植物中游离氨基酸的提取、纯化及分析方法

植物中游离氨基酸的提取、纯化及分析方法 植物中游离氨基酸的提取、纯化及分析方法 第28卷第3期 2007年6月 河南科技大学:自然科学版 JournalofHenanUniversityofScienceandTechnology:NaturalScience V01.28No.3 Jun.2007 文章编号:1672—6871(2007)03—0076—04 植物中游离氨基酸的提取,纯化及分析方法 刘荣森,杨虹琦,黄郁维张长水,孔繁伦 (1.河南科技大学林业职业学院,河南洛阳471002;2.湖南农业大学烟草工程中心,湖南长沙410011;3.洛阳广播电 视大学宜阳分校,河南宜阳471600;4.河南科技大学化工与制药学院,河南洛阳471003) 摘要:综述了植物游离氨基酸的提取,纯化以及氨基酸的常用分析方法,包括从植物的烘干样品和鲜样品中提 取,纯化游离氨基酸的方法;氨基酸的分析方法包括平面色谱法,氨基酸自动分析仪法,气相色谱法,反相高效 液相色谱法,高效阴离子色谱一积分脉冲安培法,分析了各种氨基酸分析方法的优缺点. 关键词:植物;游离氨基酸;提取;纯化;分析方法 中图分类号:Q946文献标识码:A 0前言 氨基酸是植物中的一类重要的化合物,是组成蛋白质的基本单位,在植物的氮同化,蛋白质的合成, 抵御病虫害等方面具有重要的作用.分析植物中的游离氨基酸的含量对研究植物中的氮,氨基酸,蛋白 质的代谢及干旱,盐分,病菌对植物的影响以及食用,药用价值都具有十分重要的意义.研究游离氨基 酸含量的变化规律对植物的育种,栽培,施肥具有指导意义. 1植物中游离氨基酸的提取 1.1烘干材料中游离氨基酸的提取 从植物的叶片,叶脉及种子中提取游离氨基酸一般先需要干燥处理,叶片,叶脉要在105,110%杀 青,然后60,80%烘干,粉碎,过40目筛.一些研究者用75%或80%的酒精作溶剂从粉碎原料中 提取氨基酸,也有用蒸馏水作萃取溶剂提取,提取的方法是常温或加热到一定温度(小于IO0~C)用一 定体积分数的萃取溶剂浸泡2,6h,或加热回流20,30min,为了使原料中的游离氨基酸尽可能得以溶 解,提取过程需重复2,3次,然后合并提取液,过滤,蒸发掉乙醇,既得到了氨基酸粗提液.也有人采用 蒸馏水作溶剂超声波提取提取的方法】,或在室温下样品用50%乙醇浸泡微波萃取,然后离心过滤, 若用氨基酸自动分析仪测定氨基酸的含量,常用2%,5%的磺基水杨酸水溶液浸提. 1.2鲜叶片或鲜果肉中游离氨基酸的提取 鲜叶片或鲜果肉一般用10%CH,COOH研磨或匀浆来进行提取?..,但由于鲜叶片或鲜果肉中的蛋 白酶能水解蛋白质,造成游离氨基酸含量升高,故研磨要在冰浴中进行,新鲜材料中的脂,蛋白质,糖等 易被提出,需加入一定的试剂除去.通常用10%三氯乙酸,一定浓度的醋酸铅,磺基水杨酸或95%乙醇 加入过夜沉淀,然后离心或过滤的方法除去蛋白质,用乙酸乙酯或乙醚萃取以除去脂类等. 2游离氨基酸的纯化 从植物中提取的氨基酸粗提液中含有较多的色素,可溶性糖,有机酸及其他杂质,有必要对氨基酸 粗提液进一步进行纯化,以便下一步进行氨基酸含量的测定. 最常用的纯化方法是用732阳离子交换树脂进行纯化…. 732阳离子交换树脂在使用前要进行预处理,用一定浓度的盐酸浸泡树脂24h以上,然后用蒸馏水 漂洗至中性,为的是除去树脂中的杂质,并使其完全转化成氢型阳离子交换树脂,湿法装柱,注意树脂间 不能存有气泡,把氨基酸粗提液经适当浓缩到小体积后,倒人树脂柱中,让其缓慢流人树脂层,当氨基酸 作者简介:刘荣森(1964一),男,河南洛阳人,副教授,硕士生 收稿日期:2006—11—24 第3期刘荣森等:植物中游离氨基酸的提取,纯化及分析方法?77? 粗提液全部进人树脂后,停留10min,以便使氨基酸充分结合到树脂上,接着用一定量的蒸馏水冲洗树 脂,以吸取色素,水溶性糖等杂质,当流出液变清后,用0.5,4mol/L的氨水进行洗脱,收集洗脱液至用 茚三酮检测无色为止.