激光共聚焦FV1000IX81-中文使用说明书讲解

激光共聚焦显微镜 FV1000 - 光谱扫描型 - (倒置显微镜IX81 简易使用 1 1 内容 启动系统 显微镜镜下观察 微分干涉差观察 荧光观察 取图的操作界面 如何取图 XY平面单标 XY平面双标 同步扫描方式 序列扫描方式 XY平面 单标 + 微分干涉差 XYZ扫描双标 XYL光谱扫描 2D 操作界面 图像分析 打开文件 3D图像的叠加 比例尺的使用 3D图像的重建 3D图像的旋转 Unmixing 保存图像 保存到CD-R 关闭系统 附录 3 4 5 6 7 10 13 16 19 21 24 24 25 26 27 29 31 35 36 37 38 2 2 开启系统 1 1. 2. 打开计算机. 打开激光器. (打开钥匙开关. 2-1. 多线氩离子 (458 nm, 488 nm, 514 nm ON (打开电源开关后,打开钥匙开关. 2-2. 氦氖绿 (543 nm ON 2-3. 氦氖红 (633 nm ON 3. 4. 打开汞灯电源开关. 登陆 Windows XP系统. User ID: Administrator Password: fluoview 5. 双击快捷方式： 打开 FV10-ASW应用软件. User ID: Administrator Password: Administrator * 系统软件的启动需要等待一定时间. 3 2 5 3 3 显微镜镜下观察 微分干涉差观察 1 手控面板 *DIC 元件 1. 使用手控面板选择物镜. (参照 Memo . 2 3 2. 插入起偏镜. 3. 插入微分干涉滑块. 4. 点击FV10-ASW软件中的图标. Note 1. 使用TD滑块控制卤素灯的光强. Note 2. 检查滤色片转盘的位置是否为“6.DICT” . 如果不是,用手柄按下DICT图标. 用此旋钮进行微分干 涉法对比度的调节. 5. 标本聚焦. 4 Memo 按照7-1的操作转换物镜的倍率之后，对： ●物镜 ●各物镜对应的DIC元件* 进行操作. 4 Note 1 4 显微镜镜下观察 荧光观察 1 Hand switch 1. 使用手控面板选择物镜. 2 2. 点击FV10-ASW软件中的图标. Note 1. 选择第3步后,显微镜进入荧光观察状态. 注意此时汞灯的机械快门要打开. (建议 通常机械快门要放在关闭的位置 ( . Note 2. 检查DIC滑块是否拉出. Note 2 Notes 1 & 3 3. 使用手控面板选择荧光滤色片. (参照 Memo . Note 3. 观察之前，检查汞灯的机械快门要放在 开启的位置 ( . 3 4. 标本聚焦. Memo 关于荧光滤色片 NIBA：蓝色激发/绿色荧光 （例：FITC、EGFP等） WIG ：绿色激发/红色荧光 （例：Rhodamine、DsRed等） 5 5 如何取图 (XY平面-单标+微分干涉差 获取单张图像（XY平面） （荧光图像＋微分干涉） 例：绿色荧光（FITC）+DIC图像 1 1. 点击FV10-ASW软件中的按钮 关闭汞灯快门 . 同时, 点击按钮 关闭卤素灯快门. 2. 2 3. 点击染料选择按钮. 在染料列表中, 双击用于观察的荧光染料. *取消当前荧光染料，选择另外荧光染 料，要双击已指定的荧光染料，并重复步 骤2. 点击Apply按钮. (关闭染料选择面板可以用Close按钮. 3 4. 选择TD1. 4 染料选择后的显示界面 16 16 如何取图 (XY平面-单标+微分干涉差 5 6 5. 点击XY Repeat按钮开始扫描. 6. 调节绿色 (FITC图像和微分干涉差的 图像. (图像调节的略述如下. 更多的信息,参照附录 1. 7. 点击Stop按钮停止扫描. (参照 Memo . 7 Memo 扫描控制面板 : 连续扫描 : 停止扫描 : 快速扫描(隔行扫描 图像调节略述 [1] [2] [1] 探测器的灵敏度调节 (HV [2] 共聚焦的孔径大小调节 (C.A. [3] 激光输出的调节 (Laser 调节方法 (例: HV调节: 点击滑块, HV直接提高 (或降低 到指定的 位置. 