水稻蜡质基因第一内含子碱基突变引起其RNA二级结构的可能变化

水稻蜡质基因第一内含子碱基突变引起其RNA二级结构的可能变化 水稻蜡质基因第一内含子碱基突变引起其 RNA 二级结构的可能变化 蔡秀玲 王宗阳 邢彦彦 张景六 洪孟民 ( ) 中国科学院上海植物生理研究所 ,上海 200032 摘要 : 通过体外转录得到籼稻品种 232 蜡质基因第一 第一组水稻品种与第二组水稻品种蜡质基因 内含子 5’端 430 bp 的 ssRNA 分子 ,以及在此区域发生 第一 内 含 子 的 核 酸 顺 序 中 有 16 个 碱 基 的 差 异 了自然突变的粳稻品种寒丰蜡质基因第一内含子 5’ () Wang 等 1995,我们推测这 16 个碱基突变可能影 端同样长度的 ssRNA 分子 。部分变性胶电泳结果表明 响了第一内含子的剪接效率和正常剪接位点的使 两种 ssRNA 分子的迁移速率不同 。将两种 ssRNA 分子 用 ,从而使第二组水稻品种蜡质基因可翻译的成熟 的核酸序列用计算机分析 ,表明此两种 ssRNA 分子能 mRNA 总量减少 、蜡质基因的表达量减少 , 因而这 形成不同的茎2环结构 ,自由能值也有差异 。对突变引 些水稻品种直链淀粉含量降低 。内含子的剪接需 起的这些不同与两种水稻品种蜡质基因转录本剪接的 要转录本前体上一些保守顺序和一系列核蛋白的 差异进行了讨论 。 参与 ,在保守顺序中产生剪接供体位点 G 对 T 的 突变会使内含子不剪接或在隐蔽的剪接位点剪接 关键词 : 二级结构 ,第一内含子 ,蜡质基因 ,水稻 而使剪接混乱 ,并降低剪接效率 。 学科分类号 : Q756 在第二组水稻品种蜡质基因第一内含子核酸 顺序与第一组水稻品种中的 16 碱基差异 ,对蜡质 () 水稻蜡质基因 Wx编码结合在淀粉粒上的淀 基因前体 RNA 的二级结构与其稳定性有何影响是 () ( 粉合成酶 Wx 蛋白,负责直链淀粉的合成 Sano 等 值得探讨的问题 。本文对体外转录得到籼稻 ) 1986。我们通过 RT2PCR 方法在蜡质基因的引导 ) ( (品种 232 第一组中的一员和粳稻品种寒丰 第二 ( 顺序 中 鉴 定 出 该 基 因 的 第 1 内 含 子 蔡 秀 玲 等 ) 组中的一员蜡质基因第一内含子 5’端 430 bp 的 ) 1997。在对 31 个水稻品种蜡质基因表达的研究 ssRNA 分子进行部分变性胶电泳和计算机二级结 中 ,观察到它们的转录本有两种类型 ,根据蜡质基 构分析的结果 ,并进行了讨论 。 因转录本 的 不 同 可 以 将 这 31 个 水 稻 品 种 分 成 3 组 。第一组均为高直链淀粉含量的水稻品种 ,它们 1 材料与方法 只产生一种分子长度为 2 . 3 kb 的 Wx 成熟 mRNA , 1. 1 材料 积累 Wx mRNA 和 Wx 蛋白的量也较高 ; 第二组是 限 制 性 内 切 酶 、RNasin 、RNase A 、DNase ? 中等直链淀 粉 含 量 的 水 稻 品 种 , 除 了 产 生 2 . 3 kb () RNase2free连接酶购自 Boehringer 公司 , Taq DNA 的 Wx 成 熟 mRNA 外 , 还 有 一 种 长 度 为 3 . 3 kb 的 聚合酶购自 Promega 公司 ,寡聚核苷酸引物在 AB I Wx 前体 RNA ,它们积累 Wx RNA 以及 Wx 蛋白的 公司 380 型 DNA 合成仪上合成 。 量均较第一组减少许多 ;第三组是不含直链淀粉的 p232i 质粒带有籼稻品种 232 蜡质基因从 + 71糯性水稻品种 ,只产生少量的 3 . 3 kb 的蜡质基因 , + 1396 位的 DNA 片段 ,p6366i 质粒带有粳稻品 前体 RNA , 它们 没 有 Wx 成 熟 mRNA 和 Wx 蛋 白 。 种寒丰蜡质基因从 + 71, + 1393 位的 DNA 片段 。 由此我们推测不同水稻品种中蜡质基因的转录后 1 . 2 聚合酶链式反应 调控 ,尤其是它的引导顺序中第一内含子的剪接效 μμ50 l 的反应总体积中含有 5 l 10 ×PCR 缓冲 ( ) 率影响了水稻中直链淀粉的合成 Wang 等 1995。 () 液KCl 50 mmol/ L , Tris 2HCl p H 8 . 310 mmol/ L , 通过对 RT2PCR 产物顺序的测定表明第二组水稻 μ MgCl1 . 5 mol/ L 、4 l dNTPs 2 . 