血源凝血因子浓缩物生产过程中的安全…

血源凝血因子浓缩物生产过程中的安全… 血源凝血因子浓缩物生产过程中的安全… 一 168一 主免疫非常重要,已报道凡种配方如脂质体, 水包油乳裁等.掘诱所述,?划e等论证了 吉有B30-MDP胆阿醇和流感病毒亚单位抗 原的脂质体型配方.Mo~ein等也报遭一种用 于亚单位疫苗的新璺佐剂配方,多聚体微胶 粒,病毒脂蛋白体和免疫刺激复合物(ISCO M).Phillips等报道含蛋自抗原和MDP- ,GDP的脂质体髓有效地诱生同型IgG2a12b 和IgG3抗蛋白抗原的抗体.Haigwood等也 报 . I了 /1 ,诊断,治疗用生物制品分册Lf .国外医学,预防 人类免疫缺陷症病毒(HIV-t)能使狒狒产生 广谱中和抗体.Byars等证变?由含0.4嘶 Tween,l5蜘L121和1O和角鲨烷的PBS组成竹 新佐剂配方SAF-I能增强小鼠和豚鼠对乙型 流感病毒血凝素和己型肝炎疫苗的抗体应 答作者曾报道含角鲎烷-HCO和6O—甘露 醇的水包油乳荆对亲腊性MDP衍生物醌基 一 MDP-66是一种很稳定的佐搿配方. [Yaceinc1992;1O(14):1Oo0,1OO6 宠威华棱] 问题 饲支, 内窖撮要血浆衍生的糖蛋白在临床上有着广泛的应用价值,但是由于血浆的病毒污染,给箭 品带巢产重的后果.作者强调了血员的严格筛选和对血浆的认真检查,并规定了检查的和 详细方诖敬还以大量篇幅阐述了对各种污染病毒的灭皤和排除方法殛其效果,并撑出了在灭瑶 过程中虚注意的理化条件.最近还规定了有关磺量控制和质量保证的一些措施. 人血浆已广泛甩于提取具有生物话性的 糖鬣自,应用这种糖虽自可治疗人的出血或 血柱形底性疾病.它们包括因子礓(F礓), VOltWiilehrand因子(vWF),凝血酶原复合 物(PCC),FIX,FVII,纤维蛋自原,蛋白C, 抗凝血酶?(AT?)FxI,Fx,和FXII1.邀些 物质,特别是F砸,vWF~IPCC.在献血员未 进行病毒检测以前,或血浆未进行病毒灭活 l;l前,可传播病毒性疾病,尤其是AIDS和 肝炎.由于污染同种蛋白,同族血凝素,酶 原,话化的凝血因子,或在纯化过程中的间 断变性也可引起一些剐作用. 鉴于对血浆痛毒筛检,病毒灭活方法, 纯化技术和质量控铷都有明显改进,所以对 血源凝血因子浓缩物的安垒性必须进行重新 评估 对输入血液和/或血浆衍生物的患者可引起 严重后果,逡在以往的综述中已经作过详细 报道,这里仅介绍与输血有关的几种病毒 乙垄肝炎病毒(HBV)是一种双股DNA病 毒.丁型肝炎病毒(HDV)是一种单股包膜 RNA缺陷病毒,依赖HBV复耕和仅感染HBV 壕染患者.甲型肝炎病毒(HAV)是RNA病 毒,属于微小核糖核酸病毒.丙型肝炎病毒 (HCV)是一种未分类的披膜病毒.人类免疫 缺陷症病毒(HIV-1和}II2)是单股RNA慢 病毒.此外,尚有1型人T细胞白血病病毒 (HTLV-1),1型单纯泡疹病毒(HSV-1)水 痘,带状痘疹病毒(vzv),EB病毒(EBV),巨 细胞病毒(CMV)和6型凡癌疹病毒(HHV6) 等 献血员的选择和血浆病毒筛检 血液携带的病毒 一 认真选择献血员和对每批血浆的筛检都 血液可能是病毒的宿主,所携带的病毒会明显降低血浆中的病毒浓 度.选择献血员 塑生整些墨筻塑 时一定要排除不健康者和高危人群,如药瘕 者,同性恋者以骧曾到过与输血有关的传染 病高发区的人群.