把洗脱液用旋转蒸发仪减压浓缩至干.用0.1mol/L盐酸溶解并定容之一定体 积即可.该方法氨基酸损失少,纯化效果好,故最常用于植物中提取的游离氨基酸的纯化. 也有研究者用活性炭进行纯化,把具有较强吸附能力的活性炭直接加入到氨基酸粗提液中,加热一 段时间,然后过滤,以除去色素等,但活性炭对部分氨基酸也能吸附,造成氨基酸的损失. 也可用C18Sep—Pack柱进行氨基酸的纯化,但价格昂贵. 3游离氨基酸的分析方法 传统的氨基酸分析方法是平面色谱法,而现在已被仪器分析法所取代. 3.1平面色谱法 平面色谱包括纸层析法和薄层层析法,用滤纸为支持物进行层析的方法,称为纸层析法,纸层析 法所用展开剂大多有水和有机溶剂组成,摅纸纤维与水的亲和力强,与有机溶剂的亲和力弱.因此在展 层时,水是固定相,有机溶剂是流动相,将样品点在滤纸上,进行展层,样品中的各种氨基酸在两相溶剂 中不断进行分配,由于它们的分配系数不同,从而将氨基酸分离开来,然后用茚三酮染色,用分光光度计 测定其吸光度,进而计算出各种氨基酸的含量,薄层层析常用的支持物是微晶纤维素,氧化铝,硅胶等, 这些方法在氨基酸的定性方面有一定的优势,若定量分析则灵敏度低,误差较大. 3.2氨基酸自动分析仪法 氨基酸自动分析仪是利用离子交换树脂首先把混合氨基酸进行分离,柱后用水合茚三酮与流出的 氨基酸在一定温度下分别反应,在570nm处测定衍生物吸光度的一种分离,测定游离氨基酸含量的方 法.近几十年来,随着仪器的不断改进与完善,使氨基酸分析仪的自动化程度得到了很大提高,分析时 间从最初的几天到目前的几十分钟,检测极限也从最初的p,mol级提高到pmol级.另一个优势是氨基 酸不用柱前衍生,直接上样进行分析,操作步骤简单,故是迄今氨基酸定性,定量分析中应用最广泛的方 法之一^I1.柱后衍生试剂除茚三酮外,还有可用荧光检测的邻苯二甲醛,使检测灵敏度得以提 高,已达5?10pmo!.我国常用的氨基酸自动分析仪有日立.835—50型,日立.L.8500型,日立.L.8800型, 贝克曼-6300型等,但氨基酸自动分析仪有几个显着缺点:(1)由于仪器结构复杂,造成价格昂贵;(2)离 子交换树脂易压缩,流动相流速的加快不与压力的增加成比例,故测定时间相对较长;(3)氨基酸经离 子交换柱分离,在柱后与水合茚三酮衍生剂混合进行反应,势必造成柱后扩散比较大,峰形变宽,分辨率 降低;(4)有些柱后衍生剂如邻苯二甲醛虽能用灵敏的荧光检测,但不能与亚氨基反应,故不能检测脯 氨酸. 3.3气相色谱法 气相色谱法是用气体流动相(N,He)进行的层析分析方法,是近50年来迅速发展起来的新型分 离,分析技术.具有选择性好,分辨率,灵敏度高,分析速度快等优点,特别是毛细管柱和氢火焰离子化 检测器(FID)的应用,其分辨率和检测灵敏度得到了极大提高.但要求被分析的样品在一196,450~C 温度范围内能够气化,而氨基酸由于含有各种极性基团,在温度低时不能气化,而温度高时又容易分解. 故氨基酸要进行气相色谱分析,首先要把氨基酸衍生为易气化的物质.由于气相色谱法分析样品时的 柱温较高,故要定量制备出适用气相色谱法分析的所有氨基酸的衍生物有一定困难.目前,适用于氨基 酸衍生的衍生试剂还不多?,如三氟丁酸酐一正丁醇,七氟丁酸酐一正丁醇,BSTFA硅烷等,这些衍生 试剂衍生出的氨基酸衍生物虽具有分离度和灵敏度高等优点,但衍生化反应均要求在无水干燥条件下 进行,衍生的每一步都需要红外烘干或氮气吹干,衍生操作复杂,有微量水存在就影响氨基酸的衍生,造 成分析结果误差较大,故目前用于氨基酸分析的相对较少.刘百战等?"用氯甲酸 乙酯作衍生剂进行 氨基酸气相色谱分析,其衍生反应可在水溶液中进行,衍生时间只需几秒钟,整个 气相色谱分离也仅需 二十多分钟. 3.4反相高效液相色谱法 ? 78?