5 mmol/ L 、50 pmol2 品种蜡质基因第一内含子可利用多个剪接位点 ,使 ( ( ) 上游引物 引物 i 或引物 j 、50 pmol 下游引物 引 2 . 3 kb 的成熟 mRNA 存在多样性 , 这种 5’非翻译 区的顺序差异可能影响 Wx mRNA 的翻译 ; 而第一 1998211212 收到 , 1999204213 接受 。 组水稻品种只存在一种符合 GT2AG 规则的剪接方 ( ) 本工作得到国家自然科学基金资助 项目批准号 39893320。( ) 式 Cai 等 1998。 ( ) ,恒稳状态的 Wx 成熟 mRNA 与 Wx 蛋寒丰品种中 物 r 、适 量 的 DNA 模 板 p232i 或 p6366 i 质 粒 μ( ) ) DNA、1l Taq 聚合酶 1 U、适量的 ddHO , 再加白的量均比高直链淀粉含量的 232 品种中的要低 2 μ 100l 石 蜡 油 。以 下 面 的 条 件 扩 增 30 个 循 环 :许多倍 ,顺序分析指出它们的蜡质基因第一内含子 ( ) 94 ?变性 45 s ,55 ?复性 45 s ,72 ?延伸 1 min 。最 DNA 顺序有 16 个碱基的差异 Wang 等 1995。为 后在 72 ?再延伸 5 min 。反应中所用引物的核苷酸 了弄清这 16 个碱基的差异是否引起了蜡质基因转 录本二级结构的变化 ,必须先得到这两种水稻品种 顺序如下 。 上游引物 i :5’- TAATACGACTCACTATAGGGG 蜡质基因 第 一 内 含 子 中 包 括 这 些 突 变 的 RNA 分 TTCATCAGGAAGAACATCT - 3’, 其中含 有 T7 启 动 子 ,为此我们分别对粳稻品种寒丰和籼稻品种 232 子的顺序和籼稻品种 232 蜡质基因 + 101, + 120 蜡质基因第 一 内 含 子 的 5’端 DNA 片 段 进 行 PCR 位的顺序 。 反应 。为了获得粳稻品种寒丰和籼稻品种 232 蜡 上游引物 j :5’- TAATACGACTCACTATAGGGG 质基因第一内含子 5’端同样长度的 ssRNA 分子 ,TTGTTCATCAGGAAGAACATCT - 3’,其中含有 T7 启 () 我们设计了正向引物 j 和 i ,以及反向引物 r 图 1。 动子的顺序和粳稻品种寒丰蜡质基因 + 98, + 120 引物 i 和引物 r 在籼稻品种 232 蜡质基因 DNA 顺 位的顺序 。 序上经 PCR 扩增获得的 DNA 分子长度为 430 bp 。 - 3’。r :5’- ATGATTTAACGAGAGTTGAA下游引物 而粳稻品种寒丰在此区域内由于碱基突变比籼稻 1 . 3 体外转录反应品种 232 缺少 3 个碱基 ,为此设计引物 j 时向 5’端 μ20l 反应液中 ,含有 20 U RNasin , ATP 、CTP 、 位移了 3 bp 。用引物 j 和引物 r 获得了粳稻品种寒 μμTTP 、GTP 各 20 mmol , 2l 10 ×转录缓冲液 ,5l 上 丰蜡质基因第一内含子 5’端 430 bp 的 DNA 分子 。 述 PCR 产物和 40 U T7 RNA 聚合酶 。在 37 ?反应 所得到的这两段 DNA 片段均进行了核苷酸顺序测 ( ) 2 h 后加 20 U DNase ? RNase2free,37 ?继续温育定 ,其顺序与 基 因 中 相 应 位 置 已 知 的 顺 序 相 ( ) 15 min 。转录反应液用酚/ 氯仿 1?1抽提 1 次 ,用 同 。粳稻品种寒丰和籼稻品种 232 蜡质基因第一 氯化锂2乙醇沉淀 RNA 。这样得到的 ssRNA 即可用 内含子 DNA 顺序有 16 个碱基不同 ,在此 430 bp 的 于聚丙烯酰胺凝胶电泳 。 DNA 区域中包含了其中的 15 个有差异的碱基 。然 2 结果 后对所得到的 DNA 片段进行体外转录以得到相应 的 RNA 分子 。由于我们在正向引物 j 和引物 i 上 2. 1 体外转录获得蜡质基因第一内含子 5’端 ss2 均设计有 T7 启动子 , 因此用 T7 RNA 聚合酶对两 RNA 分子 个扩增获得的 DNA 分子分别进行体外转录 ,即得 粳稻寒丰和籼稻 232 分别是中度直链淀粉含 到了粳稻品种寒丰和籼稻品种 232 蜡质基因第一 量与高度直链淀粉含量的品种 。Northern blot 分析 内含子 5’端同样长度的两种 ssRNA 分子 。 