[doc] 角叉菜胶致大鼠尾部血栓形成的机制

[doc] 角叉菜胶致大鼠尾部血栓形成的机制 角叉菜胶致大鼠尾部血栓形成的机制 ? 542?CHINESEjOURNALOFINFEGRAT1VEMEDICINEONCARDIO /CEREBROVASCUIARDISEASEMay2008Vo1.6No.5 角叉菜胶致大鼠尾部血栓形成的机制D 魏陵博,戎冬梅,吉中强,丁文 摘要:目的揭示角叉菜胶造成大鼠尾部血栓模型的诀窍和机制.将大鼠随机分为正常组,模型组,阿司匹林组,灌胃1 个月.模型组,阿司匹林组用角叉菜胶构建尾部血栓模型,观察不同时间的黑尾长度,检查抗凝血酶?(AT一?)活性,D一二聚体, 白介素一1IL一117),白介素一6(IL一6),肿瘤坏死因子(TNF)的含量.延长灌胃时间至4个月,观察黑尾长度,检测凝血机制 及组织型纤溶酶原激活物(PA1)活性和组织型纤溶酶原激活物的抑制物(t—PA)活性.结果模型组IL一1p值为(32.54?9.26) pg/mL,血浆纤维蛋白原为(4.28?2.06)g/L,血浆凝血酶原时间为(13,12?2.40)s,分别高于正常组;D一二聚体含量低于正常组. 结论只要控制好备件,角叉菜胶是一种简便易行的动物血栓造模试剂. 关键词:角叉菜胶;血栓形成;凝血机制;炎症因子 中图分类号:R285.6文献标识码:A文章编 号:16721349(2008)05—054202 角叉菜胶是从海藻中提取的含硫酸多糖物质,可用于制备 多种组织炎症模型,胡三觉教授发现可以用它造成大鼠尾部血 栓形成模型,认为通过局部炎症与内皮细胞的损坏引起血栓. 本研究旨在对造模的机制进行进一步说明,并研究角又菜胶对 大鼠凝血,抗凝,纤溶系统和炎症因子的影响. 1材料与方法 1.1实验动物选用体重200g?10g的Wistar大鼠,12周 龄,雌雄各半,由山东大学实验动物中心提供.许可证号:SCXR 鲁20030004. 1.2试剂及主要实验仪器肠溶阿司匹林,每片25mg,济南 永宁制药股份有限公司;角叉菜胶(c1013FypeISigma);抗凝血 酶?(AT一?)活性测定试剂盒,D一二聚体含量测定试剂盒,组 织型纤溶酶原激活物(PAI)活性和组织型纤溶酶原激活物的抑 制物(t—PA)活性测定试剂盒,均购自上海太阳生物技术公司. 白介素一1B(IL一1B),白介素6(IL一6),肿瘤坏死因子(,r’NF—) 含量测定免疫试剂盒,购自北京东亚免疫技术研究所. 江苏省医疗电子研究所提供的G~U型全自动放射免疫7 计数器;CA一500血凝仪(北京威士达医疗有限公司);意大利产 全自动酶标仪,BRIO;上海博迅实业有限公司提供的SSW型电 热恒温水槽;上海安亭科学仪器厂提供的DDI一5型冷冻离心 机. 1.3用角叉菜胶制作大鼠尾部血栓模型方法精密称取角叉 菜胶,以生理盐水配成4%浓度;给大鼠称重,乙醚麻醉,于后足 跖部皮下注射角又菜胶,剂量为20mg/kg,造模后将大鼠置于 1812?1?室内饲养,测量大鼠造模24h,48h,72h后大鼠黑 尾长度. 1.4分组灌胃与指标检测36只大鼠随机分为正常组,模型 组,阿司匹g~_ell,各l2只.灌胃1个月,灌胃容积0.0lmL/(g?d), 正常组和模型组予生理盐水灌胃;阿司匹林组将肠溶阿司匹林 以蒸馏水配成2mg/mL溶液,混匀,灌胃剂量20rag/(kg?d),相 当于60成人100mg/d剂量(1.7mg/kg)的12倍.造模成 功并测量黑尾长度后,各组大鼠以戊巴比妥钠麻醉,下腔静脉取 全血,装于试管,分离血清,检测AT,?