部分渗透调节控制逆境条件下水分的丢失。Liu等的研究表明,多胺以保卫细胞中向内的K+-通道作为靶点,调节气孔的运动[10]。多胺还可作为渗透调节剂,其积累可增加细胞间渗透,部分调节水分丢失。②调节膜的物理化学性质。多胺可与膜上带负电荷的磷脂分子头部及其他带负电的基团结合,影响了膜的流动性,同时也间接地调节膜结合酶的活性。③多胺可影响核酸酶和蛋白质酶特别是与植物抗逆性有关的保护酶活性,保护质膜和原生质不受伤害。④清除体内活性氧自由基和降低膜脂过氧化。⑤调节复制、转录、翻译过程。 尽管多胺对植物抗逆性起积极作用,但植物的各种抗性性状是由多个基因控制的数量性状,很难用转基因的方法将如此众多的外源基因同时转入一种植物中并进行表达调控,更何况还有很多与抗性有关的基因尚未发现,这说明植物抗性机制是复杂的。 迄今,多胺合成代谢中的3个关键酶ADC、ODC、SAMDC已在许多植物中得到了纯化和鉴定,它们的基因也从多种植物中克隆,并采用转基因技术获得了一些认为多胺可提高植物抗性的证据,但多胺在植物中的载体是什么,植物对多胺的信号感受和传递途径怎样,多胺通过怎样的信号转导通路作用于植物的抗性基因,作用于哪些抗性基因,进而在转录和翻译水平上调控这些基因的表达,控制胁迫蛋白的水平,都还不清楚。因此,采用各种手段,特别是分子生物学的方法研究多胺对植物作用的多样性和提高植物抗胁迫的分子机制、多胺作用的信号转导是值得考虑的 1.2、海藻糖在提高植物抗逆性方面的研究进展 高等植物体海藻糖最初是从S.lepidophylla中分离得到的,它在干旱时休眠,而重新给予水分后又复活。为在植物中找到产海藻糖的DNA序列,科研人员将大肠杆菌和酵母菌的海藻糖合成酶基因序列同植物基因数据库进行比较,他们发现,拟南芥和水稻中的某些克隆同大肠杆菌和酵母有高度同源的序列表达标签(EST)[5]。1998年,Vogel[6]等用拟南芥的cDNA文库在酵母的tps2突变体中表达,结果这个对温度及其敏感的突变体在38.6℃的高温下存活。在拟南芥中,他发现了两种基因,即AtTPPA和AtTPPB,二者均能编码6-磷酸海藻糖磷酸酯酶而与酵母tps2突变体进行功能互补。以上实验结果证明某些植物中也具有合成海藻糖的能力。这就为把海藻糖合成酶基因导入植物并使其在植物中表达提供了一定的科学前提。 以植物为对象研究在逆境条件下海藻糖对其保护作用的报道很少。斐炎等在对绿豆幼苗所做的试验中发现,经海藻糖处理的绿豆幼苗质膜上的Mg2+,K+-ATPase活性显著提高。王三根等发现,将用不同浓度的海藻糖预处理的小麦放在NaCl溶液中生长,其细胞电解质渗透率和脯氨酸含量显著降低,而叶绿素的含量、根系活力、物质积累和生长速度则均有提高。由此可见,海藻糖在植物幼苗遭受低温、盐害而脱水时,可以提高作物幼苗对低温和高盐的抗逆能力。 为更好的利用海藻糖的保护特性,利用海藻糖基因构建具有抗逆性的转基因植物则是更重要的手段。近年来,随着对海藻糖合成代谢途径的深入研究,许多微生物中各种海藻糖合成酶基因已相继被克隆,如大肠杆菌的otsA、otsB基因,酿酒酵母中的tps1、tps2、tsl1基因,担子菌灰树花中的Tsase基因等。已报道,美国科罗拉多医科大学已把酵母菌的tps1基因转入烟草并获得具抗旱型的转基因植株。我国的赵恢武等、戴秀玉等也已相继分别将tps基因和ost基因转入烟草,使其耐旱性增强。荷兰植物生物技术公司把OstBA导入甜菜、马铃薯中,在获得廉价海藻糖的同时,增强了植物的抗旱性和抗寒性。小麦、水稻是我国大面积种植的重要的粮食作物,在将海藻糖合成酶基因导入其以提高其抗逆性方面的研究也还是空白,目前多国科学家已开始了这方面的研究。 