与 Wx 蛋白的电泳分析均表明含中等直链淀粉的 图 1 水稻蜡质基因物理图谱和引物位置 Fig. 1 Physical map of rice waxy gene showing positions of primers A. Boxes represent the exon sequences. Abbreviations for specific sequences are as follows : TSS , transcription start site ; ATG , translation start codon ; TGA , transcription termination codon ; AATAA , polyadenylation site . Restriction sites : S , S al ?; P , Pst ?; Bg , B gl ?; E , EcoR ?; B , B am H ?. B. Positions of primers. 2 . 2 粳稻品种寒丰和籼稻品种 232 蜡质基因第一 我们 将 这 两 种 RNA 分 子 在 不 含 尿 素 或 含 尿 素 4 内含子 RNA 的聚丙烯酰氨凝胶电泳mol/ L 的聚丙烯酰氨凝胶上电泳 ,电泳结果显示 ,两 ( ) 尿素对有二级结构的 RNA 分子是一种有效的 种 ssRNA 分子的迁移率有所不同 图 2。当 将 凝 变性剂 ,当在聚丙烯酰氨凝胶中不断提高尿素浓度 胶中的尿素浓度提高到能使 RNA 分子完全变性的 ( 时 ,RNA 分子中的二级结构会逐步解开 , 当达到 8 8 . 3 mol/ L 时 ,两种 ssRNA 分子迁移距离则相同 图 ) mol/ L 或更高浓度时 , RNA 分子的二级结构将完全 2C。这表明这两种 ssRNA 分子所形成的二级结构 解开 。而具有不同二级结构但长度相同的 RNA 分 存在某种差别 。 子在含中等浓度尿素的聚丙稀酰氨凝胶上电泳时 , 2. 3 两种 ssRNA 分子二级结构的计算机模拟分析它们的移动速率会有差别 。为上述体外转录 在上 述 实 验 的 基 础 上 , 我 们 用 计 算 机 软 件 得到的两种 ssRNA 分子是否存在二级结构的差异 , 进一步推测了这两种ssRNA分子可能的二级结构 。 图 2 两种 ssRNA 分子在含不同浓度尿素的聚丙烯酰氨凝胶上的电泳迁移距离比较 Fig. 2 Comparison of mobility of two ssRNA molecules in native , partial denaturing and completely denaturing polyacrylamide gel () ssRNA molecules were transcribed in vitro and then were dissolved in loading buffer 98 % formamide , EDTA 10 mmol/ L , p H 8. 0and () () () ( ) electrophoresized in a native PAGE without ureaA, a 4 mol/ L urea26 % PAGE B, or a 8. 3 mol/ L urea26 % PAGE Cfor 16 h at the condition of 100 V , 20 ?. 图 3 显示的是它们自由能值最低的一种结构 ,从图电泳的方法来鉴别分子长度相同而个别碱基不同 中可以看出它们都能形成多个茎2环结构 ,但它们 ssRNA 是否有不同的二级结构也获得了较好的 的 的茎2环结构在一定区段有明显差别 。能量计算结 结果 。 ( ) 果显示籼稻品种 232 ssRNA 分子的最稳定二级结 我们前文 Cai 等 1998报告了在第一组水稻 ) ( 构的自由能值为 - 491 . 4 - 1 . 445 kJ / 碱基,而寒 品种的蜡质基因中第一内含子只有一种剪接供体 ) ( 丰品种为 - 445 . 6 - 1 . 310 kJ / 碱基。这一结果提 位点和一种剪接受体位点 ,而在第二组水稻品种蜡 示 ,碱基突变使粳稻品种寒丰蜡质基因第一内含子 质基因中第一内含子存在多种剪接方式 。两种类 的 ssRNA 分子比籼稻品种 232 的较不稳定 。 型水稻蜡质基因第一内含子的 DNA 顺序有 16 个 碱基 的 差 异 。