现已发现,使用美国生产 的威用来自.美国血浆生产的血液伟嗄品,与凝 血因子缺乏相关的AIDS发病率较高.血浆筛 检可排除某些致病因子阳性晦献血员直接 检测HBsAg可发现HBV携带者,尽管用”第 三代单克隆挠棒试难柱碱钷敏感,但对轻微 感染的血液也很难测出.1i匠来用免疫血清学 标志(抗HCV抗体)检测HCVIjH性血渡也B 成为可能以往用的替根试验,转氮酶升高 以及抗-HBc的存在都可作为检测肝炎病 毒携带者的方;垡}.甩酶兔疲灞淀法检测抗 _HIv—l和抗—?,2’以消除已感染人群赦 血由于肝炎绚流行病学与 1日相馘,所 以在mV抗体出l现蕾,抗一HBc孽蕾捡也是有帮 助的.可用免瘴?靶清学方法检出辅PLV,-1和 HT0V一2阳性供血者. 关于血浆的常掘检查程序,.由国家有关 部门制订,当然也要考虑当地的皋奉学和流 行瘸学标碓以及费用和效莓优率不同国家 检渊程序各异数蜻埠至l少鹰括HBsA$ 和抗_壬1.摄孱鞲供应?藩金性已迭辨 很高水平,目前主要检捌血蔽和血浆串的 HBsAg,抗_HIv一1,抗珏V一2,抗-Hey, 抗-HBc,抗HTLV-I,抗}LV一2和转氨酶. 但是由壬技术和人为的原田,或蛲乏敏感和 特异的直接病毒标志试验,所以仍可能残留 病毒污染,台并后柏血浆仍存在感染危险性. 有了lI】BsA层筛检方法后,虽然乙型肝炎的传 播得到了控锚,但是大量未消毒构低纯度凝 血因子浓缩物仍可传播丙型肝炎和AIDS.同 样,也曾有过这些浓缩物被HDV渖j小病毒B 1VBl9)污染的.凝血因子浓缩物的病 毒安全性部分取决于病毒灭活和抽提方法. 凝血因子浓缩物的病毒灭活处理 排除和降低凝啦凰子浓缩物感染性的方 一 169—— 法已经建立.在保留凝血因子的生物学活性 的同时,建立这些技术时一个闯鼯就是要保 证高水平的病毒灭活,最新的病毒灭活方j奇 是物理和化学处理 用蕊内酶(PL)和紫外线照射(uV 处理分别结合化学和光化学消毒,以破坏病 毒核酸.FVIII不能耐受用于制造PCC舱 口_PL/uV方法的处理.用黑猩猩研究表明, _PI./uV可以破坏71og10的HBV和高于4lo譬 1O的非甲非乙型肝炎病毒(NANBHV). 自从8O年代初试图灭话肝炎病毒以来, 有人曾对冻干F饥?浓缩物和PCC进行6o, 88.a加热处理,3o,06小时的研究.这种干 热处理法起始于1984年,目的是阻止HIv的 传播.用1WILl和PCC浓缩物试验表明,68o 处理必矮小时以上,才能灭活3.51og以上 的HIV.事实上.太多数干热处理不能完全 灭活I-IBV和NANBHV.对某些FVIII浓缩物, 篙要60.a处理20~30小时以灭活HIV其效 果很大程度受该制品的蛋白组成,配方和残 余水份影响.8O.O处理72小时-可获得无HcV 的F咂浓缩物,而100.a处理10,30分可灭 活细小病毒B19.在有机溶剂(如氯仿或庚烷): 或水蒸汽存在下,加热制品能增强抗NAN HV的安全性.但这种n皿浓缩物仍有传播 肝炎的报遘. 在保护凝血因子的特异和非特异稳定翘 存在时,濠态加热60.C10~b时,可有效灭潘 各种病毒.但是应仔细选定条件,使稳定荆 不致于保护病毒不被灭活.对几种典型病毒 来说,此法的效果可达51og以上,至少Icg 的HIV能在不到5分钟内灭活此法应用于 FVIII和FIX浓缩物有良好安全记录,但巴所 德法消毒的FvI?