活性(发色底物法), D二聚体含量(EUSA法)及IL一眠IL一6,TNF—含量(放 免法),由山东中医药大学附属医院核医学室检测. 另将30只大鼠随机分为3组,每组各10只,灌胃4个月, 造模后下腔静脉取全血,分装于两个试管,以枸橼酸钠抗凝,取 全血3mL即查血浆凝血酶原时间(PT),血浆纤维蛋白原(Fb), 凝血酶时间(TT),另取全血2mL分离血浆,备查t—PA,PAI 活性,由山东中医药大学附属医院化验室检测. 1.5统计学处理采用PEMS3.1统计软件统计,用方差分析 及q检验做统计学分析. 2结果 21角叉菜胶对大鼠ATII活性和D一二聚体含量及炎症因 子的影响角叉菜胶能够造成大鼠尾部血栓模型,阿司匹林灌 胃不能减轻血栓形成,角叉菜胶能造成大鼠IL一1B明显升高, D一二聚体降低.详见表1.’ 表1大鼠A1?活性和I)一二聚体含量及炎症因子比较(j!s) 2.2角叉菜胶对延长灌胃阿司匹林大鼠t—PA,PAI及凝血机 制的影响即使延长阿司匹林灌胃也不能减轻角义菜胶导致的 林组动物,rr明显延长因灌胃不当死亡1只,造模操作失当 造成模型组死亡1只,从正常组补齐,故正常组例数为8,查凝 血栓形成,角又菜胶可导致动物PT延长,Fg升高,口服阿司匹血机制时有的标本凝血故造成样本量又有减少. 表2大鼠凝血与纤溶机制指标比较(?s) 1)为山东省中医药科技发展计划基金项目(No2005022) 中西医结合心脑血管病杂志2008年5月第6卷第5期?543? 3讨论 3.1造模要点用角叉菜胶造大鼠尾部血栓模型简便易行,但 是有几点需要注意,首先必须用角叉菜胶TypeI.笔者曾选其 他类型角叉菜胶注射,造模不成功;其次进行后足跖部皮下注射 时最好用乙醚吸入麻醉,如在大鼠清醒时注射,由于动物挣扎可 造成扎伤手指或注射部位过深,甚则动物死亡,在造模时一只大 鼠因用戊巴比妥钠麻醉过深而死亡,而乙醚麻醉则迅速,安全; 再次造模完毕后一定放在20?以下环境中饲养,温度越低出现 黑尾越早,越明显,可能与低温导致血管收缩有关,高于20?则 难以出现血栓形成. 3.2血栓形成机制没有发现阿司匹林口服能减轻角又菜胶 所致的血栓形成,即使长期17:1服也无效_2』,与文献采取的腹腔注 射方式给药报道不一致H』,可能与给药途径不一致有关,至于血 栓形成首先出现在尾部,可能与大鼠尾部血管的解剖有关,鼠尾 是单动脉供血,一旦受到损伤,难以形成侧支循环.胡三觉等… 认为角叉菜胶通过局部血管炎症与内皮细胞的损害引起血栓形 成,对血小板数量,功能及血液黏度无明显影响.本研究发现, 角又菜胶对AT一11I依赖的抗凝活性无影响,佃能使大鼠D一二 聚体降低,降低纤溶功能.D一二聚体为交联纤维蛋白经纤溶 酶降解后所产生的一种特异性的分子标志物,它的升高特异性 地表示体内有血栓形成和纤溶亢进_j』. IL一1是一种激素样蛋白质,为发现最早的细胞因子之一, 是由活化的内皮细胞,平滑肌细胞,淋巴细胞及单核巨噬细胞产 生的,IL,1是参与动脉粥样硬化(AS)过程的一个重要因子_4, 阻断IL一1的效应,可减缓AS的进程.本实验发现,角又菜胶 导致血栓形成后大鼠IL一1t?值明显升高,因此,IL一18通路是 角又菜胶导致血栓形成的机制之一,和IL一6,TNF,a关系不 明显.角叉菜胶导致血栓形成后消耗凝血因子导致Frr延长, 主要影响外源性凝血系统;炎症反应及血栓形成可以反射性地 导致Fg升高;TT延长与纤维蛋白降解产物(FDP)增多有关,提 示阿司匹林组纤溶系统最为亢进,角叉菜胶对PAl活性有增高 趋势,对t—PA活性无明显影响. 