本 文 以 第 一 组 水 稻 品 种 中 的 籼 稻 3 讨论 232 和第二组中的粳稻品种寒丰为材料 ,在体外转 具有相同长度的 ssRNA 分子由于个别碱基不 录出两种水稻品种蜡质基因第一内含子 5’端长度 同能形成不同的二级结构 ,它们在含适当浓度尿素 为 430 bp 的 ssRNA 分子 ,非变性胶和部分变性胶 的聚丙烯酰胺凝胶上电泳时 ,因适当浓度的尿素可 电泳结果均表明两种 ssRNA 分子的二级结构不相 以使这些 RNA 分子保持一定的二级结构 ,引起电 同 。计算机分析结果显示粳稻寒丰和籼稻 232 蜡 泳迁移率不同 。这是鉴别 RNA 分子二级结构的一 质基因第一内含子 5’端的 ssRNA 能形成一些完全 种有效而实用的方法 。曾有研究者用加尿素的部 分变性胶电泳鉴别出爪蟾 5S RNA 基因由于碱基 不同的茎2环结构 ,这与电泳结果相符 。我们推测 ( 突变而有多种不同的二级结构形式 Xing 和 Worcel 粳稻品种寒丰蜡质基因第一内含子 RNA 形成的二 ) 1989。我们用含不同尿素浓度的聚丙烯酰胺凝胶级结构使其剪接供体位点不易与 U1 小核 RNA 等 剪 接因子接触而降低剪接效率或是提供多个剪接 图 3 两种 ssRNA 分子二级结构的可能性分析 Fig. 3 Prediction of possible secondary structure of two ssRNA molecules 位点造成剪接混乱 ,从而使蜡质基因经准确剪接而RNA 量远低于第中寒丰水稻品种蜡质基因的恒态 ( ) 产生的成熟转录本数量减少 ,降低了蜡质基因的表 一组中 232 水 稻 品 种 Wang 等 1995, 因 此 这 种 达水平 。计算机分析还表明粳稻寒丰和 籼 稻 232 RNA 分子本身稳定性差 ,半衰期短 ,这也是使蜡质 蜡质基因第一内含子 5’端的 ssRNA 所形成二级结 基因表达量降低的一个原因 。 构的自由能值也有明显差异 。籼稻品种 232 ssRNA 我们曾报告水稻品种中直链淀粉含量的高低 ( 分子的 最 稳 定 二 级 结 构 的 自 由 能 值 为 - 491 . 4 受蜡 质 基 因 第 一 内 含 子 剪 接 的 调 控 Wang 等( ) ( ) - 1 . 445 kJ / 碱 基 , 而 寒 丰 品 种 为 - 445 . 6 1995。我们已测定了第一组水稻品种 高直链淀 ) ( ) - 1 . 310 kJ / 碱基,这可能反映了粳稻品种寒丰蜡 粉含量中的籼稻 IR36 、籼稻 922103 和第二组水稻 ( ) 品种 中 等 直 链 淀 粉 含 量中 的 籼 稻 IR661 、籼 稻 质基因的 RNA 比籼稻品种 232 的蜡质基因 RNA 更 SMM 、粳稻 QG、粳稻 CG 的蜡质基因第一内含子 5’ 不稳定 。我们以前的定量测定结果也表明第二组 ) () () (Zhang JL 张景六, Hong MM洪孟民1997. A regula2 端 217 bp 的 DNA 顺序 ,结果表明 :前者与籼稻品种 tion2related intron in 5’untranslated region of rice waxy gene . 232 的 完 全 相 同 ; 后 者 也 都 与 粳 稻 品 种 寒 丰 的 一 () ( Acta Phytophysiol Sin 植物生理学报, 23 : 257,261 in 致 ,在相同位置上均有与第一组水稻品种不同的碱 )Chinese ( ) 基差异 Cai 等 1998。这更进一步 表 明 第 二 组 水 ( ) Cai XL , Wang ZY , Xing YY , Zhang JL , Hong MM 1998 . Aberrant splicing of intron 1 leads to the heterogeneous 5’稻品种蜡质基因第一内含子中的碱基突变除了我 UTR and decreased expression of waxy gene in rice cultivars of 们以前指出的剪接供体位点上的 G 到 T 的突变影 () intermediate amylose content . Plant J , 14 4:459,465 () 响正常剪接 Wang 等 1995及在成熟 mRNA 中间另 () Sano Y , Katsamata M , Okuno K 1986. Genetic studies of spe2 ( ) 外产生一个起始密码子 Cai 等 1998使其得不到 ciation in cultivated rice 5. Inter2 and