1.3、多效唑提高植物抗逆性的研究进展 多效唑是英国ICI有限公司在20世纪70年代末推出的一种高效低毒的植物生长延缓剂和广谱性的杀菌剂[1],因此它对多种植物都有调节生长的效应。多效唑还能引起植物体内一系列的代谢和结构变化,增强植物的抗逆性[2],并兼有杀菌作用。本文仅就多效唑提高植物的抗逆性方面作一简要综述,以期为该领域的研究提供借鉴。 二、各种抗逆机制及其基因工程进展 2.1、耐重金属机制及相关基因工程进展 植物对重金属的耐性机理有: 1、排斥机制, 即阻碍重金属的吸收或其在植物体内的运输。吸收后又排出体外。2、区域化机制。即使重金属在植物的液泡、叶片表皮毛、细胞壁等特定部位积累。从而与细胞中的其他组分隔离。达到解毒的效果。3、络合机制。即植物体内物质与重金属的络合作用。大分子金属螯合蛋白的螯合能力最强。它又可分为金属硫蛋白与植物螯合肽。前者是对多种重金属都具有螯合作用。由MTs基因直接编码合成。在特定条件下如重金属离子胁迫或其他逆境条件下表达。后者是以谷胱甘肽为底物。在GCS( C- G luCys合成酶) 、GS (GSH合成酶) 、和PCS( 植物螯合肽合成酶)的作用下合成的。可与重金属离子结合形成螯合物后从细胞质向液泡中转运并在液泡中积累。 2.2、抗旱机制及相关基因工程进展 干旱胁迫诱导基因一般分为两类:一类是在植物的抗性中起作用的蛋白质基因；以维持细胞各种生理生化代谢活动正常进行。包括渗透调节因子的合成酶基因。直接保护细胞免受水分胁迫伤害的功能蛋白基因。以及毒性降解酶基因。另一类即是在信号传导和基因表达过程中起调节作用的蛋白质基因。主要包括传递信号和调控基因表达的转录因子基因，感应和转导胁迫信号的蛋白激酶基因，以及在信号转导中起重要作用的蛋白酶基因。 2.3、抗冻机制及相关基因工程进展 冻害主要是由于冰晶对生物原生质损伤造成的。抗冻蛋白可分为抗冻糖蛋白、第一类抗冻肽、第二类抗冻肽及第三类抗冻肽。是一个大小和序列都具有异质性的分子群体。由多基因家族编码。 2.4、抗氧化机制及相关基因工程进展 植物体内清除活性氧的保护机制主要包括2种 : 1、酶促脱毒机制；过氧化物歧化酶( SOD )是植物抗氧化系统的第一道防线。可清除细胞中多余的超氧根阴离子，抗坏血酸过氧化物酶(APX )和过氧化氢酶(GAT ) 均是清除H2O2 的主要酶类。2、非酶促清除机制；非酶类抗氧化剂包括类黄酮、抗坏血酸、谷甘胱肽、胡萝卜素和甘露醇等。Shen B( 1997) 等报道了将细菌编码的甘露醇- 1- 磷酸脱氢酶Mt1D转入烟草中。体外实验表明转基因植株叶绿体中有甘露醇积累， 清除CH-的能力增强。 三、分离和鉴定的抗逆基因作用机理 3.1、mtID基因和gutD 基因 甘露醇和山梨醇都属于多元醇。m tID基因和gutD基因都是从大肠杆菌中克隆的分别编码两种多元醇合成的关键基因。多元醇因含多个羟基, 亲水性强, 能有效的维持细胞膨压, 从而起到抗盐作用。 3.2、ImtI基因 该基因是从生长于南非沙漠中的冰叶日中花(M esembryanthemumcrystanmi um ) 的cDNA 文库中分离得到的。可在盐碱或干旱胁迫下诱导表达。以肌醇为底物, 生成一种多羟基糖醇化合物芒柄醇。因其含有多个羟基。亲水能力强，能减少生理性干旱造成的损失而使植物得以耐盐。 3.3、otsBA 基因和TPS 基因 真核生物海藻糖的合成分别由Tps1和Tp s2两个基因来完成。其功能分别相当于大肠杆菌的otsA 和otsB基因。1996年以来已有多个研究组将TPS基因导入到烟草、马铃薯等植物中。