只要控制好条件,角叉菜胶是,种简便易行的血栓造模试 剂,其机制为炎症损伤血管内皮细胞,在IL一18作用下,导致炎 细胞趋化,浸润,激活外源性凝血系统,造成血栓形成,并在血栓 形成后抑制纤溶系统,而口服阿司匹林对此血栓形成没有防治 作用. 参考文献: [1]胡三觉,田巧莲,顾建文,等.一种新的体内血栓形成动物模型[J]. 中华血液学杂志,1993.14(1O):541542. [2]丁书文,魏陵博,史红霞,等.白酒对角叉菜胶所致大鼠尾部血栓形 成的影响[J].中国预防医学杂志,2004,5(3):161—163. [3]贺石林,王鸿利.血栓病学[M].北京:科学出版社,1998:57. [4]DinarelloCA.Modalitiesforreducinginterleukinlactivityindisease [J].ImmunolToday,1993,14(6):260—264. 作者简介:魏陵博(1971一),男,毕业于山东中医药大学,主治医师,医学 博士,现工作于山东省青岛市海慈医疗集团(邮编:266033);戎冬梅,吉 中强,工作于山东省青岛市海慈医疗集团;丁书文,工作于山东中医药大 学附属医院. (收稿日期:2008,01—14) (本文编辑王雅洁) 生物检材中盐酸曲马多的气相 色谱和气相色谱/质谱检测D 李勇军,王大利,负克明,尉志文,陈承现,尉洁 摘要:目的建立生物检材中盐酸曲马多的气相色谱和气相色谱/4谱检测方法.方法检材经盐酸酸化后(pH为1,2),氢 氧化钠碱化(pH=14),乙醚萃取,气相色谱/质谱联用法定性,气相色谱内标法定量检测生物检材中盐酸曲马多.结果气相色谱/ 质谱分析曲马多的选择离子m/z为58,263.心血和肝组织中曲马多气相色谱检测的回归方程,线性检测范围,相关系数,回收率, 最低检出浓度分别为Y=4.7954X+0,7461(t,g/mL),(0.5,96)t~g/mL,0.9987,(98.87?1.11)%,0.1/,g/mL和Y=1,1152X+ 1.9334,(0.5,96)/g,0.9955,(99.58?3.47)%,0.1/*g/g.染毒大鼠心血,心,肺,脑,脾,肝,肾和胃中曲马多的含量依次为: 6.98?1.22)/~g/mL,(10.64?3.13)tzg/g,(12.70?9.85)/*g/g,(4.49?0.57)tag/ g,(19.24?8.17)/*g/g,(7.09?2.03)tzg/g, (27.38?19.09)g/g,(104.55?57.31)/*g/g.结论本研究中建立的生物检材中气相色谱/质谱检测方法选择性好,定性准确,气 相色谱检测简便,快速,灵敏,定量结果准确,可用于曲马多中毒的临床快速检验诊断和曲马多中毒死亡案件的法医学鉴定. 关键词:气相色谱法;气相色谱/质谱法;曲马多;生物检材 中图分类号:R962文献标识码:A文章编号:1672—1349(2008)05—0543—03 曲马多(Tramadol,TR)又名曲马朵,为非麻醉性中枢镇痛 药,能缓解各种原因引起的急性中度至重度疼痛,可吸食成 瘾[2,引,剂量较大时容易出现不良反应,中毒或死亡[4-6].已报 告的曲马多检测方法有TLCS法【7,8],HPLC法[9,10,GC法…] 1)为国家十一五科技支撑计划基金项目(No2007BAK26B05) 和GC/MS[1,3]法.但生物组织中曲马多的检测方法报道较 少l4_1.本研究分析建立生物检材中盐酸曲马多的气相色谱 和气相色谱质谱检测方法,为临床曲马多中毒检验诊断和曲马 多中毒死亡的法医学检验提供依据.