采收时期对黔产银杏叶中萜类内酯含量的影响

采收时期对黔产银杏叶中萜类内酯含量的影响 采收时期对黔产银杏叶中萜类内酯含量的 影响 贵州农业科学2010,38(12):74,76 GuizhouAgriculturalSciences [文章编号]10013601(2010)12-0821—0074—03 采收时期对黔产银杏叶中萜类内酯含量的影响 麻秀萍,杨清秋.,蒋朝晖,贾宪生,丁宁 (1.贵阳中医学院,贵州贵阳550002;2.安顺市西秀区人民医院,贵州安顺561000) [摘要]为充分有效利用贵州银杏资源,提高银杏产品质量,采用高效液相色谱一蒸发光散射检测法 ELSD)测定了银杏叶中银杏萜类内酯的含量.结果表明:不同产地,不同采(HPLC— 收时期银杏叶中萜类内酯 的含量不同,以9月和10月采收的银杏叶中萜类内酯含量最高.说明,采收时期对银杏叶中萜类内酯的含量 有影响. [关键词]黔产银杏叶;萜类内酯;含量变化;HPLC—ELSD [中图分类号]$682.39[文献标识码]A EffectofDifferentPickingPeriodonTerpeneLactone ContentinLeavesofGinkgobilobafrOmGuizhou MAXiuping,YANGQingqiu,JIANGZhao—hui,JIAXian—sheng,DINGNing (1.GuiyangCollegeofTraditionalChineseMedicine,Guiyang,Guizhou550002;2.XixiuPe ople'SHospital, Anshun,Guizhou561000,China) Abstract:Theterpene1actonecontentin1eavesofGinkgobilobafromGuizhouwasdetermin edby HPIC—ELSDtoeffectivelyutilizeGinkgobilobaresourcesandimprovequalityofGinkgobilobapro ducts. Theresultsshowedthattherewasdifferenceinterpenelactonecontentin1eavesofGinkgobil obabetween differentproducingareasanddifferentpickingperiod.andtheterpenelactonecontentinleave sofGinkgo bilobapickedinSeptemberandOctoberwasthehighest,whichindicatesthatpickingperiodh aseffecton terpenelactonecontentin1eavesofGinkgobilobafromGuizhou. Keywords:GinkgobilobaleavesfromGuizhou;terpene1actones;contentchange;HPLC—ELSD 银杏叶即银杏科植物银杏(GinkgobilobaL.) 的叶子,银杏萜类内酯化合物是银杏叶特有的重要 活性成分,包括银杏内酯A,B,C(ginkgolide,属于 二萜类化合物)和白果内酯(bilobalide,属于倍半萜 类内酯),简称GA,GB,GC和BB.大量药理研究 成果表明,银杏萜类内酯具有扩张冠状物动脉血管, 增加脑血流量,改善脑营养与明显的抗血小板活化 因子,抗过敏,抗休克,抗菌抗炎,抗器官移植排斥反 应等作用_】],因此倍受国内外学者的重视.作为我 国特产的植物,银杏资源十分丰富,由于不同来源的 银杏叶受气候,土壤,树龄,性别及季节等因素的影 响,其萜类内酯的含量不同,从而大大影响银杏叶保 健食品,药品等制品的质量稳定性及质量控制..]. 但目前尚无对黔产银杏叶中萜类内酯含量的报道, 因此,笔者采用HPLC—ELSD法研究了贵州不同产 地,不同采收时期银杏叶中银杏萜类内酯含量的变 化情况,探索黔产银杏叶中萜类内酯分布情况及最 佳采收期,旨在为充分有效利用贵州银杏资源,提高 银杏产品质量提供参考. [收稿日期]2010—0610;2010—11一O8修回 [基金项目]贵州省科学技术基金项目"HPLCEISD法测定银杏叶及其制剂中银杏萜类内酯的含量"[黔基合计字(2002)3064] [作者简介]麻秀萍(1971一),女,副教授,从事中药及制剂,教学和科研工作.E—mail:mxp00l130@sina.corn.cn [17] E182 [19] [2o] Veljovic—JovanovicS,KukavicaB,StevanovicB.eta1. Senescenceanddrought—relatedchangesinperoxidase andsuperoxidedismutaseisoformsinleavesofAmon— daserbica[J~.JournalofExperimenatlBotany,2006, 57:1759-1768. Fridorich.SuperoxidedismutaseEJ].AnnReviewof Biochemistry,1975,4:147—155. 