偶有传播乙型肝炎的报道.. 此法可用于其他凝血因子浓缩物,包括FIX 纤维蛋白愿,Fx?和A??. 溶剂一去污剂法(SD)处理是把蛋白溶液 与有机溶剂(通常是磷酸三正丁酯)和去污剂 的混合物一起培育以裂解脂质包膜病毒.此 一 170一 法至少对卸?,HBV,HCV,HD,唷效.对 H1W-1,HBV~]HCV的灭活率分别高于lO,6 和Slog.临床试验表明,SD处理的Fv1?浓 缩物不传播AIDS和肝炎.因这种处理主要 针对脂质,并对蛋白有低度变性作用,因此 可保留它们的生物学活性.此法己应用于各 种治疗用浓缩物,包括FV’III,vWF,FIX, PCC,FVll,纤维蛋白原,纤维蛋白胶,l?, 蛋白C和凝血酶,对脂质包膜病毒有很好的 灭话效果. 射线剂量2.5~10Mrad(取决乎温度) 可灭活血浆中的5,61口巷’H?但有效的灭 恬病毒剂量对FVIII和PCC的生钉学活性有 变性作用. 到目前为止,临床资料表明,巴斯德消 毒法和’S’D_赴理均髓确保凝血因子浓缩物的 :安垒,不会传播AIDS和肝炎. 窥化工艺在病毒 . 安全性中的作用 纯化技术在血浆制品安全性中超重要作 佣.与唧肝炎传播有关的FV玎和PCC 缩物产生r除采缴病毒灭活步骤井,从 血浆纯倍数(2g,1?倍)与其浓缩倍数相 似(伴有类似的浓缩病毒危险性)其生产方 谣是在近中性pH进行非特异沉淀或吸附步 骤.铡如在Fvm制翔和Pcc中n唧nx分 别少于总蛋白的l啊.因此无法与任何传染因 子分离,以保证制品的安全性.与此相反, 抗抑制剂凝血复台物(活化的PCC)经过20和 羚乙醇沉淀,表明可以灭活和消除3.51og以 上的HIV感染,而不传播AIDS.近几年来, 微量血浆蛋白的制造过程有明显改进,保证 纯度达l万倍以上(而浓缩倍数仅30~i00 倍),因此可保证制l品的安全性 新的凝血因子浓缩物的生产,通常要经 离心,l沉淀,层析,超滤和冻千等几个步骤. 从理论上讲,以上每个步骤都能排除或灭活 !垦基望!翌堕!堑!.造直生塑旦堂堑 病毒病毒传播的可能性极小.新一代滤器 (有些滤器滤孔很小,在蛐丑m以下)对排除 病毒可能有效.但要考虑凝血因子的可滤性 和回收.对某些制品,冻千可灭活大约flog 的瑚.在无菌过滤和分装以前,超滤一般 被用于浓缩铺品. — 般来说,具有l万~l0万Da截留值的膜 可用来除掉低分子量组分,保留有用韵蛋白 组分.除非在操作过程中发生不受控制的病 毒结台.此法刁广泛地排除病毒.但曾有 报道.当超滤用=PF~X制品时,可排除5log韵 HIV. 层析吸附法越来越多被用于生产新的高 度纯化的治疗髑晶,在高特异性和选择性的 条件下,-层析纯亿法能显着地把传染因子与 治疗性组分分离’在F,砸邦FIX的免疫纯化 过程毕舟别清除4和鼬_韵H?.在对F唧 免疫亲和层析时,可除去犬于4,酏og的病 毒.当帅在DEAE—F妇ctogel上进行离子 交换层析时,也有相似的清除系数.用两种 离宁交换剂握纯FIX,可排除6log以上的HIV 1)~4Ag在对免疫措制的FVnI进行AE_ S~i)harosc层析后,可使脑心肌毙病毒(一种 非包膜病毒)障祗’500僻.对Pcc在辛酰肼 - Sepharose4B进行硫朱相互作用层析可以吸 附一些瑚?和N瓶V,但是单靠这种步骤 不足以确保街器的安全性.