该基因在高等植物中表达后能使高等植物积累一定浓度的海藻糖。从而，使植物对干旱具有一定的耐受能力。 四、转录因子与植物抗逆性研究进展 近年来, 转录因子在植物防卫反应和逆境胁迫应答过程中的应用越来越广泛。植物在生长繁殖受到各种环境的影响，由于基因工程、分子生物的发展, 使人们能够在基因组成、表达调控及信号传导等分子水平上认识植物对逆境胁迫的抗性机理。并已克隆到来自微生物等有机体的编码生化代谢关键酶和逆境胁迫信号传导的一些重要基因。胁迫信号在体内经过一系列中间信号传导。最终通过特定的转录因( transcr iption factor)与其相应的顺式作用元件结合，从而达到调控细胞核内基因表达的目的。 4.1、MYB/MYC转录因子 MYB类转录因子家族是指含有MYB结构域的一类转录因子。是植物中最大一类转录因子家族之一，在植物体内具有广泛的生物学功能。包括细胞形态发生、次生代谢、植物激素应答、生物和非生物胁迫应答等 。MYC类转录因子具有bHLH - ZIP结构，植物中已报道的具有bHLH 结构域的基因大多来自玉米。 玉米R基因家族基因首先被克隆, 随后MYC转录因子基因相继在矮牵牛、金鱼草、拟南芥、水稻等多种植物中被克隆。 4.2、ERF类转录因子 ERF类转录因子是一类与乙烯应答元件结合的蛋白。Ohme2Takag i等对烟草PR 基因启动子的分析确定了含有11个碱基( TAAGAGCCGCC) 的乙烯应答元件( ethylene- responsive elemen,t ERE)。其中AGCCGCC为GCC盒的核心元件。H ao等将与GCC盒特异性结合的区域称之为ERF结( ERFdomain )。并将其中含有ERF结构域的蛋白称之为ERF蛋白。 4.3、bZIP类转录因子 bZIP( basic leucine zipper) 类转录因子是普遍存在于动植物及微生物中的一类转录因子。识别核心序列为ACGT 的顺式作用元件。如CACGTG ( G盒) ,GACGTC( C盒), TACGTA (A 盒) 等。其中G 盒元件普遍存在于受ABA、生长素、茉莉酸、水杨酸诱导的基因中。如小麦的EmBP- 1、HBP- 1，番茄和拟南芥的GBF，水稻的TAF- 1 等。表明它与植物的抗逆性有一定关系。 五、展望 利用基因工程技术将外源抗逆基因导入植物细胞或植物体,从而提高其抗逆性,具有广阔的发展前景。但是，现在多数通过遗传工程产生的抗逆植物都局限于实验室内, 转基因的遗传稳定性有待进一步检验。此外，转基因植物在实验室里所表现的优于对照的抗逆能力在田间能否表现出来，这都需要进一步研究，提高植物抗逆性的研究仍有许多问题亟待解决。 然而植物的抗逆性往往不是由单个基因决定的,而是由多基因控制的数量性状,需要尽快丰富胁迫相关基因的数据库, 而且这些基因来源应尽量广泛且这些基因的功能还需要进一步分析。找到受逆境诱导后表达量足够大的启动子, 将更有利于改善转基因植物抗逆性。更多地筛选具有抗逆性状的目的基因、提高外源基因的转化率、转基因细胞的植株再生、有效解决基因沉默现象、转化植株后代的遗传稳定性、转基因植物的安全等问题,都是基因工程研究所必须解决的。相信在不久的以后，基因工程的发展对提高作物抗逆性的研究具有重要的作用，及其广泛的前景。 致谢 一直以来，我都认为写一篇综述是一件非常简单的事情，但是真正写起来，我才发现并非一件易事，因为大部分原因还是由于自身水平有限，所以写起文章来也举步维艰。本文写作幸得赵老师的帮助，因为赵老师是一个做事严谨，上课认真负责并且幽默风趣的人，因为这样才让上课变得生动活泼许多，同学们都十分容易接受学习到更多的知识，才让我奠定了一定的基因工程方面的知识，将这些课堂上学习到的东西归纳融入进去。