intraspecific differentia2 tion in the waxy gene expression in rice . Euphytico , 35 :1,9 正确的翻译产物外 , 还导致了蜡 质 基 因 前 体 RNA Wang ZY , Zheng FQ , Shen GZ , Gao J P , Snustad DP , Li MG , 的不稳定与在非正常位点进行剪接 ,使能有效翻译 () Zhang JL , Hong MM 1995. The amylose content in rice en2 的成熟 RNA 量减少 ,最终使得直链淀粉的含量降 dosperm is related to the post2transcriptional regulation of the 低 。 waxy gene . Plant J , 7 :613,622 () Xing YY , Worcel A 1989. The C2terminal domain of transcrip2 参 考 文 献 tion factor IIIA interacts differently with different 5S RNA genes. Molecular and Cellular B oil , 9 :499,514) ( ) ( ) (Cai XL 蔡秀玲, Wang ZY王宗阳, Zheng FQ 郑 霏 琴, Alteration of RNA Secondary Structure of Rice Waxy Intron 1 Ca used by Naturally Ocurred Mutations CAI Xiu2Ling WAN G Zong2Yang XIN G Yan2Yan ZHAN G J ing2Liu HON G Meng2Min ( )S hanghai Institute of Plant Physiology , Chinese Academy of Sciences , Shanghai 200032 Abstract : Two 430 nucleotides ssRNAs were the 5’region of the Wx RNA sequence in intron produced in vitro from two 430 bp DNA frag2 1 of cultivar 232 could form a stem2loop struc2 ments containing the 5’part of intron 1 of rice ture , which differs substantially from that of cul2 cultivars 232 and Hanfeng , respectively. Nu2 tivar Hanfeng. The free energy values of the most cleotide sequences of the Wx intron 1 in cultivar stable structures of these two ssRNAs are differ2 ( ) (( ) 232 high amylose contentand Hanfeng inter2 ent , too Fig. 3. Differences in RNA structure ) mediate amylose content differ by sixteen indi2 and splicing patterns of Wx transcript caused by vidual bases. While these two ssRNA molecules the sixteen individual bases mutations are dis2 cussed. were resolved by electrophoresis in partially2de2 natured polyacrylamide gel , showing that they Key words : secondary structure , intron 1 , Wx gene , rice ( ) migrated differently Fig. 2. Computer analysis of the secondary structure of RNA showed that