河南科技大学:自然科学版2007正 高效液相色谱法的流动相是液体,由于采用了新型高压输液泵,高灵敏度检测器,使其分离速度,分 离效能及检测灵敏度和自动化方面都得到了极大提高,故为氨基酸的分析开辟了新领域.但由于大多 数氨基酸本身无吸色基团,故在分析时需柱前衍生,使氨基酸带上吸色基团或荧光性基团,以便于紫外 或荧光检测.目前,已有许多学者对柱前衍生剂作了研究,提出了许多氨基酸的衍生方法'.迄 今已报道的柱前衍生剂有:邻苯二甲醛(OPA),异硫氰酸苯酯(PITC),氯甲基芴甲酯(FMOC),丹酰氯 (DANSYL—C1),6一氨基喹啉一N一羟基丁二酰亚氨基甲酸酯(AQC),2,4一二硝基氟苯(FDNB)等. 常用柱前氨基酸衍生试剂性能有一定差异,邻苯二甲醛(OPA)不能检测亚氨基酸及胱氨酸,且衍生物 稳定性差,监测极限0.5pmol,一般用于在线衍生,其最大优点是无过量试剂及副产物干扰.氯甲基芴 甲酯(FMOC)可检测亚氨基酸,且衍生物稳定,监测极限也较低(0.5pmo1),可用荧光或紫外检测,缺点 是不能检测胱氨酸,副产物难以去除,对测定有干扰.丹酰氯(DANSYL—C1)即可检测亚氨基酸,又能 检测胱氨酸,衍生物稳定性高,可用于荧光或紫外检测,荧光检测的检测极限是0.5pmol,紫外的检测极 限是2pmol,且无过量试剂或副产物干扰,缺点是紫外检测灵敏度较低.异硫氰酸苯 酯(PITC)可检测 亚氨基酸和胱氨酸,衍生物稳定,一20?可保存一个月,检测极限是lpmol,去除多余衍生剂的方法用真 空干燥法,效果良好,但微量的衍生剂可污染色谱柱,造成柱效降低. 液相色谱法分离测定氨基酸常用反相色谱分析,色谱柱用c..或c.柱,现更常使用的是c..氨基酸 分析专用柱,Waters公司根据不同的衍生试剂开发了氨基酸分析测定方法,如用AQC为柱前衍生剂的 ,配合优化处理后的溶剂洗脱条件及ACCQ.Tag法,以PITC为衍生剂的Pico.Tag法 氨基酸专用分析柱, 使氨基酸在20min内得到高效分离,灵敏度可达0.5—1pmol级,一,二级氨基酸都能测定,分析时间 短,衍生操作简单,仪器价格适中等优点,得到越来越广泛的应用.但由于其流动相使用甲醇,乙腈等有 毒液体,易对环境造成污染,且流动相价格较贵,氨基酸柱前需进行衍生,造成一定误差. 3,5高效阴离子色谱一积分脉冲安培法 高效阴离子色谱一积分脉冲安培法是一种近年来新出现的氨基酸直接分析方法.该方法是 基于氨基酸是弱酸性有机化合物,在强碱性介质中以阴离子形式存在,故可在阴离子交换柱上分离.流 动相由水,氢氧化钠和醋酸钠溶液组成,其中氢氧化钠不仅提供淋洗离子氢氧根离子,而且碱性条件也 是氨基酸在金电极表面进行氧化反应,实现积分脉冲安培检测的必须条件,醋酸根离子对固定相的亲和 力大于氢氧根离子,它对于极性较小,保留较强的氨基酸起"推"的作用.在阴离子交换柱上氨基酸的 洗脱顺序依次为碱性氨基酸,中性氨基酸和酸性氨基酸,然后获得分离的氨基酸到达施加了一定电位的 金电极,则此时氨基酸可在强碱性条件下在金电极表面发生氧化反应,从而实现这些物质的积分脉冲安 培法检测.该方法的最大优点是不用柱前或柱后衍生,消除了由于衍生产生的误差,且操作方便,灵敏 度高,对氨基酸的测定的检测限达到pmol或fmol浓度级,实验过程中不使用有毒的化学试剂,是一种 对环境友好的分析方法. 4结论 氨基酸的分析测定方法各有优缺点,现阶段应用最多的是氨基酸自动分析仪法,发展最快的是液相 色谱法,但由于这两种氨基酸的分析方法都需要柱前或柱后衍生,使得结果有一定的误差,故选择高效 的衍生试剂是未来的发展方向,高效阴离子色谱一积分脉冲安培法由于是直接分析氨基酸,具有分辨率 高,重复性很好,定性定量准确,费用较低等优点,近几年得到了一定的应用,具有光明的发展前景. 参考文献: [1]理克特G,植物代谢一主要代谢的生理和生物化学[M].北京:科学出版社,1985. 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