虽然文章还有待完善，但是它是我第一次用自己学到的理论去“研究”出来的成果，而老师也改变了我的一些不成熟的想法，我也体会到自己独立去完成一篇文章是多么有意义。 赵老师的这种育人理念对我以后影响很大，他让我觉得他不仅仅是一个育人的老师，更是我以后人生路上的良师益友，能给我很多好的建议和帮助。将来，我也会走上教育岗位，我相信有了这次经历，我也会像赵老师一样对我的学生认真负责，让他们通过自己的努力真正去学会思考，品尝自己成功的喜悦。 谨致谢忱！ 参考文献 [1] 尹永强, 胡建斌, 邓明军. 植物叶片抗氧化系统及其对逆境胁迫的响应研究进展  中国农学通报 1200723( 1): 105-110. [2] 刘强, 张贵友, 陈受宜. 植物转录因子的结构与调控作用 科学报, 2000, 45(14): 1465-1474. [3] 汤章城. 植物抗逆性生理生化研究的某些进展[J].植物生理学通讯，1991，27(2): 146-148. [4] 汤章城. 植物对环境的适应和环境资源的利用[J].植物生理学通讯，1994，30(6): 401-405. [5] 李美如 等. 植物细胞中的抗寒物质及其与植物抗冷性的关系[J]. 植物生理学通讯，1995，31(5):328-334. [6] 周宜君，冯金朝，马文文，等． 植物抗逆分子机制研究进展[J]． 中央民族大学学报 ，2006，15(2)：169—176． [7] 焦芳婵, 毛雪， 李润植． 转基因改良植物的胁迫耐性[J]． 生物技术通讯 ，2001，12(2)：137． [8] Babu C， Zhang J， Blum A， et a1． HVA 1， a LEA gene from barley confers dehydration to lerance in transgenic rice (Oryza sativa L) via cell membrane protection[J]．Plant Sci，2004 ，166 ：855 — 862． [9] C heng Z,  T argolli J，H uang X ，et a1．Wheat LEA genes，PMA 80 and PMA 1959, enhancedehy dration tolerance of transgenic rice ( Oryza sativa L ) [J]．Mol Breed，2002 ，10:71—82． [10] Chaumont F ，Moshelion M ，Daniels J． Regulation of plant aquapor in activity1,[J]． Biol Cell，2005，97:749—764． [11] Ishitani M , Liu J P, Halfter U, et al. SOS3 function in plant salt tolerance N-myrist orylation and calcium bind-ing[J]. Plant Cell, 2000, 12: 1667-1677. [12] Jonak C, Okresz L, Bogre L, et al.  Complexity,  cross talk and integration of plant MAP kinase signaling[ J] . Cur-rent Opinion in Plant Biology, 2002, 5(5): 415-424.