沈文飚,叶茂炳,徐朗莱,等.小麦旗叶自然衰老过程 中清除活性氧能力的变化[J].植物,1997,39 (7):634-640. 蒋高明.植物生理生态学[M].北京:高等教育出版 社,2004:174198. [21] E22] [23] , HansLames植物生理生态学[M].张国平,周伟军 译.杭州:浙江大学出版社. 许乃霞,杨益花.抽穗后水稻根系活力与地上部叶片 衰老及净光合速率相关性的研究[J].安徽农业科学, 2009,37(5):1919-1921. IeeR,WangC,ChenS.Iearsenescenceinrice plants:Cloningandcharacterizationofsenescenceup— regulatedgenes[J2.JournalofExperimentalBotany, 2001.52:11171】2】. (责任编辑:聂克艳) 第12期麻秀萍等采收时期对黔产银杏叶中萜类内酯含量的影响 1与方法 1.1材料 1.1.1样品银杏叶采自贵州省贵阳市,遵义市, 安顺市,盘县,分别采集不同产地的同一株树5—11 月的银杏叶. 1.1.2仪器与试剂Agilent1100高效液相色谱 仪(在线脱气机,二元泵,自动进样器,Agilent化学 工作站);Alhech2000蒸发光散射检测器(ELSD); 银杏内酯A(GA),B(GB),C(GC)及白果内酯(BB) 由中国生物制品中心提供(编号分别为110862 200305,110863—200204,110864—200203,110865— 200303);甲醇(色谱纯),四氢呋喃(色谱纯),水为纯 净水;氯仿,乙酸乙酯为分析纯;硅胶(层析用,1()(), 160目);聚酰胺(层析用,100目). 毛 彗 专 梭; 磐亏 1.2方法 1.2.1供试品溶液制备精密称取银杏叶粉末 (60目)4g,用10甲醇溶液超声提取2次,每次 2OmL,超声处理30min,过滤,合并滤液,挥去甲醇, 通过聚酰胺小柱(3g,100目),用水5OmL洗脱,收 集出柱液和水洗脱液,蒸干,残渣用少量甲醇溶解, 加入适量硅胶拌匀,水浴上挥尽残存的甲醇后,置硅 胶柱上(5g,1OO,120目,105?活化60min),用氯仿一 乙酸乙酯(1:1)50mL洗脱,回收溶剂,残渣用甲醇 溶解,定容至5mL,摇匀,过滤,取续滤液,即得. 1.2.2色谱条件色谱柱:DiamonsilC18(4.6× 150mm5"m);柱温35?;流动相:甲醇一四氢呋喃一 水(19:11:70);流速:0.6mL/min;ELSD漂移管 温度:100?,空气流速:2.5L/min.理论塔板数按 白果内酯峰计算应不低于4000(图1). 1.银杏内酯C(GinkgolideC,4.2min)2.白果内酯(Bilobalide,5.1min) 3.银杏内酯A(GinkgolideA,5.9rain)4.银杏内酯B(GinkgolideB,8.0min) 图l银杏萜类内酯对照品(A)与银杏叶供试品(BJ色谱图 Fig.1Thechromatogramofstandardterpenelactonesampleandterpenelactonesampleinlea vesofGinkgobiloba 1.2.3标准曲线的绘制分别精密称取银杏内酯 AlO.9mg,银杏内酯B31.3mg,银杏内酯C9. 7mg,白果内酯1O.1mg,置于25mI量瓶中,加甲 醇溶解并稀释至刻度,得对照品溶液;分别再精密吸 取对照品溶液1,25mI量瓶中,用50甲醇稀释 至刻度,摇匀,制成系列浓度银杏内酯A,银杏内酯 B,银杏内酯C,白果内酯对照品溶液;取10L注入 液相色谱仪,测定,以峰面积(A)的自然对数为纵坐 标Y,进样量(g)的自然对数为横坐标z进行线性 回归,得回归方程如下: (A===0.7151+7.12929,R一0.9992,银杏内 酯A线性范围0.1744,0.872g; yR一1.27448z+8.27889,R===0.9993,银杏 内酯B线性范围0.5008,2.504g; v===1.06584z+6.12507,R一0.9994,银杏 内酯C线性范围0.1552,0.776/zg; BB一1.O819-z+6.18117,R一0.9991,白果内 酯线性范围0.1616,0.808g. 1.2.4稳定性取任一供试品溶液,分别于配制 后1h,3h,5h,7h和9h,取10L注入液相色谱仪, 记录峰面积的变化情况,银杏内酯A峰面积值的 RSD为1.8%,银杏内酯B峰面积值的RSD为 1.8,银杏内酯c峰面积值的RSD为2.0,白果 内酯峰面积值的RSD为1.9,表明供试液至少在 9h内测定稳定. 