点击此按钮 或者使用鼠标转轮进行 微调. [3] 17 17 如何取图 (XY平面-单标+微分干涉差 8 9 8. 选择AutoHV, 并选择扫描速度. * 随着扫描速度变慢, 在保持同等亮度的前提 下, 背景噪音就会消除. (也可以使用Kalman accumulation方式. 更多的信息，参照附录2. 9. 点击XY按钮取得一幅图像. 10. 点击SeriesDone按钮, “2D ViewLiveImage(x” 2D界面就出现. 10 11 11. 保存该幅图像: 右击图像管理器中显示的图像图标， 选择另存为保存该幅图像. (保存为“xml”类型是 FV10-ASW软件专用的 图像. Memo FV10-ASW专用的图形格式 OIF格式: 创建“一个含 (16-bit TIFF的图像” 和 “一个附属 文件,”不能单独分割. OIB格式: 创建单个的OIF格式的文件, 方便进行移动和进 行其它的操作. 18 18 如何取图 (XYZ扫描-双标 获取3D图像(XYZ (荧光图像 例: 绿色荧光(FITC和红色荧光 (Rhodamine双标 这里介绍线序列扫描取图的过程. 1 4 5 6 7 1. 采用13和14页步骤1到7. 确定Z轴的上限和下限如下. 2. 输入StepSize大小(点击OP按钮可以 使用推荐的值, 并选择 . 3. 点击XY Repeat按钮开始扫描. 4. 点击 和 按钮上移焦点位置. (参照 Memo . 5. 当图像显示到达上限时, 点击Set 按钮确定. 6. 点击 和 按钮下移焦点位置. (参照 Memo . 2 8 Memo 和 按钮 : 点击移动1.0μm. : 点击移动0.1μm. 7. 当图像显示到达下限时, 点击Set 按钮确定. 8. 点击Stop按钮停止扫描. 19 19 如何取图 (XYZ扫描-双标 9 10 9. 选择AutoHV, 并选择扫描速度. * 随着扫描速度变慢, 在保持同等亮度的前提 下, 背景噪音就会消除. (也可以使用Kalman accumulation方式. 更多的信息，参照附录2. 10. 选择Depth按钮. 11. 点击XYZ按钮取得图像. 12. 点击SeriesDone按钮, “2D ViewLiveImage(x” 2D界面就出现. 11 13. 保存该幅图像: 右击图像管理器中显示的图像图标， 选择另存为保存该幅图像. (保存为“xml”类型是 FV10-ASW软件专用的 图像格式. 12 13 Memo FV10-ASW专用的图形格式 OIF格式: 创建“一个含 (16-bit TIFF的图像” 和 “一个附属 文件,”不能单独分割. OIB格式: 创建单个的OIF格式的文件, 方便进行移动和进 行其它的操作. 20 20 图像分析 (比例尺的使用 1 2 1. 点击按钮 . 2. 点击图像的同时, 拖放此比例尺到一个 特定的位置. 3. 点击手柄的左端或右端, 移动鼠标. 改变比例尺的大小 3 4. 选择比例尺并右击选择属性的设置. 4 5. 设置具体的比例尺属性. 改变文本, 颜色, 字体等. 5 26 26 图像分析 (3D图像的重建 以一定的角度观察3D图像 1 3 1. 点击按钮 2. 创建3D图像. . 3. 拖动鼠标以一定的角度观察图像. → 要保存此图像, 进行下一页第6步的 操作. 观察3D图像的某个横截面 4 5 4. 点击按钮 并选定 . 5. 拖动鼠标观察某个垂直横断面. → 要保存此图像, 进行下一页第6步的 操作. 27 27 图像分析 (3D图像的重建 保存上一页中第3、5选项的图像 6 6. 点击按钮 . 7. 会创建一个2D图像 (带文件名. 8 8. 保存该幅图像: 右击图像管理器中显示的图像图标， 选择另存为保存该幅图像. (保存为“xml”类型是 FV10-ASW软件专用的 图像格式. Memo FV10-ASW专用的图形格式 OIF格式: 创建“一个含 (16-bit TIFF的图像” 和 “一个附属 文件,”不能单独分割. OIB格式: 创建单个的OIF格式的文件, 方便进行移动和进 行其它的操作. 28 28 图像分析 (3D图像的旋转 1. 点击按钮 . 1 3 2. 创建3D图像. 3. 拖动鼠标以一定的角度观察图像. 