应用鼠抗体免疫 纯化技术,要求确证糖细胞系和培养液中不 存在任何致病性病毒,并证明纯化过程除掉 并灭活细胞污染物,蛋白和棱酸.因重复使用 后层析介质妁化学性质可以改变,可能改变 病毒的清除程度,所以制造过程中一定要包 含一种有效步骤以灭话病毒例如,免疫纯化 的FV/I~制品,6O干热3O小时,仍可传播丙 型肝炎,逮表明有效病毒灭活和有效的排除 方法必须结合起来,才能确保制品的安全性. 病毒灭活和排除步骤的证实 因凝血因子浓缩物的安全性依赖于制造 望!芏茎些鲞蔓塑 过程,所以必须评价和验证对致病性传染园 子的灭活和排除起作用的主要生产步骤.验 证的目的就是要确定镧造步骤对灭活和排除 不同病毒的效果,还要明确重要的物理和化 学条件以保证操作的可重复性.在赢毒灭活 处理时,影响病毒灭活速率和程度的参数包 括制品的古水量,在千热处理时盐的潜在的 保护作用以及在SD处理过程中蛋白稳定剂 的类型和蛋白浓度.在层桁过程中的一些重 要控翩因素是凝胶装柱的质量,pH,克分子 渗透压浓度,缓冲液和血浆组分的流速以及 凝胶重新处理使用后分离的可重复性.验证 所使用的条件要尽可能接近生产规模. 质量控制和质量保_征 一 171一 每批凝血因子浓缩物都要按照药典要求: 进行一系列试验,包括测定热原(和内毒素) 和同族血凝素滴度,还要证实无抗HIV抗体 和HBsAg~存在无这些病毒标志存在,特 别是在高纯度制品中,仅说明在分段组分中 排除病毒,而不表聩原料血浆未被病毒所污 染.成品中有无HCV~HHIV污染,可用聚合 酶链反应(PCR)方法检嚣4I. 严格控饼生产过程,避盎值离生产工艺 规程是极其重要的.对在缔化过程中已经灭 活的制品,保证在下游操作时不被病毒污染 是至关重要的. [Biotogicals1092;20(2):9197(英文), 何立民译马尔瞻棚一 孽罂{l|具症,, 炎症和HlV功能的帮细胞,因子 挂国Sanof[]Elf生物学研究所的研究人员又发现了一种冉细胞舟索(IL),称为 IL一13,它似具有调节炎症和免疫应答的特性.他们发现,IL-13基因位于5号染色 件长臀,与?蛸陶密切相关.两个基因有20嘶,25面的同源顺序.但是IL一4第 一 十霸l最后一十嗽旋区(IL一4功船的关键部分)几乎与IL一13有相同的同源性. IL一13在体外嚣抑制人外周血单十核细胞(PBMC)经细菌脂多糖(L】略)攻击后 分泌IL--6.IL_6与IL-1~a肿瘤坏死因子(TNF-a)起对异常感染和免 疫应答(如 脓毒病)有加剧作用,从商使研究人员考虑IL一13如用于治疗有可能抑制上述过程. 由于IL一13能在4小时内抑制经LPS攻击的PBMC.~物中的IL-~6,因此它烈B直接 作用于产生IL一6的单个棱细胞.这一新的蛋白质还能减少经LPS攻击的细胞培养 物中的IL—l,TN和IL一8量.因此,研究人员称,II.~l3的作用似为全面阻止 炎性单援因子的台成 然而IL一13对干扰素的产生有一定促进作用,后者能加层珏某些自身免疫性和炎 性疾病,如多发性硬化症.但是研究人员认为,IL:13的抗炎特性烈强于其致炎作 用,故应作为一种炎痉治疗方法. 另外,IL一13能抑制组织培养分化的巨噬细胞产生人类免疫缺陷症病毒(HIV), 它似可刺激产生抗体的B淋巴l细胞最后,IL一13能诱导抗分泌该蛋自的肿瘤细胞的 垒身性免疫力. [BioteehnolNews1993;13(9):6(英文)徐冰摘史久华校] 舶盖Y矗!^0