1.2.5回收率与精密度为了考察方法的可靠 性,进行了回收率和精密度的测定.精密称取1O月 采集的贵阳银杏叶粉末6份,每份2g(银杏叶粉末 含银杏内酯A,B,C和白果内酯分别为0.092mg/ g,0.241mg/g,0.038mg/g,0.047mg/g),精密加入 银杏内酯A,B,C和白果内酯对照品各0.1744mg, 0.5008mg,0.0776mg,0.0808mg,按1.2.1方法 处理,进样,测定峰面积,根据测定结果计算回收率 和相对标准偏差. 2结果与分析 2.1不同产地,不同生长期银杏叶中萜类内酯的含量 在供试品前处理方法和检测条件一致的条件 下,比较了不同产地,不同生长期银杏叶中萜类内酯 的含量,结果见图2. 贵州农业科学 5O791U11 谊| Month 注:未采到盘县5—7月样品,无试验数据. Note:NotestdataofPancountyfromMaytoJulyforno sampleswerecollected. 图2贵州不同产地不同采收(生长)时期总银 杏萜类内酯含量变化情况 Fig.2Effectofdifferentproducingareaanddifferentpick— ingperiodontotalterpenelactonecontentinleaves ofGinkgobilobafromGuizhou 对同一产地同一株树不同月份的银杏叶进行检 测发现,采收季节对银杏叶萜类内酯的含量有较大 的影响,从5月到1O月含量逐渐上升,并且在9— 1o月达到最高值,10月后急剧下降.对贵州4个产 地栽培银杏叶的含量分析结果表明,不同产地银杏 叶总萜类内酯含量普遍偏低,最高时仅为0.03, 0.07(其中盘县银杏叶萜类内酯较高,8—1O月含 量为0.0402,0.0705;遵义银杏叶萜类内酯 5—10月含量为0.0007,0.0423;贵阳银杏叶 萜类内酯5—10月含量为0.0006,O.0418;安 顺银杏叶萜类内酯5—10月含量为0.0005, 0.0339),11月萜类内酯含量顺序发生改变,从高 到低依次为盘县(0.0328),安顺(0.0115),遵 义(O.0086),贵阳(0.0063),这与各地气候,土 壤等因素有关.黔产银杏叶中银杏各内酯含量的比 例不同,BB最先测出,但随着时间变化,BB变化不 大,GB从8月开始含量明显高,最后成为几种内酯 中含量最高的一种,结果见图3. 图3贵阳产银杳叶不同采收(生长)时期银杏萜类内酯含量 Fig.3Effectofdifferentpickingperiodonterpenelactone contentinleavesofGinkgobilobafromGuizhou 2.2回收率与精密度 回收率一般要求为95,105,否则表明方 法不适宜;相对标准偏差(RSD)越小,说明精密度 越好,一般当RSD小于3时,说明方法具有较高精 密度.试验表明,萜类内酯(以银杏内酯A,B,C和白 果内酯之和计)的平均加样回收率为97.O1,RSD 为1.9,说明方法具有较高的准确性和精密度. 3结论与讨论 1)在对供试液制备条件的选择比较中,用石油 醚先除去叶绿素,再对银杏叶中的萜类内酯进行提 取,虽能除去溶于石油醚中极性小的物质,但叶绿素 等并不能被完全除去,从而影响银杏萜类内酯峰的 分离度,而用1o甲醇提取则排除了叶绿素等脂溶 性物质的干扰,通过聚酰胺小柱除去黄酮类,鞣质等 酚性成分的干扰,以硅胶柱富集萜类内酯.比较了 2005版《中国药典》中银杏叶萜类内酯萃取的方法, 虽然操作简便,但存在萃取不完全和易乳化等问题, 且杂质干扰较大.故笔者选择用1O甲醇提取后 再以柱层析法分离纯化富集供试品. 2)对同一产地同一株树不同月份的银杏叶进 行检测发现,采收季节对银杏叶萜类内酯的含量有 较大影响,在贵州9月,10月的银杏叶比其他月份 的银杏叶中萜类内酯含量高,l1月急剧降低.据文 献报道l_5_6,湖南银杏叶中萜类内酯含量6月最高,8 月显着下降;安徽银杏叶中萜类内酯含量8月最高, 10月11月急剧下降.这与各地气候,土壤,树龄等 因素有关,故银杏叶最佳采收期不可用月份来定,而 应根据各地银杏叶的生长时期来定,当银杏叶为绿 色且茂盛时采收为宜.另外,黔产银杏叶各萜类内 酯含量的比例不同,BB最先测出,随着时间变化, BB变化不大,GB从8月开始含量明显升高,最后 成为几种萜类内酯中含量最高的一种,这与外省银 杏叶中银杏萜类内酯的含量分布情况不同口],外省 银杏叶中BB和GA含量较高,GB较低,这与国内 生产的银杏叶提取物中萜类内酯的分布相似,各萜 类内酯含量高低对银杏叶的质量有什么影响,需进 一 步研究. 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