动画的播放 4 4. 点击并控制按钮 着 X-轴旋转. 再次点击停止旋转. 实现图像围绕 点击并控制按钮 着 Y-轴旋转. 再次点击停止旋转. 实现图像围绕 点击并控制按钮 着 Z-轴旋转. 再次点击停止旋转. 实现图像围绕 29 29 图像分析 (3D图像的旋转 要保存动态旋转的图像, 请参照 如下的方法创建3D图像. 例, 试图旋转图像180度. 5 6 5. 点击按钮 . 6. 点击Angle rotation菜单. 7 8 9 10 30 7. 选择旋转轴. 8. 输入旋转的角度. Start = End = Frame/s = Interval = 开始角度 结束角度 旋转速度 单次旋转的角度 9. 选择AVI类型并点击Create按钮. 10. 输入一个文件名并点击Save按钮. 30 保存到 CD-R 1. 插入一张CD-R光盘. 2 2. 点击OK. 3 4 3. 选择文件并拖放到CD-R的窗口. 4. 点击"Write these files to CD." 5. 点击Next. 5 6 7 36 6. 开始刻录. 7. 点击Finish按钮结束. 36 关闭系统 1. 选择File/Exit, 退出FV10-ASW软件. 1 2 2. 退出Windows XP. (1 选择Start/Shut Down. (2 在Shut Down窗口中, 选择Shut Down并点击OK按钮. 3. 关闭激光器. (关闭钥匙开关. 3-1. 多线氩离子 (458 nm, 488 nm, 514 nm OFF (等待风扇停止,关闭电源开关. 3-2. 氦氖绿 (543 nm OFF 3-3. 氦氖红 (633 nm OFF 4. 关闭汞灯电源. 4 37 3 37 激光共聚焦显微镜 FV1000 - 光谱扫描型 - (倒置显微镜IX81 附录 38 38 附录1 共聚焦的原理和调节原理 HV: 探测器灵敏度的调节 (Voltage 给定值 ↑ > 灵敏度 ↑ > 图像亮度 ↑ (注意背景噪音变得突出. * 推荐值为700V或700V以下. 按钮: 改变电压以1V为一个单位 (投射光通道设定为1V Gain调节 (x 给定值 ↑ >图像亮度 ↑ 依照放大率的变化, 图像变得更亮. 按钮: 改变增益以x 0.01为一个单位 Offset调节 (% 给定值 ↑ >图像亮度 ↓ 按钮: 改变增益补偿以1%为一个单位 C.A.: 共聚焦孔径大小的调节 (μm 给定值 ↑ > C.A. 大小 ↑ > 图像亮度 ↑ (注意光学切片的厚度变大. * 推荐使用Auto设置. 经过调节C.A.要恢复初始值, 再次点击Auto. 按钮: 改变孔径大小以1μm为一个单位. M_Ar or HeNeG, HeNeR: 激光输出强度的调节 (% 给定值 ↑ > 输出强度 ↑ > 图像亮度 ↑ (注意荧光漂白变得明显. * 激光输出强度尽量要小. 按钮: 改变输出强度以1%为一个单位. Memo 共聚焦孔径大小、光学切片厚度和 图像亮度的关系 C.A. Optical slice thickness Image brightness 激光输出强度、探测器灵敏度和 图像亮度的关系 M_Ar PMT Image brightness 39 39 附录2 获取图像如何降低背景噪音 降低扫描速度 通过降低扫描速度探测器从开始检测就 忽略背景噪音. 优点: ? 相比Kalman方式, 能够取到更锐的图. Auto ON: 扫描速度变慢时, 背景噪音被去 除而图像亮度不变. Auto OFF: 扫描速度变慢时, 背景噪音被去 除而图像亮度增加. 缺点: ? 单次扫描的速度很慢. 1. 选择扫描速度. ********************************************************************************** Kalman方式 通过重复获取一定数量的图像进行平均算法 运算处理. 从而去除背景噪音和粗糙度. 优点: ? 单次扫描的速度很快. 缺点: ? 由于图像平均而图像模糊. 1. 点击Kalman并选择Line或Frame方式. 2. 输入累计数字(扫描的次数. 40 40